LỜI MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Đái tháo đường là một bệnh rối loạn chuyển hóa mãn tính đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết kéo dài dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng trên các động mạch, có thể gây ra các bệnh về võng mạc, bệnh thận, bệnh thần kinh… Theo báo cáo năm 2021 của Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế, có tới 6,7 triệu ca tử vong do bệnh đái tháo đường trên toàn thế giới, đặt gánh nặng không nhỏ lên xã hội. Do đó, quản lý bệnh đái tháo đường và ngăn ngừa các biến chứng của nó đã trở thành mối quan tâm cấp bách của các chuyên gia y tế. Để giảm lượng đường trong máu, các thuốc ức chế α-glucosidase, chẳng hạn như acarbose, miglitol và voglibose được sử dụng để ngăn chặn quá trình tiêu hóa carbohydrate thành đường glucose thông qua ức chế α-glucosidase ở niêm mạc ruột non; tuy nhiên, nhằm đa dạng sản phẩm và thêm nhiều lựa chọn cho người tiêu dùng, nghiên cứu về các chất ức chế α-glucosidase đang được quan tâm hơn. Một số báo cáo cho thấy flavonoid, polyphenol và tannin… có khả năng ức chế hiệu quả hoạt động của enzyme α-glucosidase.
Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh sự ức chế của chalconoid với enzyme này. Chính vì thế, đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 34-difluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất” được chọn để thực hiện nhằm sàng lọc hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase tốt nhất, cung cấp cơ sở cho việc phát triển các loại thuốc mới dùng trong việc chữa bệnh đái tháo đường. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 34-difluorochalconoid, sử dụng acarbose làm chất đối chứng dương. - Xác định hợp chất có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu động học và cơ chế ức chế thông qua đồ thị Lineweaver-Burk, Dixon và đo phổ huỳnh quang của enzyme và phức chất [enzyme-ANS].
xi Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: α-glucosidase, các dẫn xuất 34-difluorochalconoid (*), acarbose. - Phạm vi nghiên cứu: Độ hấp thụ các dung dịch enzyme khi không có và có chất ức chế; đồ thị Lineweaver-Burk, Dixon; phổ huỳnh quang của enzyme và phức chất [enzyme-ANS]. Phương pháp nghiên cứu - Đo độ hấp thụ của dung dịch để xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase bởi các chất ức chế bằng cách sử dụng đầu đọc vi đĩa Elisa. - Đo phổ phát huỳnh quang của α-glucosidase khi không có và có chất ức chế trên máy đo quang phổ Horiba (FluoroMax-4, Horiba).
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: - Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 34- difluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có tiềm năng cao nhất. - Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu về hoạt tính, động học và cơ chế ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 34-difluorochalconoid có vai trò quan trọng trong phát triển thuốc mới dùng trong điều trị bệnh tiểu đường. Cấu trúc luận văn: Luận văn gồm 3 chương Chương 1: Tổng quan Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận (*): Các dẫn xuất được tổng hợp bởi sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Anh và sinh viên Phạm Thị Ngọc Uyên K19 Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh. xii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về enzyme α-glucosidase 1.1 Khái niệm Enzyme α-glucosidase còn có tên gọi khác là maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosido-invertase, α-D-glucosidase, α- glycosidehydrolase, α-1,4-glucosidase, hoặc α-D-glucosideglucohydrolase [1].
Enzyme α-glucosidase là một exohydrolase điển hình [2] xúc tác quá trình thủy phân các liên kết 1,4-α glucoside và thủy phân oligosacaride nhanh chóng so với polysacaride, xúc tác giải phóng α-glucose [3]. Tính chọn lọc chất nền của α-glucosidase là do ái lực của chất nền đối với khoang gắn kết của enzyme [1]. Enzyme α-glucosidase thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), là một lớp các enzyme có khả năng phá vỡ các liên kết glycoside của các polysaccharide phức tạp và thường được đặt tên theo chất nền mà chúng tác dụng (ví dụ: lactase tác dụng với lactose; chitinase tác dụng với chitin, sucrase tác dụng với sucrose, v. Enzyme α-glucosidase tồn tại trong hầu hết các sinh vật.
Ở người, enzyme α-glucosidase được tìm thấy trên màng bề mặt của niêm mạc ruột, tham gia trong giai đoạn cuối của quá trình thủy phân.2 Cấu trúc của enzyme α-glucosidase Các α-glucosidase (AGase) thuộc glycoside họ hydrolase. Có năm họ glycoside hydrolase (GH) trong đó α-glucosidase được phân bố: GH4, GH13, GH31, GH63 và GH97. Họ GH13 và GH31 bao gồm hai loại α-glucosidase chính với các đặc điểm về cấu trúc, chức năng khác nhau. Cấu trúc ba chiều và khả năng nhận biết carbohydrate của các enzyme thuộc họ GH13 đã được nghiên cứu rộng rãi, được biểu diễn ở [Hình 1.
GH13 có cấu trúc tương tự như oligo-1,6-glucosidase (EC 3.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6- α-glucosidase; EC 3. Trong khi các enzyme có đặc điểm rộng rãi nhất trong họ GH31 bao gồm α-xylosidase, 6-α-glucosyltransferase, 3-α- 1 isomaltosyltransferase và α-glucosidase. Chức năng xúc tác của họ enzyme GH31 là chung cho tất cả các thành viên, tức là thủy phân một phần carbohydrate cuối cùng. Tuy nhiên, chúng xúc tác cho một loạt các hoạt động thủy phân do chúng ưa thích các chất nền có kích thước khác nhau từ disaccharide đến các polymer dự trữ lớn như tinh bột và glycogen, được biểu diễn ở [Hình 1.1: Cấu trúc không gian ba chiều của các GH13 Agase: A.
Cấu trúc tổng thể của phức hợp Halomonas sp. α-glucosidase và maltose (PDB, 3WY4); B. Cấu trúc tổng thể của phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose (PDB, 2ZID) Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3D của các GH31 Agase: A. Mô hình cấu trúc của N- terminal maltase-glucoamylase; B.
Vùng hoạt động của N-terminal maltase-glucoamy 2 1.3 Cơ chế hoạt động của enzyme α-glucosidase Tinh bột là nguồn dinh dưỡng thiết yếu chứa carbohydrate chính trong chế độ ăn của con người chúng ta. Do đó trong quá trình tiêu hóa tinh bột, các phân tử carbohydrate sẽ được thủy phân thành những phân tử đường đơn diễn ra trong ruột non dưới tác động của các enzyme tiêu hóa. Cụ thể, enzyme α-amylase ở trong nước bọt hoặc dịch tiết hệ tiêu hóa phá vỡ liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, chuyển đổi chúng thành maltose, maltotriose, v. và cuối cùng, enzyme α-glucosidase tiếp tục thủy phân các loại đường khử này thành những phân tử glucose nhỏ hơn rồi thẩm thấu qua màng tế bào của ruột non vào máu, nơi nó được vận chuyển đến các tế bào trong cơ thể để sử dụng làm năng lượng hoặc được lưu trữ dưới dạng glycogen trong gan và cơ bắp [6].
Vì thế, thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase, ta có thể làm giảm quá trình thủy phân carbohydrate và làm chậm quá trình thẩm thấu glucose vào máu.2 Khái quát về chalcone và hoạt tính sinh học 1.1 Danh pháp hoá học và cấu trúc chalcone Chalcone là một hợp chất ketone thơm, được tạo bởi hai vòng thơm liên kết với nhau thông qua một chuỗi ba carbon gồm nhóm carbonyl và liên kết đôi tại vị trí α, β [7]. Chalcone là tên gọi của một lớp các chất màu xuất hiện trong tự nhiên được cấu thành từ các benzylideneacetophenone. Thuật ngữ “chalcone” được đưa ra lần đầu tiên bởi Kostanecki và Tambor, người đặt nền móng trong việc tổng hợp các hợp chất màu tự nhiên [8]. Một nhóm các hơp chất chalcone có nhiều trong cây thuốc tự nhiên bao gồm rau, trái cây và thực phẩm tự nhiên.
Đồng thời, chalcone cũng là tiền chất chính cho quá trình sinh tổng hợp flavonoid và isoflavonoid. Công thức khung phân tử cơ bản: C15 H12 O. Tên gọi theo danh pháp IUPAC: 1,3-diphenyl-2-propen-1-one. Chalcone có công thức tổng quát như sau: 3 Hình 1.3: Cấu trúc hóa học cơ bản của chalcone Một số tên thay thế của các chalcone: phenyl styryl ketone, benzalacetophenone, α- phenyl-β-benzoylethylene.
Trong tự nhiên, chalcone thường tồn tại ở dạng rắn kết tinh và có thể có nhiều màu sắc khác nhau tùy thuộc vào các nhóm thế gắn liền với hệ thống vòng. Chúng tan tốt trong nhiều loại dung môi hữu cơ như alcohol, acetone, chloroform và dichloromethane. Chúng cũng tan trong dung dịch kiềm và acid, điều này giúp chúng dễ dàng được sử dụng trong các phản ứng hóa học và phân tích. Chalcone có thể tồn tại ở cả dạng đồng phân trans và cis.
Đồng phân trans là ổn định hơn vì đồng phân cis thường kém ổn định do sự chèn ép không gian giữa vòng A và nhóm carbonyl gần nhau [9;10].2 Giới thiệu dẫn xuất của chalcone Chalconoid là một nhóm các dẫn xuất của chalcone, một hợp chất tồn tại tự nhiên được phân bố rộng rãi trong thực vật, xuất hiện không chỉ trong hoa mà còn trong lá, quả, rễ, thân và tất cả các bộ phận khác của cây trồng. Cấu trúc chalconoid thường bao gồm hai vòng benzene, được liên kết với nhau thông qua một hệ thống carbonyl bất bão hòa tại α, β và chứa các nhóm thế R và R' phổ biến như -OH, -OCH3, cũng như có thể tồn tại dưới dạng glycoside trên hai vòng benzene. Các nhóm thế trong các vòng benzene của chalconoid được đánh số theo thứ tự và gọi tên theo danh pháp quốc tế được biểu diễn ở [Hình 1.4: Cấu trúc chung các dẫn xuất của chalconoid 4 Khung cơ bản của chalconoid là khung sườn chalcone, được sử dụng để tổng hợp các dẫn xuất với sự thay đổi của các nhóm thế trên acetophenone và aryl aldehyde. Sự đa dạng này trong cấu trúc cho phép chalconoid tạo ra nhiều dạng phân tử khác nhau, có khả năng mang lại nhiều hoạt tính sinh học và ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực y học, dược phẩm, và nông nghiệp.
Chalconoid là một lĩnh vực nghiên cứu sôi động, với nhiều nỗ lực nhằm hiểu rõ hơn về tính chất và ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau của khoa học và công nghệ [10].3 Hoạt tính sinh học Qua nhiều năm, chalcone đã thu hút được sự chú ý đáng kể do cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp và có nhiều dẫn xuất đa dạng. Các hợp chất này an toàn với nhiều hoạt tính sinh học và dược học được đánh giá cao, bao gồm các hoạt tính kháng oxy hóa [11], kháng viêm, kháng ung thư [12], điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn [13]. Một số dẫn xuất chalcone tổng hợp được biết là có hoạt động ức chế kháng lại béo phì và kháng đái tháo đường mạnh mẽ [14]. Nghiên cứu về các chất ức chế enzyme α-glucosidase (α-glucosidase inhibitor-AGI) là các chất được sử dụng trong phương pháp điều trị làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate và hấp thụ glucose, do đó ổn định mức đường huyết và ngăn ngừa tăng đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường [15].