Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu đang diễn ra trên quy mô toàn cầu dẫn tới tình trạng hạn hán, đặc biệt là hạn mặn ngày càng kéo dài, gây khó khăn lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp. Bên cạnh đó, biến đổi khí hậu cũng khiến diện tích đất sản suất nông nghiệp bị thu hẹp, gia tăng sự suy thoái đất, xói mòn rửa trôi, thường xuyên khan hiếm về nguồn nước. Stress hạn đã trở thành một trở ngại lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng nông nghiệp toàn cầu. Cường độ và mức độ nghiêm trọng của hạn hán được dự đoán sẽ còn gia tăng trong thời gian tới [109].
Vì vậy, việc chọn tạo giống các cây trồng có khả năng chịu hạn nhằm ứng phó với những tác động của biến đổi khí hậu là vấn đề mang tính cấp thiết và thời sự. Đậu tương là một trong những cây nông nghiệp quan trọng trên thế giới, là nguồn cung cấp protein bổ dưỡng với chi phí thấp, được sử dụng làm thức ăn cho con người và gia súc với các sản phẩm đa dạng từ sử dụng trực tiếp hạt thô đến chế biến thành phẩm… Ngoài ra, đậu tương còn giữ vai trò cải tạo đất nông nghiệp do khả năng cố định nitơ trong khí quyển. Tại Việt Nam, cây đậu tương giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng, tuy nhiên, năng suất đậu tương ở Việt Nam còn thấp, diện tích trồng trọt chưa được mở rộng nhiều. Nguyên nhân chính là chưa có giống đậu tương phù hợp, quy mô sản xuất nhỏ lẻ và điều kiện thời tiết không thuận lợi.
Cây đậu tương tuy có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Đậu tương dễ bị tổn thương bởi các stress phi sinh học và hạn là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lượng đậu tương. Những ảnh hưởng nổi bật nhất của hạn là giảm khả năng nảy mầm, cây sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, giảm quang hợp, giảm khả năng hút khoáng. Trong bối cảnh hiện nay, vấn đề nâng cao khả năng chịu hạn ở cây đậu tương để giảm thiểu thiệt hại ` 2 năng suất trong điều kiện môi trường thiếu nước là nhiệm vụ cấp bách của các nhà chọn giống cây trồng nông nghiệp.
Trên thế giới, việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã được quan tâm nghiên cứu với nhiều hướng tiếp cận khác nhau, như sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại. Trong đó, những hiểu biết và tiến bộ của các kỹ thuật chuyển gen hiện nay đã mở ra triển vọng lớn trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây đậu tương. Đối với thực vật, đặc tính chịu hạn là tính trạng số lượng phức tạp, chịu ảnh hưởng của một hệ thống các gen mục tiêu cũng như sự chi phối của các yếu tố môi trường, vật lý và hoá học. Sản phẩm của các gen này tác động trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc điều hòa chức năng nhóm gen chịu hạn, như kiểm soát sự đóng mở khí khổng, giảm nồng độ ROS (reactive oxygen species), tăng cường phát triển bộ rễ, điều chỉnh thẩm thấu, bảo vệ tính toàn vẹn của màng, ổn định cấu trúc enzyme hoặc protein… [68].
Khi gặp điều kiện khô hạn, thực vật thường có xu hướng tăng cường tổng hợp, tích luỹ các chất chuyển hoá như các loại đường tan, amino acid… để điều chỉnh áp suất thẩm thấu cho tế bào. Vì vậy, một trong các hướng nghiên cứu tiếp cận cơ chế chống chịu hạn hiện nay chính là làm gia tăng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nước. Trong đó, glycine betaine (GB) là một trong những chất bảo vệ thẩm thấu được nghiên cứu rộng rãi nhất. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, GB là chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi.
Nhiều loại gen đã được sử dụng để tạo ra cây chuyển gen có sự tăng tích lũy GB đã cho thấy sự hiệu quả trong việc tăng cường khả năng chịu đựng các stress phi sinh học và tăng năng suất. Một số cây trồng chuyển gen mã hoá enzyme liên quan đến sinh tổng hợp GB cũng thể hiện khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như chịu nóng [175]; chịu lạnh [134]; chịu hạn [171] và chịu mặn [160]. ` 3 Trong số các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau, con đường sinh tổng hợp GB từ tiền chất choline xúc tác bởi enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA là có hiệu quả và đơn giản nhất. Gen codA đã trở thành mục tiêu nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học đối với kỹ thuật trao đổi chất của các loài thực vật quan trọng về mặt kinh tế để chống chịu stress thẩm thấu [133].
Phương pháp chuyển gen codA từ Arthrobacter globiformis vào các loại cây trồng không tích lũy GB tự nhiên như đậu xanh [21]; khoai tây [38]; cà chua [164]… để nâng cao khả năng chống chịu trong các điều kiện stress phi sinh học khác nhau đã chứng minh sự đơn giản và hiệu quả của phương pháp này. Tại Việt Nam, gen codA mã hoá sinh tổng hợp GB đã được chuyển thành công vào cây xoan [5], [9] và cây thuốc lá [78]; các cây chuyển gen này có khả năng chịu hạn, chịu mặn hơn so với các cây đối chứng không chuyển gen. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen codA liên quan đến sinh tổng hợp GB nhằm nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương giúp cây phát triển tốt hơn, cho năng suất và sản lượng cao hơn trong điều kiện môi trường bất lợi là nghiên cứu mang tính thực tiễn và cần thiết. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.
Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả năng chịu hạn cao hơn cây không chuyển gen. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu tạo cấu trúc chuyển gen mang gen codA trong vector biểu hiện thực vật ` 4 1) Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA. 2) Biến nạp cấu trúc chuyển gen mang gen codA vào mô cây thuốc lá.
Đánh giá hoạt động và biểu hiện gen chuyển codA trên các dòng thuốc lá chuyển gen. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhằm thăm dò hiệu quả chuyển gen codA ở cây đậu tương 1) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phosphinothricin (PPT) đến khả năng tạo chồi từ lá mầm đậu tương. 2) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương. 3) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương.
Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn 1) Biến nạp di truyền và tạo cây đậu tương chuyển gen codA. 2) Phân tích cây đậu tương chuyển gen codA. 3) Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen codA. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam tạo thành công cây đậu tương mang gen codA tăng khả năng chịu hạn so với cây đậu tương không biến nạp.
Luận án là công trình có hệ thống với nội dung được trình bày từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu hiện gen và tạo dòng cây chuyển gen codA có hàm lượng GB tích luỹ cao. Cụ thể là: 1) Đã xác định được các yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA và tạo đa chồi ở giống đậu tương ĐT22. Nồng độ PPT 3 mg/l ở giai đoạn cảm ứng tạo chồi trong môi trường SIM và nồng độ PPT 1,5 mg/l ở giai đoạn kéo dài chồi trong môi trường SEM; dịch khuẩn có giá trị OD650= 0,6, thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng ` 5 nuôi cấy 5 ngày trong tối và diệt khuẩn bằng cefotaxime 500 mg/l là thích hợp cho cảm ứng tạo chồi và kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc. 2) Lần đầu tiên gen codA được chuyển thành công và biểu hiện ở cây đậu tương Việt Nam.
Sự biểu hiện của gen chuyển codA trong cây đậu tương chuyển gen đã làm tăng hàm lượng GB, proline, tăng hoạt độ của POD, giảm hàm lượng MDA so với cây cây đậu tương không chuyển gen. 3) Bốn dòng đậu tương chuyển gen codA ở thế hệ T1 đã được đánh giá, hàm lượng GB ở dòng đậu tương chuyển gen tăng từ 248,9% - 288,3% so với cây không chuyển gen; hàm lượng proline tăng 1,5 - 2 lần, hoạt động của POD tăng lên gấp 4 lần và hàm lượng MDA giảm 0,5 lần so với cây không chuyển gen. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả nghiên cứu đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu các stress phi sinh học của cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. Về mặt khoa học, kết quả của luận án đã chứng minh được sự tăng cường biểu hiện gen codA mã hóa enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp GB đã làm tăng khả năng chống chịu hạn ở cây đậu tương.
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để cải thiện khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở thực vật nói chung và cây họ đậu nói riêng bằng kỹ thuật biểu hiện gen. Kết quả đăng tải trên các bài báo khoa học là tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ nghiên cứu và giảng dạy sinh học. Về mặt thực tiễn, các dòng đậu tương chuyển gen codA có thể được sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, đáp ứng một phần nhu cầu đậu tương đang thiếu trong nước hiện nay.
