Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase htert

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen htert, ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học, mở ra hướng đi mới cho điều trị bệnh.

• Tác giả: Hoàng Thị Ngà
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ khoa học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase
• 1.2. Giới thiệu chung telomere ở người
• 1.3. Hoạt động telomerase ở người
• 1.4. Tình hình nghiên cứu hTERT
• 1.5. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT
• 1.6. Tổng quan về chitosan
• 1.6.1. Giới thiệu chung chitosan
• 1.6.2. Ứng dụng của chitosan
• 1.6.3. Giới thiệu chung về nano chitosan
• 1.6.4. Chitosan, chất mang dẫn truyền gen
• 1.6.5. Các phương pháp tạo nano chitosan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Môi trường và dung dịch
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3
• 2.3.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.3.4. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.3.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli
• 2.3.6. Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp gen mã hóa hTERT
• 2.3.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
• 2.3.9. Phương pháp tạo hạt nano chitosan
• 2.3.10. Phương pháp tạo phức hệ nano chitosan/vector mang hTERT
• 2.3.11. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM)
• 2.3.12. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta
• 2.3.13. Phương pháp xác định hiệu quả đóng gói
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế vector pcDNA3. Tổng hợp đoạn gen hTERT
• 3.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI
• 3.3. Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT
• 3.4. Xác định trình tự đoạn gen hTERT trong plasmid tái tổ hợp
• 3.5. Kết quả tạo hạt nano chitosan
• 3.6. Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình
• 3.7. Tạo hạt nano chitosan/TPP
• 3.8. Kết quả tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT
• 3.9. Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3
• 3.10. Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế tạo nano chitosan mang gen hTERT

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT đang thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực y học hiện đại. Chitosan, một polymer tự nhiên, có khả năng tạo ra các hạt nano với kích thước nhỏ, giúp cải thiện khả năng vận chuyển gen vào tế bào. Gen hTERT, một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của tế bào ung thư, có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn. Việc kết hợp giữa chitosan và hTERT mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển vaccine DNA và các liệu pháp miễn dịch mới.

1.1. Giới thiệu về chitosan và ứng dụng trong y học

Chitosan là một polysaccharide tự nhiên được chiết xuất từ vỏ tôm, cua. Với tính chất sinh học tốt, chitosan được sử dụng rộng rãi trong y học như một chất mang thuốc, giúp cải thiện khả năng hấp thu và giảm thiểu tác dụng phụ. Nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng tạo phức hợp với DNA, giúp bảo vệ và vận chuyển gen vào tế bào một cách hiệu quả.

1.2. Tầm quan trọng của gen hTERT trong nghiên cứu ung thư

Gen hTERT mã hóa cho enzyme telomerase, có vai trò quan trọng trong việc duy trì chiều dài telomere của nhiễm sắc thể. Hoạt động của hTERT thường thấy ở các tế bào ung thư, giúp chúng phân chia vô hạn. Việc nghiên cứu và phát triển vaccine DNA mang gen hTERT có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư, giúp kích thích hệ miễn dịch chống lại tế bào ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nano chitosan mang gen hTERT

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là khả năng ổn định của phức hợp trong môi trường sinh học. Chitosan có thể bị phân hủy bởi các enzyme trong cơ thể, làm giảm hiệu quả của việc vận chuyển gen. Hơn nữa, việc tối ưu hóa kích thước và hình dạng của hạt nano cũng là một yếu tố quan trọng để đảm bảo khả năng thâm nhập vào tế bào.

2.1. Thách thức trong việc bảo vệ DNA khỏi phân hủy

DNA mang gen hTERT cần được bảo vệ khỏi sự phân hủy của các enzyme nuclease trong cơ thể. Chitosan có khả năng tạo phức hợp với DNA, nhưng cần phải tối ưu hóa điều kiện để đảm bảo rằng phức hợp này không bị phân hủy trước khi đến được tế bào đích.

2.2. Cần thiết phải tối ưu hóa kích thước hạt nano

Kích thước của hạt nano chitosan ảnh hưởng lớn đến khả năng thâm nhập vào tế bào. Hạt nano quá lớn có thể không thể đi qua màng tế bào, trong khi hạt quá nhỏ có thể không đủ khả năng bảo vệ DNA. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa kích thước hạt nano là rất cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc vận chuyển gen.

III. Phương pháp chế tạo nano chitosan mang gen hTERT hiệu quả

Để chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT, nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu. Một trong những phương pháp phổ biến là sử dụng phương pháp điện di để tạo ra các hạt nano có kích thước đồng nhất. Ngoài ra, việc sử dụng các chất phụ gia như tripolyphosphate (TPP) cũng giúp cải thiện khả năng tạo phức hợp giữa chitosan và DNA.

3.1. Phương pháp điện di trong chế tạo hạt nano

Phương pháp điện di cho phép tạo ra các hạt nano chitosan với kích thước đồng nhất và kiểm soát được hình dạng của hạt. Quá trình này giúp tăng cường khả năng tương tác giữa chitosan và DNA, từ đó nâng cao hiệu quả vận chuyển gen vào tế bào.

3.2. Sử dụng tripolyphosphate để cải thiện tính chất hạt nano

Tripolyphosphate (TPP) được sử dụng như một chất phụ gia trong quá trình tạo hạt nano chitosan. TPP giúp tạo ra các liên kết ion với chitosan, từ đó cải thiện khả năng tạo phức hợp với DNA và tăng cường độ ổn định của hạt nano trong môi trường sinh học.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nano chitosan mang gen hTERT trong điều trị ung thư

Phức hệ nano chitosan mang gen hTERT có nhiều ứng dụng tiềm năng trong điều trị ung thư. Việc sử dụng vaccine DNA mang gen hTERT có thể giúp kích thích hệ miễn dịch, tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ chống lại tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tiêm vaccine này có thể làm giảm kích thước khối u và cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân.

4.1. Kết quả nghiên cứu lâm sàng về vaccine DNA hTERT

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng vaccine DNA mang gen hTERT có thể tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ, giúp tiêu diệt tế bào ung thư. Các thử nghiệm trên động vật và người cho thấy vaccine này có thể làm giảm kích thước khối u và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

4.2. Triển vọng trong phát triển liệu pháp miễn dịch mới

Việc kết hợp giữa nano chitosan và gen hTERT mở ra triển vọng mới trong phát triển liệu pháp miễn dịch. Các nghiên cứu tiếp theo có thể giúp tối ưu hóa công thức vaccine, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị ung thư và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu nano chitosan mang gen hTERT

Nghiên cứu chế tạo nano chitosan mang gen hTERT đang mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị ung thư. Mặc dù còn nhiều thách thức cần vượt qua, nhưng tiềm năng ứng dụng của công nghệ này là rất lớn. Trong tương lai, việc phát triển các phương pháp chế tạo hiệu quả hơn và tối ưu hóa công thức vaccine sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và mang lại hy vọng cho nhiều bệnh nhân.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chế tạo nano chitosan và cải thiện khả năng vận chuyển gen. Việc nghiên cứu thêm về các chất phụ gia và phương pháp chế tạo mới cũng sẽ giúp nâng cao hiệu quả của phức hệ nano chitosan mang gen hTERT.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong điều trị ung thư

Nghiên cứu chế tạo nano chitosan mang gen hTERT không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển vaccine DNA mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư. Việc ứng dụng công nghệ nano trong y học có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện vẫn là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu, với hơn 85% các khối u ác tính ở người có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme telomerase reverse transcriptase (hTERT). Trong khi các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường mang tính tạm thời, dễ gây độc tính toàn thân và phá hủy mô lành, liệu pháp miễn dịch sử dụng vaccine DNA nổi lên như một hướng tiếp cận đột phá. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất của vaccine DNA là các phân tử DNA trần rất dễ bị phân hủy bởi enzyme nuclease nội sinh và có hiệu suất thâm nhập qua màng tế bào tương đối thấp.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, đề tài tập trung giải quyết vấn đề bảo vệ và nâng cao hiệu quả phân phối gen bằng cách chế tạo hệ dẫn truyền nano polymer tự nhiên. Mục tiêu cụ thể của luận văn là thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3.1(+) mang đoạn gen mã hóa epitope GV1001 (gồm 16 axit amin: EARPALLTSRLRFIPK) của kháng nguyên hTERT, đồng thời tạo phức hệ bao gói plasmid DNA này trong hạt nano chitosan/tripolyphosphate (TPP) đạt kích thước tiêu chuẩn dưới 200 nm.

Nghiên cứu được thực hiện vào năm 2013 tại Phòng Công nghệ tế bào động vật thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp cùng Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả đạt được mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc: tái tổ hợp thành công đoạn gen với độ tương đồng trình tự đạt 100% so với dữ liệu quốc tế, đồng thời hạt nano chitosan chứng minh khả năng bảo vệ nguyên vẹn 100% plasmid DNA trước tác động phân hủy của enzyme DNase I, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển vaccine nano DNA thế hệ mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu xây dựng trên nền tảng ba khung lý thuyết và cơ chế phân tử then chốt:

• Lý thuyết về Telomere và cơ chế bất tử hóa của Telomerase: Nhiễm sắc thể người được bảo vệ ở hai đầu mút bởi cấu trúc telomere chứa chuỗi lặp lại TTAGGG dài từ 5.000 đến 15.000 base. Sau mỗi chu kỳ phân bào, telomere bị rút ngắn khoảng 50 đến 100 cặp base, dẫn đến hiện tượng lão hóa tế bào sau 50 đến 70 lần phân chia. Phức hệ ribonucleoprotein telomerase, đặc biệt là tiểu phần xúc tác phiên mã ngược hTERT, tái tổng hợp các đoạn telomere bị mất, giúp hơn 85% dòng tế bào ung thư duy trì khả năng phân chia vô hạn. Do hTERT hầu như không hoạt động ở tế bào soma bình thường, đây là kháng nguyên lý tưởng cho liệu pháp miễn dịch đích.
• Cơ chế kích hoạt miễn dịch của Vaccine DNA và Epitope GV1001: Vaccine DNA đưa plasmid mang gen kháng nguyên vào tế bào để tự sinh tổng hợp protein nội sinh. Peptide GV1001 (tương ứng đoạn 611-626 của protein hTERT) có khả năng gắn kết mạnh mẽ với cả thụ thể HLA lớp I và HLA lớp II trên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên (APC). Cơ chế này kích hoạt đồng thời tế bào lympho T hỗ trợ CD4+ và tế bào lympho T gây độc tế bào CD8+, tạo phản ứng miễn dịch bền vững đã được ghi nhận ở 50% đến 80% bệnh nhân trong các thử nghiệm lâm sàng.
• Lý thuyết tạo hạt polymer bằng phương pháp Gel hóa ion (Ionic Gelation): Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin với các liên kết β(1-4) D-glucosamine. Ở môi trường acid loãng có độ pH dưới 6,3, các nhóm amin (-NH2) bị proton hóa thành dạng tích điện dương (-NH3+), dễ dàng tạo liên kết tĩnh điện với các polyanion như tripolyphosphate (TPP) hoặc khung phosphate tích điện âm của chuỗi xoắn kép DNA, hình thành nên các hạt nano phân phối gen ổn định.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu bao gồm đoạn gen tổng hợp nhân tạo mã hóa epitope GV1001, vector biểu hiện pcDNA3.1(+) kích thước 5,4 kb mang promoter CMV mạnh, chủng vi khuẩn chủ Escherichia coli DH5α, cùng chitosan phân tử lượng trung bình 400 kDa. Quá trình chọn mẫu thực nghiệm được tiến hành bằng việc sàng lọc 4 dòng khuẩn lạc độc lập trên môi trường chọn lọc chứa 50 µg/mL kháng sinh ampicillin để phân tích đối chiếu.

Hệ thống phương pháp phân tích chuyên sâu được lựa chọn dựa trên các tiêu chuẩn sinh học phân tử và hóa lý nghiêm ngặt:

• Kỹ thuật dòng hóa và giải trình tự gen: Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI, XbaI, EcoRI kết hợp enzyme gắn T4 DNA ligase. Trình tự nucleotide được kiểm chứng bằng phương pháp Sanger cải tiến với mồi T7F trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100.
• Kỹ thuật hạ phân tử lượng và chế tạo hạt nano: Chitosan 400 kDa được cắt mạch bằng NaNO2 nồng độ 7 mg/mL, thẩm tích qua màng có kích thước lỗ 12 kDa trong 24 giờ và đông khô 10 đến 12 giờ để thu chitosan phân tử lượng thấp. Hạt nano được tổng hợp bằng phương pháp gel hóa ion ở tỷ lệ thể tích dung dịch chitosan 0,5% và TPP 0,25% là 6:1 dưới điều kiện khuấy từ liên tục.
• Kỹ thuật đặc trưng hóa lý và đánh giá độ bền: Đo kích thước hạt và thế zeta bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer Nano; phân tích hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM Hitachi S-4800 (dải phóng đại từ x25 đến x800.000); đánh giá độ sạch quang phổ qua tỷ số A260/A280 trên máy NanoDrop và kiểm tra khả năng bảo vệ plasmid DNA trước enzyme DNase I ở 37°C trong 15 phút bằng điện di trên gel agarose 1%.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện thực nghiệm quan trọng:

• Tái tổ hợp thành công vector biểu hiện pcDNA3.1(+)/hTERT: Đoạn gen tổng hợp mã hóa epitope GV1001 cùng các cấu trúc bổ trợ (bộ ba mở đầu ATG, bộ ba kết thúc TAA, đuôi 6x Histidine phục vụ tinh sạch) đã được chèn chính xác vào khung đọc mở của vector pcDNA3.1(+) kích thước 5,4 kb. Thử nghiệm cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI cho thấy 3 trong số 4 dòng khuẩn lạc khảo sát (đạt tỷ lệ 75%) duy trì cấu trúc vòng khép kín đặc trưng của plasmid tái tổ hợp.
• Độ tương đồng trình tự nucleotide đạt độ chính xác tuyệt đối: Kết quả phân tích điện sắc ký và so đối chiếu với ngân hàng gen quốc tế qua công cụ BLAST xác nhận đoạn gen gắn vào vector có độ tương đồng 100% với trình tự mã hóa chuỗi peptide EARPALLTSRLRFIPK của hTERT (mã số GenBank: AB085628). Độ tinh sạch của chế phẩm DNA thu được đạt tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng tối ưu từ 1,8 đến 2,0.
• Tổng hợp thành công hệ hạt nano chitosan/TPP đồng nhất: Sau quá trình phân cắt mạch từ chitosan 400 kDa, dung dịch chitosan phân tử lượng thấp phản ứng với TPP theo tỷ lệ 6:1 đã tạo ra các hạt nano có kích thước trung bình phân bố đều đặn dưới ngưỡng 200 nm. Phức hệ nano chitosan/plasmid DNA hình thành ổn định nhờ tương tác tĩnh điện mạnh mẽ giữa các nhóm tích điện trái dấu.
• Khả năng bao bọc và bảo vệ toàn vẹn DNA plasmid: Phân tích thế zeta của hệ keo ghi nhận giá trị điện thế bề mặt luôn duy trì mức dương cao vượt ngưỡng +30 mV, tạo lực đẩy tĩnh điện ngăn chặn hiện tượng tụ tập hạt. Đặc biệt, khi ủ phức hệ với enzyme phân hủy nuclease DNase I ở 37°C trong 15 phút, plasmid DNA được bao gói bên trong hạt nano hoàn toàn không bị thủy phân, trong khi mẫu plasmid DNA trần đối chứng bị cắt vụn và phân hủy toàn bộ 100%.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm được minh chứng rõ ràng thông qua hệ thống dữ liệu trực quan:

• Biểu diễn dữ liệu qua biểu đồ và hình ảnh: Đồ thị phân bố kích thước hạt DLS thể hiện đường cong đơn đỉnh với chỉ số phân tán đa dạng (PDI) ở mức thấp, phản ánh độ đồng nhất cao của hệ phân tán. Ảnh chụp FE-SEM khẳng định các hạt nano chitosan-DNA có cấu trúc hình cầu hoàn chỉnh, phân tán rời rạc và không có dấu hiệu kết tụ mảng. Bản ảnh điện di trên gel agarose 1% minh chứng rõ rệt sự hiện diện của vạch DNA nguyên vẹn tại giếng nạp của phức hệ sau xử lý DNase I, đối lập hoàn toàn với nền gel trống của mẫu DNA trần.
• Cơ chế sinh học và so sánh học thuật: Kích thước hạt nano dưới 200 nm mang ý nghĩa quyết định khi đưa vào hệ tuần hoàn. Trong các mô khối u hoặc mô viêm, khoảng cách gian bào nội mô dao động từ 80 nm đến 800 nm; do đó, kích thước hạt này giúp phức hệ dễ dàng thoát mạch và xâm nhập sâu vào khối u thông qua hiệu ứng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR). Đồng thời, hạt nano kích thước nhỏ tạo điều kiện thuận lợi để tế bào bắt giữ qua cơ chế nhập bào (endocytosis), gia tăng đáng kể tốc độ chuyển nạp gen so với các hệ polymer tổng hợp thông thường. Giá trị thế zeta dương lớn hơn +30 mV không chỉ đảm bảo độ bền nhiệt động học cho hệ keo phân tán mà còn thúc đẩy ái lực bám dính vào màng tế bào tích điện âm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và đưa phức hệ nano chitosan mang gen hTERT vào ứng dụng thực tế, các định hướng giải pháp cụ thể được đề xuất:

• Tối ưu hóa thông số tỷ lệ bao gói: Nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Công nghệ tế bào động vật cần mở rộng thử nghiệm tỷ lệ phối trộn giữa chitosan và TPP từ dải 4:1 đến 8:1, đồng thời khảo sát biến thiên nồng độ plasmid DNA nhằm nâng cao hiệu suất đóng gói đạt mức trên 92% trong thời gian 6 đến 12 tháng tới.
• Định lượng mức độ biểu hiện gen trên các dòng tế bào ung thư in vitro: Các chuyên gia sinh học phân tử tại Viện Công nghệ sinh học cần tiến hành thử nghiệm chuyển nạp phức hệ nano vào các dòng tế bào ung thư người (như dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7), đo lường mức độ biểu hiện protein hTERT và đánh giá khả năng hoạt hóa tế bào lympho T CD8+ tăng tối thiểu 40% trong lộ trình 12 đến 18 tháng.
• Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch và an toàn sinh học in vivo: Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh phối hợp cùng các cơ sở y dược thực hiện tiêm chủng vaccine DNA nano trên mô hình chuột mang khối u trong giai đoạn 18 đến 24 tháng, đặt mục tiêu kìm hãm sự phát triển khối u từ 50% đến 70% so với nhóm đối chứng.
• Gắn kết các phối tử hướng đích lên bề mặt nano chitosan: Đội ngũ nghiên cứu công nghệ vật liệu y sinh cần thực hiện biến tính bề mặt hạt nano bằng cách gắn thêm các phân tử đặc hiệu như transferrin hoặc galactose trong vòng 24 tháng, giúp tăng độ nhạy tập trung tại mô ung thư gấp 2 đến 3 lần và giảm thiểu tối đa hiện tượng tích lũy ngoài mục tiêu tại gan và thận.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu cho bốn nhóm đối tượng:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Nắm bắt quy trình thực hành chuẩn hóa về kỹ thuật thiết kế vector biểu hiện pcDNA3.1(+), dòng hóa gen, cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn kép và giải trình tự DNA khẳng định khung đọc mở.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Liệu pháp miễn dịch và Vaccine ung thư: Khai thác cơ sở dữ liệu thực nghiệm về epitope GV1001 của hTERT, cơ chế kích hoạt song song hai nhánh miễn dịch qua phân tử HLA lớp I và lớp II phục vụ phát triển vaccine thế hệ mới.
• Kỹ sư công nghệ nano và vật liệu y sinh: Tham khảo chi tiết phương pháp giáng hóa polymer bằng NaNO2, kỹ thuật gel hóa ion tạo hạt nano chitosan kích thước dưới 200 nm, cùng các phương pháp phân tích hạt tiên tiến bằng FE-SEM, DLS và đo thế zeta.
• Đơn vị nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp dược phẩm: Ứng dụng mô hình hệ dẫn truyền không virus (non-viral vector) có tính tương thích sinh học cao, không độc hại, giá thành sản xuất hợp lý để thay thế cho các vector virus truyền thống.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao lại lựa chọn epitope GV1001 của hTERT làm kháng nguyên mục tiêu?

Epitope GV1001 gồm 16 axit amin (EARPALLTSRLRFIPK) có đặc tính sinh học ưu việt khi gắn kết đồng thời với cả phân tử HLA lớp I và lớp II trên tế bào trình diện kháng nguyên (APC). Cơ chế này kích hoạt đồng thời cả tế bào T hỗ trợ CD4+ và tế bào T gây độc CD8+, tạo đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ được chứng minh an toàn ở 50% đến 80% bệnh nhân ung thư.

Việc hạ phân tử lượng chitosan từ 400 kDa mang lại lợi ích gì?

Chitosan thương mại nguyên bản có phân tử lượng lớn khoảng 400 kDa và độ nhớt cao, rất khó hòa tan và khó kiểm soát kích thước hạt keo. Khi hạ phân tử lượng bằng phản ứng cắt mạch hóa học với NaNO2 7 mg/mL, polymer thu được dễ hòa tan, cho phép tạo các hạt nano đồng nhất dưới 200 nm với khả năng thâm nhập tế bào tối ưu.

Ưu điểm vượt trội của phương pháp gel hóa ion (Ionic Gelation) là gì?

Phương pháp gel hóa ion dựa hoàn toàn trên tương tác tĩnh điện giữa các nhóm cation của chitosan và anion tripolyphosphate (TPP) trong môi trường nước ở điều kiện nhiệt độ phòng. Quy trình này không sử dụng dung môi hữu cơ hay các hóa chất liên kết chéo độc hại như glutaraldehyde, giúp bảo vệ toàn vẹn cấu trúc xoắn kép của DNA.

Làm thế nào để kiểm tra khả năng bảo vệ DNA của hạt nano chitosan?

Khả năng bảo vệ được đánh giá bằng cách ủ phức hệ nano chitosan-plasmid DNA cùng enzyme DNase I ở nhiệt độ 37°C trong 15 phút. Khi chạy điện di trên gel agarose 1%, DNA nằm trong hạt nano được bảo toàn nguyên vẹn 100% cấu trúc, trong khi DNA plasmid trần không có vỏ bọc bị enzyme cắt phân hủy hoàn toàn.

Hệ chất mang nano chitosan có ưu thế gì so với các vector virus truyền thống?

Hệ mang gen nano chitosan có bản chất tự nhiên, tương thích sinh học cao, tự phân hủy và không gây độc tế bào. Khác với vector virus tiềm ẩn nguy cơ gây phản ứng miễn dịch quá mức hoặc đột biến chèn vào bộ gen vật chủ, nano chitosan là vector không virus an toàn tuyệt đối, dễ sản xuất quy mô lớn với chi phí tối ưu.

Kết luận

• Đã thiết kế và tạo dòng thành công vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang epitope GV1001 với độ tương đồng trình tự đạt 100% theo dữ liệu chuẩn GenBank.
• Đã giáng hóa thành công chitosan 400 kDa thành chitosan phân tử lượng thấp và tổng hợp các hạt nano chitosan/TPP kích thước đồng đều dưới 200 nm bằng phương pháp gel hóa ion.
• Đã chế tạo thành công phức hệ nano chitosan mang plasmid DNA với thế zeta dương ổn định (> +30 mV), đảm bảo độ bền keo tối ưu.
• Đã chứng minh hạt nano chitosan có khả năng bảo vệ toàn vẹn 100% plasmid DNA trước sự phân hủy của enzyme nuclease DNase I.
• Xác lập quy trình công nghệ hoàn chỉnh cho hệ dẫn truyền gen không virus, mở ra hướng ứng dụng đầy triển vọng trong phát triển vaccine DNA điều trị ung thư.

Trong lộ trình tiếp theo từ 6 đến 12 tháng, các thử nghiệm chuyển nạp in vitro và đánh giá đáp ứng miễn dịch in vivo sẽ được triển khai mở rộng. Đây là công trình khoa học nền tảng, cung cấp tài liệu tham khảo giá trị cho các nhà nghiên cứu, giảng viên và sinh viên quan tâm đến lĩnh vực công nghệ sinh học và y dược học hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát.

Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không đặc hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh, phá hủy các mô khỏe mạnh. Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch,. Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc nghiên cứu.

Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao. Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc.

Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang.

Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA. Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen.

Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)”. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3. Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan.

Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. - Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn. - Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP.

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase 1. Giới thiệu chung telomere ở người Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, đƣợc gọi là telomere.

Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33], [48]. Ở ngƣời các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base. Telomere có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thoái hóa có hại, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc. Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không thể bám đƣợc vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là các dấu hiệu dẫn đến sự thoái hóa của tế bào.

Ở ngƣời, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia. Vì vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế bào già và chết [37]. Rút ngắn chiều dài telomere thƣờng dẫn đến sự mất ổn định hệ gen, dẫn đến mất kiểm soát chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thƣ. Sự rút ngắn telomere đƣợc nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thƣ của con ngƣời, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến giáp [14], [17], [42], [60], [73].

Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử dụng một enzyme phiên mã ngƣợc gọi là telomerase. Ở các loài, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào. Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 1. Ví dụ NST 17p thƣờng có telomere ngắn hơn so với hầu hết các telomere nhiễm sắc thể khác [58].

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53]. Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, đƣợc gọi là T- loop. Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng không thích hợp gây nguy hại đến DNA, cũng nhƣ hiện tƣợng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tƣợng tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các vùng temomere [26].

- Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh chiều dài telomere. Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch: + POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn DNA phía dƣới vòng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt cặp lại với nhau [56]. + Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tƣơng tác với chúng Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26].

+ Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có vai trò trong việc kiểm soát sự tăng chiều dài telomere thông qua việc tiếp nhận telomerase lên telomere. Ngoài ra, còn có các enzyme khác nhƣ Ku70/80, DNA- PK, Bloom helicase [56], [78], [89]. + Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1), WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối NST với nhau. Ngoài ra, TRF2 còn tƣơng tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27].

Hoạt động telomerase ở người Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối của nhiễm sắc thể. Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thƣờng, nhƣng hoạt động phổ biến trong các dòng tế bào ung thƣ ngƣời và tìm thấy khoảng 85% các khối u [47], [70]. Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ gồm hTR, hTERT.

hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, giúp thêm telomeric Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87]. Cả hai hTR và hTERT đều biểu hiện rất thấp ở tế bào thƣờng. Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin đƣợc mã hóa bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15. Tổ chức gen hTERT có tổ chức nhƣ sau: Hình 1.

Tổ chức gen của hTERT [23] Gen hTERT ở ngƣời gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và đƣợc sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse transcriptase (RT domain). Thành phần RNA của telomerase ngƣời có chừng 451 nucleotide (bao gồm cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28 [30]. Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere. Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật, các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ và di căn [34], [40], [43].

Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng telomere là điều cần thiết cho sự tăng trƣởng bền vững của các tế bào bất tử và hoạt tính này xảy ra ở hầu hết các khối u ác tính [46], [77]. Gen hTERT hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.