Đặt vấn đề Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát.
Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không đặc hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh, phá hủy các mô khỏe mạnh. Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch,. Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc nghiên cứu.
Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao. Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc.
Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sỹ khoa học Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang.
Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA. Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen.
Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)”. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3. Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan.
Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. - Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn. - Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP.
Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sỹ khoa học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase 1. Giới thiệu chung telomere ở người Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, đƣợc gọi là telomere.
Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33], [48]. Ở ngƣời các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base. Telomere có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thoái hóa có hại, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc. Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không thể bám đƣợc vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là các dấu hiệu dẫn đến sự thoái hóa của tế bào.
Ở ngƣời, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia. Vì vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế bào già và chết [37]. Rút ngắn chiều dài telomere thƣờng dẫn đến sự mất ổn định hệ gen, dẫn đến mất kiểm soát chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thƣ. Sự rút ngắn telomere đƣợc nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thƣ của con ngƣời, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến giáp [14], [17], [42], [60], [73].
Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử dụng một enzyme phiên mã ngƣợc gọi là telomerase. Ở các loài, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào. Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 1. Ví dụ NST 17p thƣờng có telomere ngắn hơn so với hầu hết các telomere nhiễm sắc thể khác [58].
Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53]. Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, đƣợc gọi là T- loop. Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng không thích hợp gây nguy hại đến DNA, cũng nhƣ hiện tƣợng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tƣợng tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các vùng temomere [26].
- Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh chiều dài telomere. Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch: + POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn DNA phía dƣới vòng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt cặp lại với nhau [56]. + Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tƣơng tác với chúng Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26].
+ Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có vai trò trong việc kiểm soát sự tăng chiều dài telomere thông qua việc tiếp nhận telomerase lên telomere. Ngoài ra, còn có các enzyme khác nhƣ Ku70/80, DNA- PK, Bloom helicase [56], [78], [89]. + Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1), WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối NST với nhau. Ngoài ra, TRF2 còn tƣơng tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27].
Hoạt động telomerase ở người Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối của nhiễm sắc thể. Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thƣờng, nhƣng hoạt động phổ biến trong các dòng tế bào ung thƣ ngƣời và tìm thấy khoảng 85% các khối u [47], [70]. Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ gồm hTR, hTERT.
hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, giúp thêm telomeric Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sỹ khoa học lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87]. Cả hai hTR và hTERT đều biểu hiện rất thấp ở tế bào thƣờng. Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin đƣợc mã hóa bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15. Tổ chức gen hTERT có tổ chức nhƣ sau: Hình 1.
Tổ chức gen của hTERT [23] Gen hTERT ở ngƣời gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và đƣợc sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse transcriptase (RT domain). Thành phần RNA của telomerase ngƣời có chừng 451 nucleotide (bao gồm cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28 [30]. Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere. Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật, các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ và di căn [34], [40], [43].
Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng telomere là điều cần thiết cho sự tăng trƣởng bền vững của các tế bào bất tử và hoạt tính này xảy ra ở hầu hết các khối u ác tính [46], [77]. Gen hTERT hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.