Luận Văn Thạc Sĩ: Cải Tạo Giống Streptomyces 184 221 Min Nhằm Tăng Khả Năng Sinh Tổng Hợp Kháng Sinh

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184 221 min, ứng dụng trong y học và công nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Tâm
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
• Đề tài: Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.221
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
• 1.2. Phân loại xạ khuẩn
• 1.3. Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221
• 1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
• 1.5. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
• 1.6. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
• 1.7. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
• 1.8. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
• 1.9. Các nghiên cứu liên quan
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng giống Streptomyces 184
• 3.2. Kết quả sàng lọc chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất
• 3.3. Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184
• 3.4. Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết kháng sinh từ dịch lọc
• 3.5. Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh
• 3.6. Chọn môi trường lên men thích hợp
• 3.7. Chọn biến chủng lên men tốt nhất
• 3.8. Chiết xuất và bước đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men
• 3.9. Kết quả sắc ký lớp mỏng
• 3.10. Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột
• 3.11. Kết quả kết tinh
• 3.12. Kết quả phổ
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Cải tạo giống
• 4.2. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Cải tạo giống Streptomyces

Nghiên cứu tập trung vào cải tạo giống Streptomyces để tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Phương pháp đột biến bằng tia UV và hóa chất được áp dụng để nâng cao hiệu suất. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng sinh tăng đáng kể sau đột biến. Điều này khẳng định tiềm năng của giống vi khuẩn Streptomyces trong sản xuất kháng sinh.

1.1. Phương pháp đột biến

Sử dụng tia UV và hóa chất như HNO2 để tạo đột biến. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng sinh tăng 15% với UV và 10% với HNO2. Phương pháp này là bước đầu tiên trong tối ưu hóa sản xuất kháng sinh.

1.2. Bảo quản giống

Giống được bảo quản trong tủ lạnh và định kỳ cấy chuyền. Điều này đảm bảo tính ổn định của giống vi khuẩn Streptomyces trong nghiên cứu và sản xuất.

II. Tăng sinh tổng hợp kháng sinh

Nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh tổng hợp kháng sinh. Nhiệt độ, pH, và thành phần môi trường được tối ưu hóa. Kết quả cho thấy môi trường lên men chìm là hiệu quả nhất. Điều này mở ra hướng mới trong công nghệ sinh học vi sinh.

2.1. Điều kiện lên men

Nhiệt độ tối ưu là 24-32°C, pH trung tính. Môi trường lên men chìm được ưu tiên do hiệu suất cao và dễ kiểm soát. Đây là bước quan trọng trong tối ưu hóa sản xuất kháng sinh.

2.2. Thành phần môi trường

Nguồn carbon và nitơ được lựa chọn cẩn thận. Tinh bột và bột đậu tương là những thành phần chính. Điều này giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ vi khuẩn sản xuất kháng sinh.

III. Ứng dụng Streptomyces trong y học

Nghiên cứu khẳng định vai trò của Streptomyces trong sản xuất kháng sinh. Các kháng sinh như Actinomycin X2 và D được phân lập và nghiên cứu kỹ lưỡng. Điều này mở ra tiềm năng lớn trong ứng dụng Streptomyces trong y học.

3.1. Kháng sinh Actinomycin

Actinomycin X2 và D được phân lập từ Streptomyces. Chúng có cấu trúc phenoxazon và khả năng ức chế tế bào ung thư. Đây là bước tiến quan trọng trong nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces.

3.2. Cơ chế tác dụng

Actinomycin ức chế sao chép DNA, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này làm nổi bật giá trị của kháng sinh từ Streptomyces trong điều trị bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Kháng sinh là một trong những phát hiện quan trọng nhất của y học hiện đại, giúp kiểm soát và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn hiệu quả. Tuy nhiên, sự gia tăng nhanh chóng của vi khuẩn kháng thuốc do sử dụng kháng sinh không đúng cách đã đặt ra thách thức lớn cho ngành dược phẩm. Theo ước tính, khoảng 65% kháng sinh hiện nay có nguồn gốc từ chi xạ khuẩn Streptomyces, một nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại kháng sinh có hoạt tính cao. Trong bối cảnh đó, việc cải tạo giống Streptomyces nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trở thành mục tiêu nghiên cứu cấp thiết.

Luận văn tập trung nghiên cứu cải tạo giống Streptomyces 184.221, phân lập từ mẫu đất Tây Ninh, nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2016, với mục tiêu cụ thể là đột biến chủng Streptomyces 184.221 để tăng hoạt tính kháng sinh, xây dựng điều kiện lên men tối ưu, chiết xuất và tinh chế kháng sinh hiệu quả. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong phát triển nguồn kháng sinh mới, góp phần giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Đặc điểm sinh học của chi Streptomyces: Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng. Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, thường xảy ra ở pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.

• Cơ chế đột biến và cải tạo giống: Sử dụng các tác nhân vật lý (ánh sáng UV) và hóa học (NaNO2) để tạo đột biến, từ đó chọn lọc các biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng cao.

• Phương pháp lên men chìm: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng để tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp kháng sinh, với các biến số như pH, nhiệt độ, thành phần môi trường.

• Kỹ thuật chiết tách và tinh chế kháng sinh: Áp dụng các phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và kết tinh để phân lập và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men.

Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính kháng sinh (HTKS), phương pháp đột biến, môi trường lên men dịch thể, sắc ký phân tích, và các kỹ thuật phổ (UV, IR, MS, NMR) để xác định cấu trúc kháng sinh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Streptomyces 184.221 được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh, cùng với các vi sinh vật kiểm định như Staphylococcus aureus ATCC 1128 và Escherichia coli ATCC 25922.

• Phương pháp chọn mẫu: Sàng lọc 35 dạng chủng từ Streptomyces 184.221 trên môi trường MT2 để chọn chủng có HTKS cao nhất. Tiếp đó, áp dụng đột biến bằng ánh sáng UV và hóa chất để tạo biến chủng, sàng lọc chọn biến chủng có HTKS tăng.

• Phương pháp phân tích: Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và khoanh giấy lọc, đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác 0,02 mm. Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ (ethylacetat, chloroform) ở các pH khác nhau. Tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột với các hệ dung môi khác nhau. Xác định cấu trúc kháng sinh bằng phổ UV, IR, MS và NMR.

• Timeline nghiên cứu: Nuôi cấy và bảo quản giống trong 6-10 ngày, đột biến và sàng lọc trong các giai đoạn tiếp theo, lên men dịch thể trong 120 giờ, chiết tách và tinh chế kháng sinh sau đó.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sàng lọc chủng có HTKS cao nhất: Trong 35 dạng chủng Streptomyces 184.221, chủng số 4 có hoạt tính kháng sinh cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn trên E. coli đạt 20,51 mm (±0,09) và trên S. aureus là 19,35 mm (±0,41).

2. Đột biến bằng ánh sáng UV: Sau đột biến lần 1, biến chủng ĐB1.35 có HTKS tăng 15,43% trên E. coli với đường kính vòng vô khuẩn 23,59 mm (±0,27). Đột biến lần 2 tiếp tục nâng cao HTKS, biến chủng ĐB2.01 đạt 25,63 mm (±0,22), tăng 13,26% so với mẫu chứng.

3. Đột biến hóa học: Biến chủng ĐBHH 11 có HTKS cao nhất, tăng 12,19% trên E. coli với đường kính vòng vô khuẩn 28,22 mm (±0,45), vượt trội so với mẫu chứng 25,15 mm (±0,16).

4. Chọn dung môi và pH chiết kháng sinh: Ethylacetat ở pH 5 cho hiệu quả chiết kháng sinh cao nhất, với đường kính vòng vô khuẩn đạt 23,20 mm (±0,22) trên E. coli, tương đương với chloroform nhưng ít độc hại hơn.

5. Lên men dịch thể: Môi trường MT2dt được chọn là môi trường lên men tối ưu với HTKS đạt 22,61 mm (±0,58) trên E. coli. Biến chủng ĐBHH 11 lên men trong MT2dt cho HTKS cao nhất, đường kính vòng vô khuẩn 25,30 mm (±0,28).

6. Tinh chế kháng sinh: Qua sắc ký cột lần 1, thu được 0,158 g bột kháng sinh tinh khiết với hiệu suất 77,87%. Sắc ký lớp mỏng cho thấy ít nhất 3 thành phần kháng sinh có hoạt tính, với hệ số Rf khác nhau trên 0,2. Các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 tiếp tục cho thấy hoạt tính kháng sinh mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lên đến 26,54 mm (±0,36).

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc áp dụng đột biến nhân tạo bằng ánh sáng UV và hóa chất đã thành công trong việc tạo ra các biến chủng Streptomyces 184.221 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tăng từ 10-15% so với chủng gốc. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cải tạo giống xạ khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh. Việc lựa chọn môi trường lên men MT2dt với thành phần dinh dưỡng tối ưu đã góp phần tăng cường hoạt tính kháng sinh, thể hiện qua các chỉ số HTKS đo được.

Phương pháp chiết xuất bằng ethylacetat ở pH 5 không chỉ đảm bảo hiệu quả chiết cao mà còn giảm thiểu độc tính so với chloroform, phù hợp với yêu cầu sản xuất dược phẩm an toàn. Quá trình tinh chế qua các bước sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột đã giúp phân lập được các thành phần kháng sinh có hoạt tính cao, đồng thời loại bỏ tạp chất không có hoạt tính, nâng cao độ tinh khiết sản phẩm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các biến chủng trước và sau đột biến, cũng như bảng tổng hợp hiệu suất chiết và tinh chế kháng sinh. So sánh với các nghiên cứu tương tự cho thấy kết quả đạt được có tính khả thi và ứng dụng cao trong phát triển kháng sinh mới.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục tối ưu hóa quy trình đột biến: Áp dụng các phương pháp đột biến kết hợp và sàng lọc tự động để tạo ra biến chủng có HTKS cao hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất kháng sinh trong vòng 1-2 năm, do các phòng thí nghiệm vi sinh vật thực hiện.

2. Phát triển quy trình lên men quy mô lớn: Xây dựng và vận hành hệ thống lên men chìm bán liên tục với môi trường MT2dt đã tối ưu, nhằm tăng sản lượng kháng sinh, dự kiến hoàn thành trong 18 tháng, do các nhà máy sản xuất dược phẩm đảm nhiệm.

3. Nghiên cứu sâu về cấu trúc và cơ chế tác dụng kháng sinh: Sử dụng các kỹ thuật phổ hiện đại như NMR, MS để xác định cấu trúc chi tiết và cơ chế tác động của các thành phần kháng sinh thu được, trong vòng 12 tháng, do các viện nghiên cứu chuyên sâu thực hiện.

4. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả in vivo: Tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật để đánh giá độc tính và hiệu quả điều trị, chuẩn bị cho các bước phát triển thuốc lâm sàng, trong vòng 2 năm, do các trung tâm nghiên cứu dược lý và y sinh đảm nhiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh và công nghệ sinh học: Có thể áp dụng phương pháp đột biến và sàng lọc để cải tạo các chủng vi sinh vật khác nhằm tăng sản xuất các hợp chất sinh học có giá trị.

2. Chuyên gia phát triển dược phẩm và công nghệ lên men: Sử dụng kết quả nghiên cứu để thiết kế quy trình lên men và tinh chế kháng sinh quy mô công nghiệp, nâng cao hiệu quả sản xuất.

3. Sinh viên và học viên cao học ngành dược học, vi sinh học: Tham khảo quy trình nghiên cứu khoa học bài bản, từ nuôi cấy, đột biến, lên men đến phân tích và tinh chế sản phẩm.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế: Đánh giá tiềm năng phát triển nguồn kháng sinh mới trong nước, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống kháng thuốc hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Streptomyces 184.221 để nghiên cứu cải tạo giống?
   Streptomyces 184.221 được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh và đã thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt trên môi trường MT2, phù hợp làm đối tượng cải tạo nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.

2. Phương pháp đột biến nào hiệu quả nhất trong nghiên cứu này?
   Đột biến hóa học bằng NaNO2 cho kết quả tăng hoạt tính kháng sinh cao nhất, với biến chủng ĐBHH 11 tăng hơn 12% so với mẫu chứng, đồng thời có độ sống sót phù hợp để tiếp tục nghiên cứu.

3. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các biến chủng?
   Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và khoanh giấy lọc, đo đường kính vòng vô khuẩn trên các vi khuẩn kiểm định như E. coli và S. aureus.

4. Tại sao chọn ethylacetat làm dung môi chiết kháng sinh?
   Ethylacetat ở pH 5 cho hiệu quả chiết kháng sinh tương đương chloroform nhưng ít độc hại hơn, an toàn hơn cho quy trình sản xuất và nghiên cứu tiếp theo.

5. Các bước tiếp theo để phát triển kháng sinh từ nghiên cứu này là gì?
   Tiếp tục tối ưu hóa quy trình lên men quy mô lớn, tinh chế sản phẩm đạt chuẩn dược phẩm, nghiên cứu cơ chế tác dụng và đánh giá an toàn, hiệu quả trên mô hình động vật để chuẩn bị cho phát triển lâm sàng.

Kết luận

• Đã thành công trong việc cải tạo giống Streptomyces 184.221 qua đột biến UV và hóa học, tăng hoạt tính kháng sinh lên đến hơn 12%.
• Môi trường lên men MT2dt được xác định là điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh của biến chủng cải tạo.
• Phương pháp chiết xuất bằng ethylacetat ở pH 5 hiệu quả và an toàn hơn so với chloroform.
• Quá trình tinh chế qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột đã phân lập được các thành phần kháng sinh có hoạt tính cao và độ tinh khiết tốt.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển kháng sinh mới có tiềm năng ứng dụng trong điều trị, cần tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô và đánh giá lâm sàng.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm phối hợp triển khai quy trình sản xuất quy mô lớn và nghiên cứu tiền lâm sàng để phát triển sản phẩm kháng sinh mới từ Streptomyces 184.221 cải tạo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát hiện ra tác dụng của kháng sinh lần đầu tiên của bác sĩ người Anh Alexander Flaming vào tháng 10 năm 1928 là một trong những thành tựu lớn của y học. Kháng sinh trở thành một công cụ hữu hiệu giúp con người chống lại sự tấn công của các loài vi khuẩn nguy hiểm và làm giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh. Song, do bản năng sinh tồn, vi khuẩn luôn tìm mọi cách biến đổi đồng thời với tình trạng sử dụng kháng sinh không đúng cách đã khiến tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc tăng một cách vô cùng nhanh chóng. Chính vì vậy việc tìm ra, phát triển các loại kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả điều trị cao đang là một vấn đề hết sức bức thiết của ngành công nghiệp kháng sinh hiện nay.

Như chúng ta đã biết trong số các kháng sinh được biết đến hiện nay một tỉ lệ lớn đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Bên cạnh đó theo các kết quả điều tra 65% kháng sinh nguồn gốc xạ khuẩn là do chi Streptomyces sản xuất ra.[37] Đó là cơ sở để các nhà khoa học nước ta hiện nay tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này. Tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội chúng tôi đã chọn đề tài : ―Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184. Nội dung của luận văn mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: 1.

Nghiên cứu đột biến để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184. Xây dựng điều kiện lên men, chiết xuất, tách và tinh chế kháng sinh thích hợp. 1 Luan van thac si CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 1.Đặc điểm chung - Hình thái Streptomyces là 1 chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nơi sống của các loài thuộc chi Streptomyces rất đa dạng (đất, thủy vực…).

Chúng thuộc VK thật phát triển dạng sợi phân nhánh là các VK Gr(+), có tỉ lệ G+C>55% .[1], [6], [10], [30] Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khí sinh. + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử.

+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (fa), có gai (sp) hoặc có tóc (fa).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn - Đặc điểm sinh lý: 2 Luan van thac si Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các carbonhydrat làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí.

Nhiệt độ tối thích là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5. [1], [33] - Đặc điểm cấu tạo: Cấu tạo của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất. + Thành tế bào: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20nm. Thành tế bào thuộc nhóm CW I, có chứa L – DAP và glycin.

+ Màng tế bào chất: dày 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin. + Meosome: nằm phía trong tế bào chất hình phiến, bọng hay hình ống.[1] - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [17], [21], [36] Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo ra số lượng lớn các KS ức chế vi khuẩn, vi nấm, các TB ung thư và nguyên sinh vật. Vào tháng 2 năm 2007, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CS684 có khả năng sinh ra KS laidlomycin có khả năng tiêu diệt tụ cầu đã kháng lại methicillin và vancomycin [24].

Vào năm 2009, các tác giả Ấn Độ phân lập mẫu đất nông nghiệp ở Đông Utar Pradesh Ấn Độ được dòng xạ khuẩn Streptomyces có khả năng sản xuất kháng sinh kháng khuẩn và kháng nấm tốt. Phân loại xạ khuẩn Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống 3 Luan van thac si nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%.

Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%. Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi.

Đó là những đặc điểm sau: đường, loại acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo và tỷ lệ GC trong ADN.Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 184.221 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh. Khi nuôi cấy bề mặt chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt trên môi trường MT2 Sau thời gian nuôi cấy trên 7 ngày trên môi trường MT2 chung xạ khuẩn này có các đặc điểm như về hình thái: - Quan sát bằng mắt thường: khuẩn ty khí sinh có màu vàng xám; khuẩn ty cơ chất màu nâu vàng, sắc tố hòa tan màu nâu vàng. - Quan sát dưới kính hiển vi điện tử: chuỗi bào tử ngắn, thường gồm 3 bào tử, dạng chuỗi gãy, đứt vụn; bề mặt bào tử khá nhẵn, có sần sùi ở cạnh. Trong khóa luận của Nguyễn Văn Hà thực hiện năm 2010 tác giả sau khi tiến hành đột biến chủng Streptomyces 184.221 bằng tia UV 254nm thì hoạt tính kháng sinh tăng lên đáng kể (khoảng 15%), sau khi đột biến hóa học bằng HNO2 thì hoạt tính tăng khoảng 10%.

Dung môi hữu cơ được lựa chọn chiết là chloroform tại pH = 7. Tác giả tiến hành tách được một chất tinh khiết từ hỗn hợp kháng sinh thô, hiệu suất tinh chế đạt 8,53%. Chất này đem đi phân tích khối phổ MS cho kết quả là 565,47 đơn vị carbon.2 Một số đặc điểm về kháng sinh Actinomycin X2 và Actinomycin D 4 Luan van thac si Actinomycin D và X2 là hai kháng sinh chromopeptid chống ung thư được phân lập từ rất nhiều loài Streptomyces spp. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra khoảng hơn 30 loại actinomycin, cấu trúc chung của chúng đều chứa hệ thống vòng phenoxazon tạo lên từ màu vàng đến đỏ của kháng sinh.

Các loại actinomycin chỉ khác nhau về cấu trúc chuỗi amino acid.[16] Cơ chế tác dụng Actinomycin ức chế tăng sinh tế bào bằng cách tạo phức bền vững với AND từ đó ngăn cản sự sao chép vào phiên mã AND. Các Actinomycin gây gián đoạn chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn S trong chu trình tế bào và giai đoạn gián phân ức chế miễn dịch.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc Vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất.

Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.Đột biến cải tạo giống Cho các vi sinh vật chịu tác động của các tác nhân gây đột biến mạnh như tác nhân hóa học: dimetylsulfat, ethylenimin, HNO2…, tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X… phần lớn các vi sinh vật bị giết chết. Trong số các cá thể sống sót xuất hiện nhiều dạng đột biến do thay đổi nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng). Kết quả dẫn đến mất 5 Luan van thac si (giảm) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh (đột biến dương tính) [29], [33]. Để cải tạo chủng giống có hiệu suất cao cần tiến hành đột biến bậc thang.

Trong thực tế từ chủng Penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng hợp 60mg/ml sau quá trình đột biến cải tạo giống đã có những biến chủng có khả năng sinh tổng hợp 85000 mg/ml penicillin.Bảo quản giống xạ khuẩn Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ. Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: bảo quản trong tủ lạnh 2-4⁰C(định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn 1.Sự hình thành KS ở xạ khuẩn Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng.

Một số khác lại cho rằng việc hình thành KS giúp cho sự tồn tại của VK trong điều kiện sống khắc nghiệt.