Luận Văn Thạc Sĩ: Cải Tạo Giống Streptomyces 184 221 Min Nhằm Tăng Khả Năng Sinh Tổng Hợp Kháng Sinh

• Tác giả: Nguyễn Thanh Tâm
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
• Đề tài: Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.221
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
• 1.2. Phân loại xạ khuẩn
• 1.3. Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221
• 1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
• 1.5. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
• 1.6. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
• 1.7. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
• 1.8. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
• 1.9. Các nghiên cứu liên quan
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng giống Streptomyces 184
• 3.2. Kết quả sàng lọc chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất
• 3.3. Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184
• 3.4. Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết kháng sinh từ dịch lọc
• 3.5. Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh
• 3.6. Chọn môi trường lên men thích hợp
• 3.7. Chọn biến chủng lên men tốt nhất
• 3.8. Chiết xuất và bước đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men
• 3.9. Kết quả sắc ký lớp mỏng
• 3.10. Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột
• 3.11. Kết quả kết tinh
• 3.12. Kết quả phổ
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Cải tạo giống
• 4.2. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Cải tạo giống Streptomyces

Nghiên cứu tập trung vào cải tạo giống Streptomyces để tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Phương pháp đột biến bằng tia UV và hóa chất được áp dụng để nâng cao hiệu suất. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng sinh tăng đáng kể sau đột biến. Điều này khẳng định tiềm năng của giống vi khuẩn Streptomyces trong sản xuất kháng sinh.

1.1. Phương pháp đột biến

Sử dụng tia UV và hóa chất như HNO2 để tạo đột biến. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng sinh tăng 15% với UV và 10% với HNO2. Phương pháp này là bước đầu tiên trong tối ưu hóa sản xuất kháng sinh.

1.2. Bảo quản giống

Giống được bảo quản trong tủ lạnh và định kỳ cấy chuyền. Điều này đảm bảo tính ổn định của giống vi khuẩn Streptomyces trong nghiên cứu và sản xuất.

II. Tăng sinh tổng hợp kháng sinh

Nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh tổng hợp kháng sinh. Nhiệt độ, pH, và thành phần môi trường được tối ưu hóa. Kết quả cho thấy môi trường lên men chìm là hiệu quả nhất. Điều này mở ra hướng mới trong công nghệ sinh học vi sinh.

2.1. Điều kiện lên men

Nhiệt độ tối ưu là 24-32°C, pH trung tính. Môi trường lên men chìm được ưu tiên do hiệu suất cao và dễ kiểm soát. Đây là bước quan trọng trong tối ưu hóa sản xuất kháng sinh.

2.2. Thành phần môi trường

Nguồn carbon và nitơ được lựa chọn cẩn thận. Tinh bột và bột đậu tương là những thành phần chính. Điều này giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ vi khuẩn sản xuất kháng sinh.

III. Ứng dụng Streptomyces trong y học

Nghiên cứu khẳng định vai trò của Streptomyces trong sản xuất kháng sinh. Các kháng sinh như Actinomycin X2 và D được phân lập và nghiên cứu kỹ lưỡng. Điều này mở ra tiềm năng lớn trong ứng dụng Streptomyces trong y học.

3.1. Kháng sinh Actinomycin

Actinomycin X2 và D được phân lập từ Streptomyces. Chúng có cấu trúc phenoxazon và khả năng ức chế tế bào ung thư. Đây là bước tiến quan trọng trong nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces.

3.2. Cơ chế tác dụng

Actinomycin ức chế sao chép DNA, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này làm nổi bật giá trị của kháng sinh từ Streptomyces trong điều trị bệnh.

Tổng quan nghiên cứu

Kháng sinh là một trong những phát hiện quan trọng nhất của y học hiện đại, giúp kiểm soát và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn hiệu quả. Tuy nhiên, sự gia tăng nhanh chóng của vi khuẩn kháng thuốc do sử dụng kháng sinh không đúng cách đã đặt ra thách thức lớn cho ngành dược phẩm. Theo ước tính, khoảng 65% kháng sinh hiện nay có nguồn gốc từ chi xạ khuẩn Streptomyces, một nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại kháng sinh có hoạt tính cao. Trong bối cảnh đó, việc cải tạo giống Streptomyces nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trở thành mục tiêu nghiên cứu cấp thiết.

Luận văn tập trung nghiên cứu cải tạo giống Streptomyces 184.221, phân lập từ mẫu đất Tây Ninh, nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2016, với mục tiêu cụ thể là đột biến chủng Streptomyces 184.221 để tăng hoạt tính kháng sinh, xây dựng điều kiện lên men tối ưu, chiết xuất và tinh chế kháng sinh hiệu quả. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong phát triển nguồn kháng sinh mới, góp phần giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Đặc điểm sinh học của chi Streptomyces: Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng. Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, thường xảy ra ở pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.

• Cơ chế đột biến và cải tạo giống: Sử dụng các tác nhân vật lý (ánh sáng UV) và hóa học (NaNO2) để tạo đột biến, từ đó chọn lọc các biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng cao.

• Phương pháp lên men chìm: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng để tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp kháng sinh, với các biến số như pH, nhiệt độ, thành phần môi trường.

• Kỹ thuật chiết tách và tinh chế kháng sinh: Áp dụng các phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và kết tinh để phân lập và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men.

Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính kháng sinh (HTKS), phương pháp đột biến, môi trường lên men dịch thể, sắc ký phân tích, và các kỹ thuật phổ (UV, IR, MS, NMR) để xác định cấu trúc kháng sinh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Streptomyces 184.221 được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh, cùng với các vi sinh vật kiểm định như Staphylococcus aureus ATCC 1128 và Escherichia coli ATCC 25922.

• Phương pháp chọn mẫu: Sàng lọc 35 dạng chủng từ Streptomyces 184.221 trên môi trường MT2 để chọn chủng có HTKS cao nhất. Tiếp đó, áp dụng đột biến bằng ánh sáng UV và hóa chất để tạo biến chủng, sàng lọc chọn biến chủng có HTKS tăng.

• Phương pháp phân tích: Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và khoanh giấy lọc, đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác 0,02 mm. Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ (ethylacetat, chloroform) ở các pH khác nhau. Tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột với các hệ dung môi khác nhau. Xác định cấu trúc kháng sinh bằng phổ UV, IR, MS và NMR.

• Timeline nghiên cứu: Nuôi cấy và bảo quản giống trong 6-10 ngày, đột biến và sàng lọc trong các giai đoạn tiếp theo, lên men dịch thể trong 120 giờ, chiết tách và tinh chế kháng sinh sau đó.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sàng lọc chủng có HTKS cao nhất: Trong 35 dạng chủng Streptomyces 184.221, chủng số 4 có hoạt tính kháng sinh cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn trên E. coli đạt 20,51 mm (±0,09) và trên S. aureus là 19,35 mm (±0,41).

2. Đột biến bằng ánh sáng UV: Sau đột biến lần 1, biến chủng ĐB1.35 có HTKS tăng 15,43% trên E. coli với đường kính vòng vô khuẩn 23,59 mm (±0,27). Đột biến lần 2 tiếp tục nâng cao HTKS, biến chủng ĐB2.01 đạt 25,63 mm (±0,22), tăng 13,26% so với mẫu chứng.

3. Đột biến hóa học: Biến chủng ĐBHH 11 có HTKS cao nhất, tăng 12,19% trên E. coli với đường kính vòng vô khuẩn 28,22 mm (±0,45), vượt trội so với mẫu chứng 25,15 mm (±0,16).

4. Chọn dung môi và pH chiết kháng sinh: Ethylacetat ở pH 5 cho hiệu quả chiết kháng sinh cao nhất, với đường kính vòng vô khuẩn đạt 23,20 mm (±0,22) trên E. coli, tương đương với chloroform nhưng ít độc hại hơn.

5. Lên men dịch thể: Môi trường MT2dt được chọn là môi trường lên men tối ưu với HTKS đạt 22,61 mm (±0,58) trên E. coli. Biến chủng ĐBHH 11 lên men trong MT2dt cho HTKS cao nhất, đường kính vòng vô khuẩn 25,30 mm (±0,28).

6. Tinh chế kháng sinh: Qua sắc ký cột lần 1, thu được 0,158 g bột kháng sinh tinh khiết với hiệu suất 77,87%. Sắc ký lớp mỏng cho thấy ít nhất 3 thành phần kháng sinh có hoạt tính, với hệ số Rf khác nhau trên 0,2. Các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 tiếp tục cho thấy hoạt tính kháng sinh mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lên đến 26,54 mm (±0,36).

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc áp dụng đột biến nhân tạo bằng ánh sáng UV và hóa chất đã thành công trong việc tạo ra các biến chủng Streptomyces 184.221 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tăng từ 10-15% so với chủng gốc. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cải tạo giống xạ khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh. Việc lựa chọn môi trường lên men MT2dt với thành phần dinh dưỡng tối ưu đã góp phần tăng cường hoạt tính kháng sinh, thể hiện qua các chỉ số HTKS đo được.

Phương pháp chiết xuất bằng ethylacetat ở pH 5 không chỉ đảm bảo hiệu quả chiết cao mà còn giảm thiểu độc tính so với chloroform, phù hợp với yêu cầu sản xuất dược phẩm an toàn. Quá trình tinh chế qua các bước sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột đã giúp phân lập được các thành phần kháng sinh có hoạt tính cao, đồng thời loại bỏ tạp chất không có hoạt tính, nâng cao độ tinh khiết sản phẩm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các biến chủng trước và sau đột biến, cũng như bảng tổng hợp hiệu suất chiết và tinh chế kháng sinh. So sánh với các nghiên cứu tương tự cho thấy kết quả đạt được có tính khả thi và ứng dụng cao trong phát triển kháng sinh mới.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục tối ưu hóa quy trình đột biến: Áp dụng các phương pháp đột biến kết hợp và sàng lọc tự động để tạo ra biến chủng có HTKS cao hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất kháng sinh trong vòng 1-2 năm, do các phòng thí nghiệm vi sinh vật thực hiện.

2. Phát triển quy trình lên men quy mô lớn: Xây dựng và vận hành hệ thống lên men chìm bán liên tục với môi trường MT2dt đã tối ưu, nhằm tăng sản lượng kháng sinh, dự kiến hoàn thành trong 18 tháng, do các nhà máy sản xuất dược phẩm đảm nhiệm.

3. Nghiên cứu sâu về cấu trúc và cơ chế tác dụng kháng sinh: Sử dụng các kỹ thuật phổ hiện đại như NMR, MS để xác định cấu trúc chi tiết và cơ chế tác động của các thành phần kháng sinh thu được, trong vòng 12 tháng, do các viện nghiên cứu chuyên sâu thực hiện.

4. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả in vivo: Tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật để đánh giá độc tính và hiệu quả điều trị, chuẩn bị cho các bước phát triển thuốc lâm sàng, trong vòng 2 năm, do các trung tâm nghiên cứu dược lý và y sinh đảm nhiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh và công nghệ sinh học: Có thể áp dụng phương pháp đột biến và sàng lọc để cải tạo các chủng vi sinh vật khác nhằm tăng sản xuất các hợp chất sinh học có giá trị.

2. Chuyên gia phát triển dược phẩm và công nghệ lên men: Sử dụng kết quả nghiên cứu để thiết kế quy trình lên men và tinh chế kháng sinh quy mô công nghiệp, nâng cao hiệu quả sản xuất.

3. Sinh viên và học viên cao học ngành dược học, vi sinh học: Tham khảo quy trình nghiên cứu khoa học bài bản, từ nuôi cấy, đột biến, lên men đến phân tích và tinh chế sản phẩm.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế: Đánh giá tiềm năng phát triển nguồn kháng sinh mới trong nước, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống kháng thuốc hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Streptomyces 184.221 để nghiên cứu cải tạo giống?
   Streptomyces 184.221 được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh và đã thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt trên môi trường MT2, phù hợp làm đối tượng cải tạo nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.

2. Phương pháp đột biến nào hiệu quả nhất trong nghiên cứu này?
   Đột biến hóa học bằng NaNO2 cho kết quả tăng hoạt tính kháng sinh cao nhất, với biến chủng ĐBHH 11 tăng hơn 12% so với mẫu chứng, đồng thời có độ sống sót phù hợp để tiếp tục nghiên cứu.

3. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các biến chủng?
   Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và khoanh giấy lọc, đo đường kính vòng vô khuẩn trên các vi khuẩn kiểm định như E. coli và S. aureus.

4. Tại sao chọn ethylacetat làm dung môi chiết kháng sinh?
   Ethylacetat ở pH 5 cho hiệu quả chiết kháng sinh tương đương chloroform nhưng ít độc hại hơn, an toàn hơn cho quy trình sản xuất và nghiên cứu tiếp theo.

5. Các bước tiếp theo để phát triển kháng sinh từ nghiên cứu này là gì?
   Tiếp tục tối ưu hóa quy trình lên men quy mô lớn, tinh chế sản phẩm đạt chuẩn dược phẩm, nghiên cứu cơ chế tác dụng và đánh giá an toàn, hiệu quả trên mô hình động vật để chuẩn bị cho phát triển lâm sàng.

Kết luận

• Đã thành công trong việc cải tạo giống Streptomyces 184.221 qua đột biến UV và hóa học, tăng hoạt tính kháng sinh lên đến hơn 12%.
• Môi trường lên men MT2dt được xác định là điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh của biến chủng cải tạo.
• Phương pháp chiết xuất bằng ethylacetat ở pH 5 hiệu quả và an toàn hơn so với chloroform.
• Quá trình tinh chế qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột đã phân lập được các thành phần kháng sinh có hoạt tính cao và độ tinh khiết tốt.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển kháng sinh mới có tiềm năng ứng dụng trong điều trị, cần tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô và đánh giá lâm sàng.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm phối hợp triển khai quy trình sản xuất quy mô lớn và nghiên cứu tiền lâm sàng để phát triển sản phẩm kháng sinh mới từ Streptomyces 184.221 cải tạo.