DAI hOc QUOc GIA hA TIOI TTƠJỜNG ĐẠI hỌc Kh0A hỌc TU WHET HGUVÉH PhƠ|ƠIIG ThÖYV HGHIÊH cỨU Đặc TíHh VITUT T0TA LđJU hÀHh GAY bỆHh TIÊU chẢÁY TTẺ EM VÀ0 bỆHh VIET hI KhÁIh hÕA HĂM 2010 LUATI VATI ThaAc Si Kh0A hOc ĐẠI hỌc QUỐC GIA hA TIOI TTƠ|ỜIG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ IhIÊH HIGUVÉÊH PhƠ|ƠIG ThÖY HGHIÊH cỨU ĐẶc TíHh VITUT F0TA LƠJU hÀïh GÂY bỆHh TIÊU chÁY TTẺ EM VÀ0 bỆHh VIỆH HhI KhÁINh hÕA HĂM 2010 chuyên ngành : Vĩ sinh vat học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂII ThẠc SĨ KhÚA hỌc Hgooi hojong dan kh0a hoc: PGS. LE Th] LUÂN Hà Nội — Nam 2013 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý MUc LUc LOI cAM OTT MUc LUc DAIIh MUc cAc ch’ VIET TAT DAHh MỤCc cÁc bẢIG DATIh MUc hillh DAT VATI DE 1 chojong 1 — TONG QUATI TAI LIEU 3 1.1 SƠ LƠ|Ợc LỊch SỬ PhÁT hIỆII VITUT T0TA.3 PhÂI IhóM VÀ cÁc TÝP hUVÉT ThAITh.----2¿+¿+k+2Ek+2EE22E12EE27112711211211211211211211 21121121 r0. ccrkrrrrii 11 I0 7 vn4 7 Vẽ.1 Tih pén Vittg VOI PR.2 Tính chịu nhiệt.3 Titth may Cam.4 Tính để kháng .5 ĐẶc TíITh VITUT T0TA TTÊI TẾ bÀ0 HUÔI cÂY MÔ.6 QUÁ TTÌHh HhÂII LÊI cỦA VITUT T0TA.7 KhẢ HĂNG GÂY bỆIh cỦA VITUT TŨTA.1 Khả năng gây bệnh CHO lrẻ em.-- -- 6 1à HT HH HH ngư, 15 1.2 Kha nang gay bệnh ở IBGIỜI ÏỚH. -- ¿+ 6 + E2 E*E*k*ESEEEEskekrkrekrkee 15 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý 1.3 cơ chế gây bệnh.8 Dich TE hOc bETIh TIEU chAY cAP D0 VITUT T0TA.2 Dojong lay truyền 0n 0 hố.4 Lita 161 Mac BOMB oie ecccsssessesssessessssvessessscsvessessvsssessessvsssessessessuessessseaseess 17 1.6 Mi@tt iC .9 SỰ PhAII BO cAc KIEU GEII cỦA VITUT T0TA.2- 2 se sz2se2£s2 18 1.1 Phân số lrên thề giới.2 Phân số lại Việt TIam.
2-2 ©2S¿+SE2EESEE2EE221122112711211211211 21122.10 Tih hilTh MAc bEITh TIÊU chAy cAP VA VAc XII PhONG IGỪA BETIh TiEU chẢY cẤP D0 VITUT TIŨTA.1Tình hình mắc sệnh liêu chảy cấp d0 virul T01a trên thế giới và Việt Tam 20 1.1 Tình hình mắc sệnh d0 virul T0†a trên thế giới .2 Tình hình mắc sệnh đ0 virul T0†a lại Việt IIam.2Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa sệnh tiêu chảy cấp d0 virul T0la.1 các chủng virul T0†a doje cân nhắc để phát triển vắc xin .2 các l0ại văc xin đơJợc nghiên cứu và sử dụng .11 cÁc PhQ|ƠIIG PhÁP chẢII Đ0ÁIT VITUT TÖTA .1 các kỹ thuật phát hiện virul I'0la.2 các kỹ thuật phái hiện kháng thể virul I01a.---c¿5cccccccseccerree 26 chữ|ƠNG 2: ĐÓI TƠỊỢHG VÀ PhƠ|ƠIG PhÁP IGhIÊN cỨU.1 ĐÓI TŒ|ỢIIG IIGhIÊIT cỨU .- 22-22 5¿+22E+2+EE2£EE££EE££EE2+E+zrxezrxeee 27 2.2 Phd|ƠIIG PhÁP IIGhIÊII cỨU.1 Thiết kế nghiên cứu.---2¿-22¿+++2E+++SE+++EEE+tEEE+EEEEvEEEErErExrrrkrrrrkrrrrkrcre 27 2.2PhơJơng pháp thực hiỆN.- - E1 E111 HH1 HH HH nh ri 28 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý 2.1 Lẫy mẫu bệnh phâm.---2¿2+£©++£2E+++EE+++EEE+SEEEveEEErrrkrrrrkrrrrrrcre 28 2.2 Xác định virul T01a lr0ng mẫu sệnh phẩm sằng pho|ơng pháp ELISA.3 Phojong pháp lách chiết ATTI từ mẫu phân .4 PhoJơng pháp xác định lýp viru† T0†a bằng IT — P€T.5 chạy điện di và đọc kết quả.6 PhoJơng pháp thống kê xử lýsố liệu.----¿--+©c++2c+xvecxeecrxeeee 42 chữ|ƠNG 3. KÉT QUÁ HGhIÊN cỨU VÀ ThẢ0 LUẬI.1 XÁc ĐỊITh TỶ LE Tcc DO VITUT TA TAI bEITh VIET IThlï KhÁNh HOA 02010055 —.2 TY LE bEITh IhÂMT Tcc D0 VITUT T0TA ThE0 ThÁI1G.3 TỶ LỆ bỆITh IhÂMT Tcc D0 VITUT T0TA ThE0 IIhóM TUỔỎI.4 TỶ LỆ bỆITh IhÂM Tcc D0 VITUT T0TA ThE0 GIỚI TíHh.5 ĐẶc TíIh cÁc chỦñG VITUT T0TA LŒ|U hÀïTh TẠI bỆHh VIỆT IhI KhÁNTh hÕA TIĂM 2010.1 Đặc nh chủng P.2 Dac Hirth CHU nen.6 Sự lơiu hành các chủng tô hợp G — P của virul T0a.1 Sự phân số các chủng tô hợp G — P lại miền Trung.2 Sự lơiu hành các chủng lô hợp G — P the0 thời gian.--------- 62 KET LUẬN 64 KIÊN IGh]Ị 65 TÀI LIỆU ThAM KhẢ0 66 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý ADII cDc ELISA Gmix Gut IgA IgG TISP 0D Pmix Put ATTI TT- Pc Tcc WhO DAIIh MUc cAc chU’ VIET TAT DeOxyribOnucleic Acid cemters fOr Disease cOntr01 and PrevenH0n Enzyme-linked immun0sOrsent assay Mixed G-gen0type Untypaple G- gen0type Immun0 gl0pulin A Immun0 gl0sulin G Il0n-shuclure Pr0lein Optical density Mix P-type Untlýpasle P-gen0type TisOnucleic Acid Teverse lranscrIpHỦn pOlymerase chain reachOn WoOrld health OrganizatiOn AxIl De0xyris0nucleic Trung lâm Kiểm s0át và phòng chống bệnh, Mỹ Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme chủng virul T0†a có kiểu gen G hỗn hợp chung virut T0†a không thể xác định kiểu gen G Gl0bulin miễn dịch A Gl0bulin miễn dịch G Pr0lein không cấu tric Mậi độ quang học chung virut T0†a có kiểu gen P hỗn hợp chung virut T0†a không thể xác định kiểu genP Axit Fie0nucleic Phản ứng chuỗi P0lymerase phiên mã Tgojợc Tiêu chảy cấp Tổ chức V lế Thế giới Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý DAITh MUc cÁc bẢIG bảng 1. Đặc điểm chuỗi nucle01i1 các đOạn gen của virul [01a [16,18]. các gen và pr0lein của virul [0a [6,§].-¿- «6 cS+S+strreiey 7 bang 3.
Týp huyết thanh của virul T'0†a [6,].---¿-©csc©c5c5csevccxercrveeee 1 bảng 4. Sự phân số các chủng lou hành lrên 10àn cầu, năm 2001 — 2008 [66]. các chủng virul T0†a đojợc cân nhắc để phát triển vắc xin [6]. các primer đơiợc sử dụng dé định typ G và lýp P.
bang tra kích thoiớc các kiêu gen G, P sau khi điện di. Tỷ lệ Tcc d0 virut Ota hàng năm lại Việt TIam [1,2,3]. Phân số †he0 tháng lỷ lệ trẻ mắc bệnh Tcc d0 viru† T01a. Tỷ lệ mắc virul T01a the0 nhóm luôi lại bệnh viện IThi Khánh hòa năm bảng 11.
Tỷ lệ mắc bệnh d0 virui T0†a the0 giới lính. Tỷ lệ lou hành các kiểu gen P tại bệnh viện nhỉ Khánh hòa năm 2010 52 bang 13. Sự phân số các kiêu gen the0 khu vực lr0ng cả nojớc. Tỷ lệ các kiểu gen P lơiu hành †he0 thời gian.
Tỷ lệ lơiu hành các kiểu gen G lại sệnh viện nhỉ Khánh hòa năm 201057 bảng 16. Sự phân số các chủng G †he0 khu Vực.:--¿sc©csscccxecccseeee 58 bang 17. Tỷ lệ lơtu hành các kiểu gen G the0 thời gian. Sự loju hành các chủng G — P lại miền Trung năm 2010.
Sự loiu hành các chủng lỗ hợp G — P the0 thời gian.--- 62 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý DAITh MUc hillh hình |. hình ảnh virui T01a chụp dojới kính hiển vi điện tử [58]. hình minh họa cấu lrúc của virul 01a .----2- s2 s+£x+£x+Eerxerxesrxee 5 hình 3: Tái dựng hình ảnh của virut T0†a dựa trên hình ảnh chụp qua kính hiển VE GIST AD. 9 hình 4: chu trình nhân lên của virut POta trOmg $6 BAO.
Sự phân số số bệnh nhân tir vOng †he0 khu vực trên thé giới và số bệnh nhân lử v0ng lại các quốc gia châu Á [33].---------ccc+++++ttrrvrrvvrrreex 21 hình 6. Sơ đồ lóm lắt quy trình †hực hiện.-----2¿-©2V22222¿+tt2EEE22Eeerrrrrrrrve 28 hình 7. Sơ đồ mô lả nguyên lý của phoJơng pháp ELISA. Kết quả ELISA khi chơia ch0 chất dừng phản ứng.
Kết quả ELISA sau khi ch0 chất dừng phản ứng. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm rên máy ELISA. Vị trí các Primer và sản sa0 ADII thu đơiợc để xác định kiểu gen G. Vị trí các Primer và sản sa0 ADII thu đơjợc để xác định kiểu gen P.
Ảnh minh họa vị trí mẫu trên sản 0. Ảnh minh họa kiêu gen G phan tich trên gel agar0se 2%. Ảnh minh họa kiêu gen P phân tích trên gel agar0se 2%. Tỷ lệ bệnh nhi mắc bệnh Tcc và0 sệnh viện Ihi Khánh hòa.
biểu đồ lý lệ rẻ em mắc sệnh Tcc đ0 virulT01a the0 tháng lại các khu vực. Sự phân số Tcc dO virul T0†a the0 nhóm luổi. Tỷ lệ trẻ dojong lính với virul T0†a phân số the0 giới tính lại sệnh viện nhỉ Khánh hòa năm 2010.---222¿+222VE22222tEEEEEEEESerrrrrrrk hình 20. Kết quả điện di trên gel agar0se xác định kiểu gen P hình 21.
Tỷ lệ các kiểu gen P lại sệnh viện nhi Khánh hòa năm 2010. 52 hình 22: Sự phân số các kiểu gen †he0 khu vực lrŨng cả nro|ớc. Sự phân số kiểu gen P †he0 thời gian.-------cccccccccc++ettcvvccvvrvreee 55 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý hình 24. Kết quả điện di trên gel agar0se xác định kiểu gen G.
Sự phân số các kiêu gen G loiu hành lại miền Trung năm 2010. Sự lơiu hành các kiểu gen G lại miền Trung năm 2009 và năm 2010. Sự phân số các lỗ hợp G — P của virul TÚfa.--ccc¿+2ccv2vvcecrrrrrrrres 61 hình 28. Sự lơu hành các chủng lỗ hợp G — P the0 thời gian.------------ 62 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý DAT VATI DE Virut T0ta dojoc phat hién va0 dau những năm 70 của thế kỷ XX, là một virut ATTI sợi đôi, thuộc họ Ie0viridae [37].
Virul F0la là mội tr0ng những nguyên nhân quan lrọng nhất gây viêm dạ dày ruột mà không d0 vi khuẩn ở lrẻ nhỏ dojới 5 luổi. Tuy nhiên nggjời ‡a cũng quan sát thấy ở lrẻ lớn hơn và cả ở ngo|ời lớn. Virus r0la đojợc đánh giá là đã gây ra 40% lr0ng tổng số vụ nhập viện d0 liêu chảy của trẻ dojới 5 tuôi trên l0àn cầu và gây ra mỗi năm 100 triệu ca liêu chảy cấp còng 450 đến 800 nghìn ca tir vOng [67]. Ở các nojớc phát triển có 35% - 52% trẻ em sị liêu chảy cấp (Tcc) d0 virul T0†a.
còn ở các nolớc đang phát triển, virul T01a là một tr0ng những nguyên nhân hàng đầu gây liêu chảy và tử vŨng ở lrẻ dojới 2luôi. dớc nh hàng năm ở những nojớc này có trên 12,5 triệu lrẻ em dojới 5 luôi ácc d0 virul T01a và kh0ảng 873.000 lrolờng hợp †ử v0ng [50],[51]. Tại Việt Iam, hàng năm ty lệ mắc liêu chảy đ0 virul T01a chiếm trên 50% tr0ng số lrẻ đojới 5 tudi 5ị liêu chảy và0 điều trị lại 1 số sệnh viện Ihi lớn của Việt Ham. Số trẻ chết d0 virul T01a chiếm lừ 4% - 8% trOng téng sé tré doi 5 tuổi sị chết vì mọi nguyên nhân [6].
bệnh lây lan the0 đojờng phân — miệng, lừ ngojời sang ngojời nên tr0ng đều kiện vệ sinh của nojớc †a còn kém thi bệnh rất dễ lây lan thành vụ dịch lớn. Virul Ota khi xâm nhập và0 cơ thể nhân lên ở ruột nÖn, phá hủy lễ sà0 rụ niêm mạc ruột gây ra các rối l0ạn dẫn đến lình trang mat nojoc và điện giải, bệnh nhân suy sụp rất nhanh nếu không đojợc chuẩn đÓán và điều trị kịp thời rất dễ dẫn đến lử vŨng. hiện nay, trên thế giới đã cấp phép lơiu hành hai 10ai vắc xin là: vac xin T0larix của hãng Glax0 Smilh Kline và T0†aleq của Merck. cdc vac xin này đơjợc sử dụng ở nhiều quốc gia nhoịng hiệu lực sả0 vệ lại khác nhau the0 khu vực, điều này đơiợc giải thích là d0 lính đa dạng về di truyền của các chủng virul† T0†a và sự 1 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý lou hành các chủng có sự siên đổi the0 không gian và thời gian [6.
Tại Việt am đã sản xuất đơjợc vắc xin virut T01a uống, lừ chủng phổ biến G[1]P[8] da dojgc lam giảm độc lực Két qua thu nghiém 14m sang dojgc danh gia A đại về mức độ an l0àn lrên cơ thể ngoiời lớn và lrẻ em [5].