MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có khí hậu nóng ẩm nhiệt đới rất thuận lợi cho các loại cây trồng ăn trái khác nhau sinh trƣởng và phát triển, trong đó có các giống cây có múi (Hà Thanh Võ, 2005). Cây bƣởi là một trong những cây ăn quả thƣơng mại chủ lực, có lịch sử phát triển lâu đời ở nƣớc ta. Bƣởi là loại cây ăn quả quý, có giá trị dinh dƣỡng cao.
Trong lá, hoa, và vỏ quả chứa nhiều tinh dầu; trong vỏ quả bƣởi còn có pectin, narigin, men tiêu hóa peroxydaza, amilaza,… Quả bƣởi có vị ngọt mát, chứa nhiều vitamin, chất khoáng cần thiết cho cơ thể con ngƣời (Hà Thị Thúy, Đỗ Năng Vịnh, 2004). Làng Đại Bình (xã Quế Trung, huyện Nông Sơn, tỉnh Quảng Nam) là vùng đất trù phú đƣợc bồi đắp phù sa màu mỡ từ sông Thu Bồn, trồng đƣợc rất nhiều giống cây ăn quả, trong đó bƣởi Trụ Lông đƣợc coi là cây trồng chủ lực ở vùng đất này. Việc trồng bƣởi Trụ Lông qua đó cũng giúp nhiều hộ nông dân làng Đại Bình có thu nhập cao, bƣởi trụ đã khẳng định đƣợc thƣơng hiệu và sức cạnh tranh trên thị trƣờng. Hiện nay, Việt Nam cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới đang rơi vào tình trạng suy giảm nguồn gen cây ăn quả, đặc biệt là các loại cây ăn quả quý.
Dịch bệnh trên cây ăn quả có múi xuất hiện ngày càng nhiều nhất là các bệnh do virus, vi khuẩn, nấm nhƣ: bệnh chảy gôm, bệnh thối gốc chảy mủ, bệnh vàng lá greening, … cùng nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác đã lây lan mạnh làm suy yếu cây, từ đó làm giảm năng suất và phẩm chất quả. Song do tập quán của ngƣời dân trong vùng trồng theo hình thức quảng canh, cây giống sử dụng chủ yếu là chiết cành, ghép cành, gieo hạt,…( Nguyễn Mạnh Chinh, 2005). Tuy nhiên cây giống đƣợc xuất vƣờn chƣa cao, thời gian sinh trƣởng kéo dài, kết quả đạt đƣợc không ổn định, chất lƣợng quả không đồng đều. Một số giải pháp trƣớc mắt nhằm duy trì nguồn gen quý đã đƣợc triển khai nhƣng hiệu quả chƣa cao, chƣa đồng bộ năng suất bƣởi ở vùng ngày càng thấp.
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt đƣợc đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm. Việc áp dụng các phƣơng pháp kĩ thuật trong đó có phƣơng pháp nhân giống in vitro có nhiều ƣu điểm: Đảm bảo đƣợc các đặc điểm di truyền tốt của cây mẹ, tạo quần thể cây con đồng nhất, tỷ lệ nhân giống cao, số lƣợng giống lớn, tạo nguồn giống sạch bệnh (nuôi cấy trong điều kiện vô trùng), tăng tuổi thọ cho cây, thời gian nhân giống nhanh. 1 Cho đến nay, hiệu quả của cảm ứng chồi từ chồi của cây có múi vẫn còn tƣơng đối thấp so với nguyên liệu là cây con và ngƣời ta biết rất ít về ảnh hƣởng của giống cây trồng, loại mẫu cấy, chất điều hòa sinh trƣởng và môi trƣờng cơ bản trong thí nghiệm nuôi cấy các chồi từ mẫu cấy chồi bên từ cây trƣởng thành (Marutani-Hert và cs, 2012; Tallon và cs, 2013).
Một quy trình tái sinh cây con từ các mẫu cấy chồi của cây trƣởng thành sẽ có giá trị lớn, những cây không có đặc điểm cây con sẽ sẵn sàng lọc hồ sơ trong thời gian ngắn hơn, do đó cho phép quá trình chọn lọc nhanh hơn (Cervera và cs, 1998; Kobayashi và cs, 2003). Sự tái sinh thành công đầu tiên tạo cây con hoàn chỉnh từ các chồi bên của cây trƣởng thành đã đƣợc báo cáo ở Citrus sinensis. Sau đó, các nhà điều tra khác đã báo cáo sự cảm ứng chồi từ chồi của các loài cây có múi, đặc biệt là ở các giống cam (Esmaeilnia, E. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu khác nhau nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây có múi, nhƣng chƣa có công trình nào nghiên cứu về khả năng nhân giống của cây bƣởi.
Ở Việt Nam, nghiên cứu nhân giống cây bƣởi Diễn (citrus grandis l.) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro đã đƣợc nghiên cứu. Đối với cây bƣởi Trụ Lông chƣa có nhà khoa học nào nghiên cứu nhân giống đặc biệt là từ tái sinh chồi từ mẫu cấy chồi bên của cây trƣởng thành. Xuất phát từ những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng nhân chồi in vitro của cây bưởi Trụ Lông (Citrus maxima (Burm.)” nhằm tạo giống cây tốt, sạch bệnh phục vụ sản xuất và mở rộng diện tích cây có múi. Mục tiêu đề tài - Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu cấy.
- Đánh giá ảnh hƣởng của mẫu cấy đoạn chồi bên từ cây ngoài tự nhiên và cây con từ hạt đến khả năng nhân chồi. Ý nghĩa của đề tài 3. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ lần đầu tiên cung cấp những dữ liệu khoa học về sự phản ứng trong điều kiện nuôi cấy in vitro và khả năng tái sinh, nhân chồi của cây bƣởi Trụ Lông, làm cơ sở có giá trị để tiến hành các nghiên cứu liên quan tiếp theo. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp một phƣơng pháp có giá trị trong việc nhân giống cây bƣởi Trụ lông thông qua con đƣờng tái sinh và nhân nhanh các chồi in vitro.
- Góp phần bảo tồn nguồn gen cây bƣởi Trụ long. Nội dung nghiên cứu 4. Khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây con từ hạt 4. Ảnh hưởng của độ tuổi hạt đến khả năng nảy mầm của hạt Khảo sát khả năng nảy mầm của các hạt bƣởi Trụ Lông ở các độ tuổi khác nhau: 4, 6, 8, 10 tuần.
Ảnh hưởng của các điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt Mẫu hạt sau khi xử lí bề mặt được đưa vào trong tủ cấy vô trùng, khử trùng mẫu hạt bằng cồn 70° trong 60 giây và dung dịch Javel trong các khoảng thời gian khác: 5; 10; 15; 20 phút. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân chồi từ đoạn chồi bên của cây con từ hạt Sử dụng môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung đƣờng 30 g/l + agar 8,0 g/l + 1 g/l than hoạt tính và chất điều hòa sinh trƣởng bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l; 2,5 mg/l. Khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên 4. Ảnh hưởng của các điều kiện khử trùng đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên Thí nghiệm đƣợc khử trùng với các dung dịch: Javel, Nano bạc, Tetracyclin, Tween 80, HgCl2 3 CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về loài bƣởi 1. Nguồn gốc Theo tác giả Bùi Huy Đáp, 1960, Walter Reuther và cs, 1989, các giống bƣởi (Citrus grandis) đƣợc báo cáo có nguồn gốc ở Malaysia, Ấn Độ, một thuyền trƣởng ngƣời Ấn Độ có tên là Shaddock đã mang giống bƣởi này tới trồng ở vùng biển Caribe, sau đó bƣởi đƣợc giới thiệu ở Palestin vào năm 900 sau Công Nguyên và tiếp theo mới đến các nƣớc ở châu Âu. Bƣởi chùm (Citrus paradisis) đƣợc xác định là dạng đột biến hay dạng con lai tự nhiên của bƣởi (Citrus grandis), xuất hiện sớm nhất ở vùng Barbadas miền Tây Ấn Độ, tiếp theo là trồng ở Bang Florida (Mỹ) vào năm 1809, sau đó lan rộng và trở thành một trong những sản phẩm quả chất lƣợng cao ở châu Mỹ.
Tác giả Giucovki cho rằng nguồn gốc của bƣởi có thể là ở quần đảo Laxongdơ. Tác giả Chawalit Niyomdham cũng cho rằng bƣởi có nguồn gốc ở Malaysia, sau đó lan sang Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Địa Trung Hải và Mỹ,. vùng sản xuất chính là ở các nƣớc Phƣơng Đông (Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam,. Nhƣ vậy, cho đến nay nguồn gốc của cây bƣởi vẫn chƣa đƣợc thống nhất.
Bƣởi có thể có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia,… Ngày nay bƣởi đƣợc trồng tập trung nhiều ở một số nƣớc thuộc châu Á nhƣ: Ấn độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Việt Nam và miền Nam Trung Quốc. Khí hậu á nhiệt đới hạn chế đƣợc nhiều loại sâu bệnh hại nên cây có múi ở những vùng này ngày càng có xu hƣớng tăng nhanh, phát triển mạnh về diện tích, năng suất, sản lƣợng và chất lƣợng quả ( Ngo Xuan Binh, 2001). Phân loại khoa học Hệ thống phân loại cây có múi nói chung và cây bƣởi nói riêng rất phức tạp do vòng đời thực vật dài và khả năng thích ứng rộng. Ngày nay do có nhiều dạng lai tự nhiên, các đột biến tự nhiên và công tác lai tạo ra nhiều giống, loài mới làm cho công tác phân loại ngày càng phức tạp.
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý, tác giả Tanaka đã phân loại: - Cây bƣởi (danh pháp khoa học: Citrus grandis hoặc Citrus maxima - Tên gọi khác: Cây bòng (Miền Bắc) - Tên tiếng Anh: Pomelo, Shaddock. - Các loài tƣơng cận: Bƣởi chùm (Citrus paradisi) 4 Chanh ta (Citrus aurantifolia) Cây quít (Citrus reticulata) Cam ngọt (Citrus×sinensis) Thanh yên, phật thủ (Citrus medica) Phân loại khoa học: Họ (familia) Cữu Lý hƣơng (Rutaceae) Chi (genus) Cam chanh (Citrus) Loài (species) Citrus maxima Theo sơ đồ phân loại cây có múi của Swingle (1948) thì có hai loại bƣởi chính là: bƣởi đơn và bƣởi chùm. Đây là hai loài khác nhau trong cùng một chi Citrus, tuy vậy bƣởi đơn và bƣởi chùm có mối quan hệ chặt chẽ. Năm 1930, Macfadyen đã phân bƣởi chùm thành một loài mới và lấy tên là Citrus paradisi Macf.
Bƣởi (Citrus grandis): quả to nhất trong các loài cam quýt, có vị chua hoặc ngọt, bầu có từ 13- 15 noãn, eo lá khá lớn, hạt nhiều. Hiện nay, giống bƣởi phần lớn thuộc dạng hạt đơn phôi và đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam,… Việt Nam có rất nhiều giống bƣởi ngon nổi tiếng nhƣ bƣởi Năm Roi, bƣởi Da Xanh, bƣởi Thanh Trà, bƣởi Phúc Trạch, Phú Diễn, bƣởi Đoan Hùng,… Bƣởi chùm (Citrus paradisi): đƣợc đánh giá là dạng con lai tự nhiên của bƣởi (Citrus grandis). Vì vậy, hình thái bƣởi chùm khá giống với bƣởi nhƣng lá nhỏ hơn, eo lá cũng nhỏ hơn, quả nhỏ, cùi mỏng, vỏ mỏng, vị chua nhẹ. Bƣởi chùm cho những giống ít hạt, phần lớn các giống bƣởi chùm có hạt đa phôi nên cũng có thể sử dụng làm gốc ghép.
Quả bƣởi chùm là món ăn tráng miệng đƣợc ƣa chuộng ở châu Âu, ngƣời ta gọt nhẹ lớp vỏ mỏng bên ngoài rồi để cùi cắt thành các lát nhỏ dung sau bữa ăn.