Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật và các vấn đề liên quan a) Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm [3].
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao gấp nhiều lần các phương pháp nhân giống vô tính khác; Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới [3]. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ∗ Tính toàn năng của tế bào (Totipotency) Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. 5 Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.
Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]. ∗ Sự phân hoá và phản phân hoá Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào thành các mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu cho ra các tế bào mới và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Quá trình đó được gọi là sự phản phân hoá tế bào. Hai quá trình trên được biểu thị bằng sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi Tế bào Tế bào giãn chuyên hoá sinh Phản phân hoá tế bào Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình điều hoà hoạt hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào.
Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế 6 bào, quá trình hoạt hoá sẽ được xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó [14]. ∗ Sự trẻ hoá Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu.
Trong nuôi cấy in vitro, các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [14]. Cơ sở khoa học của việc xác định biện pháp kỹ thuật trồng cây lan Kim tuyến a) Cơ sở khoa học của việc xác định giá thể trồng Trước đây giá thể chủ yếu được sử dụng là cát hoặc sỏi. Ngày nay giá thể đã được thay đổi rất nhiều.
Cây cần cả oxi và dinh dưỡng tiếp xúc với rễ cây. Giá thể lí tưởng là loại có khả năng giữ nước tương đương với độ thoáng khí. Khả năng giữ nước và độ thoáng khí của giá thể được quyết định bới những khe trống trong đó. Trong cát mịn có những khoảng trống rất nhỏ, không chứa được nhiều nước và oxi.
Ngược lại, sỏi thô tạo ra những khoảng trống quá lớn, nhiều không khí nhưng mất nước nhanh. Giá thể lý tưởng phải có những đặc điểm: - Có khả năng giữ ẩm cũng như độ thoáng khí. - Có pH trung tính và có khả năng ổn định pH. - Thấm nước dễ dàng.
- Bền, có khả năng tái sử dụng hoặc phân hủy an toàn cho môi trường. - Nhẹ, rẻ và thông dụng. - Giá thể có nhiều loại như xơ dừa, trấu hun, mùn cưa, cát, sỏi vụn, đá trân trâu,. Có thể dùng đơn lẻ hoặc trộn lại để tận dụng ưu điểm từng loại.
b) Cơ sở khoa học của việc sử dụng phương pháp bón qua lá Phân bón lá là một trong 4 yếu tố quan trọng hàng đầu trong sản xuất nông nghiệp. Bón phân qua lá được sử dụng để bổ sung thêm dinh dưỡng cho cây hoa một cách kịp thời các nguyên tố đa lượng, trung lượng và vi lượng. 7 Phân bón lá có tác dụng làm tăng năng suất, tăng cường khả năng kháng sâu bệnh cho cây, tính chống hạn và cải thiện năng suất, chất lượng sản phẩm. Phân bón lá giúp cây nhanh chóng phục hồi sau trồng hoặc sau khi trải qua các hiện tượng thời tiết bất thuận như nóng nắng, lạnh, khô hạn, ngập úng.
Các kết quả nghiên cứu đều khẳng định rằng khi bón phân qua lá dạng hòa tan, 95% lượng phân phun lên lá sẽ được đồng hóa hết. Đối với lân, sau khi phun 30 giờ cây đã đồng hóa hết, đối với đạm urê chỉ vài giờ. Tuy nhiên hiệu quả của phân bón lá phụ thuộc vào các giống cây trồng, các giai đoạn sinh trưởng của cây, loại phân, nồng độ phân, liều lượng và thời gian sử dụng. Tóm lại, sự ra đời của phân bón lá đã giúp cây trồng ngăn ngừa được các bệnh ngay trong giai đoạn cây đang sinh trưởng, làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm.
c) Cơ sở khoa học của việc bố trí mật độ trồng hợp lý Mật độ và khoảng cách gieo trồng là hai yếu tố ảnh hưởng nhiều đến năng suất thân lá lan Kim tuyến. Xác định được mật độ trồng sẽ giải quyết được mối quan hệ giữa sinh trưởng và phát triển của các cá thể làm cho quần thể cây lan Kim tuyến khai thác tốt nhất khoảng không gian và mặt đất nhằm thu được sản lượng cao nhất trên một đơn vị diện tích. Mật độ càng cao mức độ cạnh tranh diễn ra càng quyết liệt. Dưới đất cây cạnh tranh về nước, dinh dưỡng và khoảng trống trong đất để phát triển.
Khi đất không cung cấp đủ nhu cầu của cây thì cây sẽ phát triển kém, thân lá nhỏ. Trên không gian, khi phải cạnh tranh ánh sáng với các cây khác cây sẽ phải tăng trưởng chiều cao tối đa vì vậy sẽ làm cho cây yếu, sức chống chịu kém trước điều kiện ngoại cảnh. Trồng cây với mật độ thấp cây sẽ không phải cạnh tranh nhau nhiều do vậy cây có điều kiện phát triển tốt, cho năng suất cá thể cao nhưng năng suất quần thể giảm. Đồng thời, cây sẽ bị ảnh hưởng nhiều bới điều kiện ngoại cảnh do tính quần thể bị giảm.
Mật độ trồng hợp lý sẽ giúp cho cây sử dụng được tối đa các điều kiện của ngoại cảnh từ đó giúp cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng tích lũy của 8 cây tăng từ đó có thể tăng năng suất và tăng sản lượng cũng như hiệu quả kinh tế. Để cây phát huy hết tiềm năng cần nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật phù hợp trong đó xác định giá thể trồng, phân bón và mật độ trồng thích hợp góp phần nâng cao năng suất, chất lượng lan Kim tuyến. Giới thiệu chung về cây lan Kim tuyến 1. Phân loại Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) còn có tên gọi khác như: lan Gấm, lan Kim tuyến lông cứng, Kim tuyến, Kim tuyến tơ, Giải thủy tơ, Cỏ nhung, Kim cương là một loài thực vật điển hình của chi cùng tên (Anoectochilus) [8].
Theo các tác giả: Nguyễn Tiến Bân [1], Trần Hợp [8], Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh [5], cây hoa lan Orchi thuộc họ phong lan Orchidaceae, bộ Măng tây Asparagales, lớp một lá mầm Monocots. Họ lan thuộc ngành Ngọc lan Magnoliophyta, phân lớp hành Lilidae. Họ Lan là họ có số lượng loài lớn đứng thứ hai sau họ Cúc, phân bố từ 680 vĩ Bắc đến 560 vĩ Nam, nhưng chủ yếu là ở các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á. Tại vùng nhiệt đới, họ Lan phân bố rộng khắc từ vùng đầm lầy qua các đồi núi thấp lên cả đồi núi cao.
Đa số các loài lan chỉ mọc ở độ cao dưới 2000 m so với mặt nước biển, thường là những cây bụi sống trên mặt đất được gọi là Địa lan hoặc bám vào thân, cành cây được gọi là Phong lan. Họ Lan của Việt Nam cũng rất phong phú, theo Trần Hợp [8] thì Việt Nam có khoảng 137 - 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng. Lan Kim tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Tên "lan Kim tuyến " bắt nguồn từ những đường gân rất đẹp trên phiến lá của các loài lan này.
Tên tiếng La tinh bắt nguồn từ các từ Hy Lạp aniktos (mở) và cheilos (môi). Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam, giống lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.
