Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây kỷ tử (Lycium barbarum), còn gọi là câu kỷ tử, củ khởi, khởi tử, là loài cây bụi thuộc họ Cà (Solanaceae). Quả kỷ tử chứa hàm lượng lớn hợp chất polysaccharide cùng các chất chống oxy hóa, flavonoid, carotenoid (zeaxanthin, $\beta$-carotene), vitamin và khoáng chất, có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tế bào gan, hạ đường huyết, chống viêm và làm chậm quá trình lão hóa. Tại Việt Nam, nhu cầu tiêu thụ kỷ tử làm thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu truyền thống rất lớn, song phần lớn nguồn cung trước đây phụ thuộc vào nhập khẩu. Dù cây đã được di thực và gieo trồng tại một số tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Lai Châu, Yên Bái) và Lâm Đồng, việc khai thác chủ yếu dừng lại ở mức thu hái ngọn và lá làm rau ăn. Để thu hoạch quả, cây cần chế độ chăm sóc riêng biệt và không được ngắt ngọn lá.

Trong thực tiễn canh tác, kỷ tử ở Việt Nam chủ yếu được nhân giống bằng các phương pháp truyền thống như gieo hạt, giâm cành hoặc chiết cành. Các phương pháp này phụ thuộc nhiều vào thời tiết, hệ số nhân giống thấp và khó kiểm soát sâu bệnh. Việc ứng dụng công nghệ vi nhân giống (in vitro) cho cây kỷ tử chưa được công bố nghiên cứu chính thức trong nước. Do đó, đề tài "Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro cây kỷ tử (Lycium barbarum)" được thực hiện nhằm xây dựng các thông số kỹ thuật ban đầu phục vụ nhân giống vô tính loài cây này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:

  • Yêu cầu tổng quát: Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp nhằm nhân giống in vitro cây kỷ tử khỏe mạnh, đạt hệ số nhân chồi cao và tạo rễ hoàn chỉnh.
  • Nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm 3 thí nghiệm:
    1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Javel trong quá trình vô mẫu đốt thân mang chồi ngủ in vitro.
    2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA (6-benzyladenine) kết hợp với NAA ($\alpha$-naphthaleneacetic acid) lên khả năng tạo chồi in vitro.
    3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA lên sự tạo rễ in vitro nhằm tạo cây hoàn chỉnh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Đốt thân mang chồi ngủ khoảng 3 tuần tuổi thu từ cây kỷ tử (Lycium barbarum) sinh trưởng tại nhà lưới.
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 07/2022 đến tháng 12/2022.
  • Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô Tế bào Thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nguyên lý tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) và quy trình vi nhân giống qua 5 giai đoạn kỹ thuật: khử trùng mô nuôi cấy, tái sinh mẫu, nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh và đưa cây ra đất (theo tài liệu của Nguyễn Đức Lượng, 2002; Trần Văn Minh, 2004). Cơ chế phát sinh hình thái cơ quan được điều khiển bằng tỷ lệ phối hợp giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh:

  • Cytokinin (BA - 6-benzyladenine): Kích thích phân chia tế bào, phá vỡ ưu thế ngọn và cảm ứng hình thành chồi non.
  • Auxin (NAA - $\alpha$-naphthaleneacetic acid): Kích thích kéo dài tế bào, cảm ứng phân hóa mô và thúc đẩy hình thành rễ bất định.

Tỷ lệ Auxin/Cytokinin < 1 kích thích quá trình tạo chồi; Auxin/Cytokinin > 1 kích thích quá trình tạo rễ; Auxin/Cytokinin $\approx$ 1 thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo (callus) hoặc cân bằng giữa chồi và rễ (Dương Công Kiên, 2002).

Phương pháp bố trí thí nghiệm và điều kiện nuôi cấy:

  • Môi trường khoáng cơ bản: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 0,8% agar, 3,0% sucrose, hiệu chỉnh pH trong khoảng 5,7 – 5,8 trước khi khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút. Thể tích môi trường rót 30 – 35 ml/bình.
  • Điều kiện buồng nuôi: Nhiệt độ 25 ± 2°C; độ ẩm không khí 50 – 60%; thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày; cường độ chiếu sáng 3000 – 6000 Lux (riêng thí nghiệm nhân chồi đặt ở cường độ 1500 – 2000 Lux).
  • Thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố (CRD). Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 7 mẫu nuôi cấy (tổng quy mô 105 mẫu cho mỗi thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức).
  • Nguồn dữ liệu và xử lý thống kê: Số liệu thô được ghi nhận theo định kỳ hàng tuần. Dữ liệu tỷ lệ phần trăm được chuyển đổi qua hàm $y = \arcsin\sqrt{x}$ trước khi phân tích phương sai ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel. Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được kiểm định bằng trắc nghiệm phân hạng khoảng đa biến Tukey ở mức ý nghĩa $P < 0,01$ (cho thí nghiệm khử trùng) và $P < 0,05$ (cho các thí nghiệm tạo chồi, tạo rễ).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này làm rõ tính cấp thiết của đề tài dựa trên giá trị dược liệu của cây kỷ tử (Lycium barbarum), thực trạng thị trường tiêu thụ kỷ tử tại Việt Nam và hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. Tác giả xác định rõ ràng mục tiêu tổng quát, nhiệm vụ cụ thể và giới hạn phạm vi nghiên cứu của khóa luận.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu và kỹ thuật nuôi cấy mô:

  • Phân loại và đặc điểm sinh học: Xác định vị trí phân loại của Lycium barbarum thuộc họ Solanaceae, chi Lycium; phân tích hình thái thân, lá mũi mác, hoa tím mọc nách lá, quả mọng đỏ cam thuôn dài chứa 10 – 60 hạt; phân tích điều kiện sinh thái (nhiệt độ thích ứng 15 – 35°C, tối ưu 20 – 27°C, ưa sáng từ năm thứ 3, đất tơi xốp thoát nước tốt).
  • Thành phần hóa học: Đánh giá hàm lượng polysaccharide, flavonoid, betaine (0,09%), carotenoid, phenolic cùng các acid hữu cơ và khoáng vi lượng trong các bộ phận của cây.
  • Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước: Trích dẫn các công trình quốc tế như Fira và cộng sự (2016) về nhân giống L. barbarum trên nền MS bổ sung BA; Ceccarini và cộng sự (2016) về hoạt tính chống ung thư gan của kỷ tử vùng Umbria; Gao và cộng sự (2017), Zeng và cộng sự (2019) về cấu trúc và chức năng sinh học của polysaccharide; Jung và cộng sự (2021) về tái sinh chồi và kiểm tra độ ổn định di truyền bằng chỉ thị ISSR trên loài Lycium chinense. Đồng thời, chương này tổng quan các nghiên cứu trong nước về khử trùng bằng Javel trên chồi cây điều (Nguyễn Đình Sỹ, 2008) và tạo rễ bằng $\alpha$-NAA trên cây ba kích (Ninh Thị Thảo, 2016).
  • Lý thuyết vi nhân giống: Trình bày chi tiết 5 giai đoạn nuôi cấy in vitro cùng cơ chế hoạt động của nhóm chất auxin, cytokinin và gibberellin.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc vật liệu đốt thân cây kỷ tử, quy trình vận hành thiết bị phòng thí nghiệm (tủ cấy vô trùng, máy đo pH, nồi hấp vô trùng), hóa chất sử dụng (cồn 70°, dung dịch Javel chứa 5% NaClO, chất hoạt động bề mặt Tween 20, kháng sinh tetracyclin). Chương này miêu tả chi tiết thiết kế 3 thí nghiệm đơn yếu tố:

  • Khử trùng mẫu qua 2 bước Javel: lần 1 bằng Javel 30% (thay đổi thời gian từ 10 đến 30 phút), lần 2 bằng Javel 20% (cố định 15 phút).
  • Tái sinh chồi trên nền MS có bổ sung cố định 0,1 mg/L NAA và nồng độ BA thay đổi (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L).
  • Tạo rễ trên nền MS có nồng độ NAA thay đổi (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/L).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng Javel trong quá trình vô mẫu

Sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản, tỷ lệ mẫu sống sạch chịu ảnh hưởng rõ rệt từ thời gian khử trùng ở nồng độ Javel 30%.

Nghiệm thức Thời gian Javel 30% (phút) Thời gian Javel 20% (phút) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%)
A1 10 15 7,32$^c$
A2 15 15 35,38$^{bc}$
A3 20 15 51,82$^b$
A4 25 15 75,35$^a$
A5 30 15 38,18$^{bc}$

(Hệ số biến thiên CV% = 20,64%. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,01).

Thời gian khử trùng ngắn ở nghiệm thức A1 và A2 không đủ để diệt khuẩn và nấm bề mặt, dẫn đến tỷ lệ nhiễm cao. Khi tăng thời gian lên 30 phút (A5), dù mẫu sạch nấm khuẩn nhưng hoạt tính oxy hóa mạnh của NaClO gây tổn thương mô nghiêm trọng, dẫn đến hiện tượng chết mẫu. Nghiệm thức A4 (Javel 30% trong 25 phút kết hợp Javel 20% trong 15 phút) cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ sống sạch đạt 75,35%.

2. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA đến quá trình tạo chồi

Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L NAA kết hợp với các nồng độ BA khác nhau, khả năng tăng sinh và phát triển hình thái chồi được ghi nhận:

Nghiệm thức BA (mg/L) NAA (mg/L) Số chồi trung bình (chồi/mẫu) Chiều cao chồi trung bình (cm) Số lá trung bình (lá/chồi) Đặc điểm hình thái chồi
B0 (ĐC) 0,0 0,0 1,00$^e$ ± 0,00 0,94$^e$ ± 0,06 5,38$^c$ ± 0,30 Chồi thấp, ốm, lá mũi mác, mẫu tự tạo rễ, không có sẹo
B1 0,5 0,1 1,52$^c$ ± 0,08 1,74$^b$ ± 0,11 8,66$^a$ ± 0,28 Chồi ốm dài, lá hình kim mũi mác thon dài, có mô sẹo
B2 1,0 0,1 1,52$^c$ ± 0,16 1,21$^d$ ± 0,02 6,69$^b$ ± 0,47 Chồi ngắn mập, lá hình kim mũi mác nhỏ, có mô sẹo
B3 1,5 0,1 1,66$^b$ ± 0,08 1,47$^c$ ± 0,02 7,04$^b$ ± 0,11 Chồi ngắn mập, lá hình kim mũi mác thon dài, có mô sẹo
B4 2,0 0,1 2,67$^a$ ± 0,33 1,89$^a$ ± 0,03 8,14$^a$ ± 0,34 Chồi dài mập khỏe, lá hình kim mũi mác thon dài, có mô sẹo

(CV% của số chồi = 7,77%; chiều cao = 3,33%; số lá = 4,18%. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,05).

Nghiệm thức B4 (2,0 mg/L BA + 0,1 mg/L NAA) cho số chồi trung bình cao nhất (2,67 chồi/mẫu) và chiều cao chồi lớn nhất (1,89 cm). Số lá ở B4 đạt 8,14 lá/chồi, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với B1 (8,66 lá/chồi). Ở nghiệm thức đối chứng B0, do ảnh hưởng của lượng auxin nội sinh, mẫu không tạo sẹo mà hình thành rễ.

3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến sự tạo rễ

Sau 30 ngày nuôi cấy chồi trên môi trường MS có bổ sung NAA ở các mức nồng độ khác nhau, quá trình phát sinh rễ được theo dõi:

Nghiệm thức NAA (mg/L) Số rễ trung bình (rễ/mẫu) Chiều dài rễ trung bình (cm)
C0 (ĐC) 0,0 1,81$^d$ ± 0,22 3,03$^a$ ± 0,13
C1 0,3 9,67$^c$ ± 0,22 0,49$^d$ ± 0,03
C2 0,5 10,62$^c$ ± 0,22 0,73$^b$ ± 0,04
C3 0,7 15,86$^a$ ± 0,80 0,85$^b$ ± 0,02
C4 1,0 13,24$^b$ ± 0,36 0,65$^c$ ± 0,02

(CV% của số rễ = 3,55%; chiều dài rễ = 4,17%. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,05).

Nghiệm thức C3 (0,7 mg/L NAA) đạt kết quả tối ưu nhất với số rễ trung bình là 15,86 rễ/mẫu và chiều dài rễ đạt 0,85 cm, hệ thống rễ phát triển to khỏe. Khi tăng nồng độ NAA lên 1,0 mg/L (C4), số lượng rễ giảm xuống còn 13,24 rễ/mẫu do nồng độ auxin cao bắt đầu gây ức chế sinh trưởng. Mặc dù nghiệm thức đối chứng C0 có chiều dài rễ dài nhất (3,03 cm) nhưng số lượng rễ rất ít (1,81 rễ/mẫu) và sợi rễ mỏng yếu.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tác giả tóm tắt các kết quả đạt được về quy trình khử trùng mẫu, môi trường nhân chồi và môi trường tạo rễ; đồng thời đề xuất 4 nhóm khuyến nghị nhằm tiếp tục hoàn thiện quy trình nhân giống.


Kết quả và đóng góp

1. Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

Nghiên cứu đã xác định được các công thức môi trường và thông số xử lý tối ưu cho từng giai đoạn nuôi cấy in vitro cây kỷ tử:

  • Giai đoạn khử trùng khởi đầu: Xử lý đốt thân qua 2 bước khử trùng bằng dung dịch Javel 30% trong 25 phút và Javel 20% trong 15 phút (có bổ sung Tween 20) kết hợp xử lý kháng sinh tetracyclin trong 15 phút đạt tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất là 75,35% sau 21 ngày nuôi cấy.
  • Giai đoạn nhân nhanh chồi: Môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA + 0,1 mg/L NAA + 0,8% agar + 3,0% sucrose là môi trường phù hợp nhất, cho hệ số nhân chồi đạt 2,67 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình đạt 1,89 cm, số lá trung bình đạt 8,14 lá/chồi sau 30 ngày nuôi cấy; chồi sinh trưởng mập khỏe.
  • Giai đoạn tạo rễ: Môi trường MS bổ sung 0,7 mg/L NAA là môi trường tối ưu cho quá trình ra rễ sau 30 ngày, tạo trung bình 15,86 rễ/mẫu với chiều dài rễ trung bình 0,85 cm, rễ phát triển đồng đều và khỏe mạnh.

2. Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Khảo sát quá trình khử trùng mẫu đốt thân ở nhiều thời điểm lấy mẫu khác nhau trong năm (mùa mưa, mùa nắng) và các độ tuổi chồi khác nhau để tăng tính ổn định của quy trình vô mẫu.
  • Tiếp tục thử nghiệm nhân chồi với các nồng độ BA cao hơn (> 2,0 mg/L) hoặc kết hợp các loại cytokinin khác (như Kinetin, TDZ) để tìm ngưỡng bão hòa và gia tăng hệ số nhân chồi.
  • Tiếp tục theo dõi quá trình thích nghi và tỷ lệ sống sót của cây con hoàn chỉnh khi chuyển từ ống nghiệm ra giá thể tại vườn ươm (giai đoạn thuần hóa ngoài đất).
  • Tối ưu hóa quy trình vi nhân giống và phân tích thành phần hóa thực vật của các bộ phận cây kỷ tử (đặc biệt là quả) khi canh tác trong điều kiện sinh thái tại Việt Nam.

3. Đóng góp khoa học và thực tiễn

Khóa luận đã cung cấp dẫn liệu thực nghiệm bước đầu về phản ứng sinh trưởng và phát sinh hình thái của cây kỷ tử (Lycium barbarum) trong điều kiện in vitro tại Việt Nam. Kết quả này bổ sung cơ sở dữ liệu kỹ thuật về nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BA, NAA) cho việc vi nhân giống loài dược liệu này thay cho các phương pháp nhân giống truyền thống.


Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm từ tháng 07/2022 đến tháng 12/2022 với một số hạn chế được tác giả tự xác định:

  • Thí nghiệm nhân chồi dừng lại ở nồng độ cao nhất là 2,0 mg/L BA mà chưa xác định được điểm cận trên (ngưỡng nồng độ gây độc hoặc ức chế phát sinh chồi của BA).
  • Chưa tiến hành giai đoạn 5 của quy trình vi nhân giống (giai đoạn huấn luyện, đưa cây con ra ngoài vườn ươm và đánh giá tỷ lệ sống trên đất).
  • Mẫu đốt thân lấy từ cây mẹ trồng ở nhà lưới chịu ảnh hưởng bởi biến động thời tiết, dẫn đến hệ số biến thiên về tỷ lệ sống sạch giữa các lần lặp lại còn ở mức 20,64%.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng dải nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA trên 2,0 mg/L và khảo sát thêm các nhóm cytokinin khác.
  • Hoàn thiện giai đoạn ra ngôi cây con ngoài vườn ươm trên các loại giá thể phối trộn khác nhau.
  • Định lượng hoạt chất sinh học (đặc biệt là polysaccharide) ở cây tái sinh in vitro sau khi trồng ngoài thực địa.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo trực tiếp cho sinh viên, học viên và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành:

  • Công nghệ Sinh học, Sinh học Ứng dụng: Tham khảo phương pháp thiết kế thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật (CRD đơn yếu tố, n=105 mẫu), kỹ thuật xử lý số liệu thống kê ANOVA bằng Minitab và chuyển đổi hàm arcsin.
  • Nông nghiệp, Dược liệu học: Tham khảo công thức nồng độ chất khử trùng Javel, tỷ lệ phối hợp hormone BA – NAA trong nhân chồi và tạo rễ cho các loài cây dược liệu thuộc họ Cà (Solanaceae).
  • Phần nội dung đáng chú ý: Bảng tổng hợp số liệu chi tiết và các quan sát về hình thái phát sinh chồi, rễ tại Chương 4 cùng quy trình khử trùng hai bước tại Chương 3.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình khử trùng mẫu đốt thân cây kỷ tử đạt hiệu quả cao nhất trong nghiên cứu này là gì?

Mẫu đốt thân kỷ tử được rửa xà phòng 2% (10 phút), lau cồn 70°, lắc cồn 70° (30 giây), sau đó khử trùng hai lần qua dung dịch Javel có bổ sung Tween 20: lần 1 dùng Javel 30% trong 25 phút và lần 2 dùng Javel 20% trong 15 phút. Cuối cùng, mẫu được xử lý bằng dung dịch kháng sinh tetracyclin trong 15 phút. Quy trình này đạt tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất là 75,35% sau 21 ngày.

2. Nồng độ BA và NAA nào tối ưu cho quá trình nhân chồi in vitro cây kỷ tử?

Môi trường tối ưu cho quá trình nhân chồi là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp với 0,1 mg/L NAA (cùng 0,8% agar và 3% sucrose). Sau 30 ngày nuôi cấy, môi trường này cho số chồi trung bình đạt 2,67 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình đạt 1,89 cm và số lá trung bình đạt 8,14 lá/chồi, chồi mập khỏe.

3. Tại sao ở thí nghiệm tạo rễ, nồng độ NAA 1,0 mg/L lại cho số rễ thấp hơn nồng độ 0,7 mg/L?

Khi nồng độ NAA tăng từ 0,3 mg/L đến 0,7 mg/L, số rễ trung bình tăng dần từ 9,67 lên mức cực đại là 15,86 rễ/mẫu. Tuy nhiên, khi tăng tiếp nồng độ NAA lên 1,0 mg/L, số rễ giảm xuống còn 13,24 rễ/mẫu do nồng độ auxin ngoại sinh quá cao vượt ngưỡng kích thích sinh lý, gây ra hiện tượng ức chế quá trình phát sinh và tăng trưởng của rễ bất định.

4. Tại sao mẫu đối chứng B0 (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) trong thí nghiệm tạo chồi lại xuất hiện rễ và không hình thành mô sẹo?

Mẫu nuôi cấy tại nghiệm thức B0 không được bổ sung BA và NAA ngoại sinh. Do tác động tự nhiên của lượng auxin nội sinh sẵn có trong mô đốt thân thực vật, mẫu đã cảm ứng hình thành rễ trực tiếp. Ngược lại, ở các nghiệm thức B1 đến B4 có sự phối hợp giữa cytokinin ngoại sinh (BA) và auxin (NAA), sự phân chia tế bào được kích thích mạnh tại vùng vết cắt tiếp xúc mặt thạch dẫn đến hình thành khối mô sẹo (callus).


Kết luận

Khóa luận của sinh viên Lê Thị Kim Yến đã hoàn thành việc khảo sát thực nghiệm các thông số cơ bản cho quy trình vi nhân giống cây kỷ tử (Lycium barbarum) trên môi trường MS. Nghiên cứu đã xác định được công thức khử trùng mẫu tối ưu bằng Javel 30% (25 phút) và Javel 20% (15 phút) đạt 75,35% mẫu sống sạch; môi trường nhân chồi tốt nhất là MS bổ sung 2,0 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA (2,67 chồi/mẫu); môi trường tạo rễ tốt nhất là MS bổ sung 0,7 mg/L NAA (15,86 rễ/mẫu). Toàn bộ dữ liệu được thu thập và xử lý thống kê rõ ràng, tạo cơ sở thực nghiệm hữu ích cho các nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây kỷ tử in vitro ở quy mô lớn hơn.