ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây dược liệu đã được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực ph m và mĩ ph m… Trong hệ thống các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, được dùng để bào chế làm thuốc chữa bệnh, trong đó có cây Kim tiền thảo. Đối với cây Kim tiền thảo thì mọi bộ phận của cây như: rễ, thân, lá đều có thể sử dụng được. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp, tăng bài tiết mật, giảm đau ống mật, tăng lưu lượng máu ở thận, tăng tuần hoàn máu não và các động mạch đùi… Song công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng, chữa bệnh trĩ, chữa viêm mật (Đỗ Tất Lợi, 1999). Tuy nhiên, hiện nay hầu hết nguồn dược liệu đều được nhập từ nước ngoài và chưa có nghiên cứu đầy đủ về nhân giống, gieo trồng, chế biến Kim tiền thảo nên năng suất và chất lượng còn hạn chế.
Để có nguồn dược liệu Kim tiền thảo chất lượng tốt, bền vững đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người đồng thời đảm bảo được hàm lượng và hoạt tính dược liệu trong sản ph m sau thu hoạch, cần phải có biện pháp hữu hiệu trong bảo tồn và phát triển loài dược liệu đa tác dụng này. Vì vậy, nhân giống loài Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro sẽ giúp tạo ra số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn, có thể đáp ứng nguồn giống cho các vùng sản xuất dược liệu, nhằm nâng cao thu nhập cho người dân và phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc. Mặt khác, để giám định hay định danh chính xác loài Kim tiền thảo phục vụ cho lựa chọn loài đưa vào nhân giống in vitro thì phương pháp ADN mã 2 vạch được cho là có độ tin cậy cao. Phương pháp ADN mã vạch đã trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài cả động vật và thực vật.
Với mục tiêubước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài nhằm đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong nhân giống Cây Kim tiền thảo tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống Cây Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo 1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr Tên khác: Đồng tiền lông, Mắt trâu, Vảy rồng, Dây sâm lông, Bươm bướm,Cỏ Đồng tiền vàng (Gold Money Herb , Cat’s foot, maiden-hair, ground ivy(Anh); Herbe de St-Jean, couronne de terre, lierre terrestre, rondette (Pháp).
Chi: Thóc lép (Desmodium) Họ: Đậu (Fabaceae Bộ: Đậu (Fabales Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta (https://thaoduocquy.net/products/kim-tien-thao) Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) Desmodium là một chi lớn thuộc họ Đậu với khoảng 350 loài thực vật đa số được sử dụng làm ngũ cốc và thảo dược. Hiện nay chỉ có khoảng 30 loài 4 được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tính chất hóa học và tác dụng sinh học (Nguyễn Minh Ngọc, 2013). Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo Kim tiền thảo là loại cây thân cỏ, mọc bò. Thân hình trụ, màu xanh hơi vàng, phủ đầy lông mịn màu vàng hoe.
Lá mọc so le, đơn hay kép lông chim lẻ gồm 1-3 lá chét, lá chét ở giữa to hơn 2 lá bên. Cuống lá dài 2-4 cm, hình trụ phù ở đáy, phủ đầy lông trắng. Hai lá kèm hình mũi mác, dài 6-9 mm, ngang 2-3 mm, nhiều gân dọc, đầy lông trắng mịn. Lá kèm con nhỏ, hình tam giác.
Lá chét có phiến tròn hoặc hơi xoăn, đường kính 2-4 cm, ít khi đến 5 cm, mép nguyên, đỉnh tròn hay tù hoặc chia 2 thùy cạn, đáy hình tim; mặt trên nhẵn, màu hơi vàng hoặc lục xám, mặt dưới mốc do phủ đầy lông mịn màu trắng, gân lá kiểu lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi, cuống lá dài 1-2 mm, phủ đầy lông trắng mịn. Hai lá chét bên có phần phiến hai bên gân giữa không đều nhau ở gốc,một bên to, một bên hơi nhỏ hơn.net/products/kim-tien-thao) Hình1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo Cụm hoa: Chùm dài đến 5 cm, thường ở ngọn cành ít khi ở nách những lá phía ngọn, mỗi mấu của chùm là một xim co gồm 2 hoa có chung một lá bắc, giữa 2 gốc cuống hoa có một u lồi nhỏ. Cụm hoa phủ đầy lông trắng mịn. 5 Hoa nhỏ, không đều, lưỡng tính, mẫu 5.
Hai cuống hoa của xim hướng ra hai bên sau đó xụ xuống trên quả. Quả loại đậu xụ xuống, mang đài tồn tại ở gốc, dẹp, dài 1,5 - 2 cm, ngang 3-4 mm, nhiều lông trắng mịn, chia thành 2 - 6 đốt. Cây thường được thu hái vào mùa hè thu, có thể dùng tươi hay phơi khô (Đỗ Tất Lợi, 1999); (Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương, 2000); (Võ Văn Chi, 1997). Đặc điểm sinh thái và phân bố Kim tiền thảo thích hợp với điều kiện nhiệt độ nóng m hoặc m mát, đất ít chua, có thành phần cơ giới trung bình, m và thoát nước nhưng cũng chịu được đất chua, nghèo xấu và khô hạn.
Ưa sáng nhưng cũng chịu được bóng râm, sống lưu niên, tái sinh hạt, chồi gốc, chồi thân, chồi cành đều khỏe (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999). Phân bố địa lý: Cây Kim tiền thảo là một loại dược liệu mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Nhật Bản… Tại Việt Nam, cây phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi. Thường gặp ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình và Hải Phòng (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999). Giá trị dược liệu Theo Đông y đây là một loại cây có vị ngọt, tính hàn.
Trong dân gian cây Kim tiền thảo được dùng thanh nhiệt, lợi thủy, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp. Nhưng công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng… Đối với hệ tim mạch, Kim tiền thảo làm tăng lưu lượng mạch vành,hạ huyết áp, làm tim đập chậm, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim. Tác dụng hạ huyết áp do sự kích thích các thụ thể cholinergic vàsự phóng bế các thụ thể adrenergic.
Các nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh được rằng 6 thành phần flavonoid trong Kim tiền thảo có tác dụng rất tốt trong việc làm hạ huyết áp ở những người huyết áp cao. Bên cạnh đó,Kim tiền thảo cũng có tác dụng đối kháng với các triệu chứng do pituitrin gây giảm lưu lượng mạch vành, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ ôxy của cơ tim (Đoàn Thị Nhu, 2013). Đặc biệt hoạt chất soyasaponin I chứa trong Kim tiền thảo đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận. Cao Kim tiền thảo thí nghiệm trên động vật có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi can xi axalat ở thận do thành phần polysacchorid chứa trong cao có tác dụng này và đồng thời làm tăng lượng bài tiết nước tiểu, ngoài ra còn có tác dụng tăng cường sự tiết mật (Đoàn Thị Nhu, 2013).
Các nghiên cứu về hóa sinh học, dược học của cây Kim tiền thảo Zhou C và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu phương pháp đánh giá chất lượng của Desmodium styracifolium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện mảng photodiode và phương pháp quang phổ khối ion hóa song song. Desmodium styracifolium, với C-flavone glycosides là hợp chất hiệu quả dược lý chính, là một loại thảo dược phổ biến của Trung Quốc và đã được sử dụng để điều trị rối loạn tiểu tiện, sỏi tiết niệu, phù và vàng da. Xuehai Wang và cộng sự (2013 đã công bố liên quan đến lĩnh vực y học cổ truyền Trung Quốc, đặc biệt là viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium, một phương pháp điều chế viên nang và sử dụng viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium trong chế ph m thuốc điều trị sỏi tiết niệu. Điều chế viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium với tỷ lệ hòa tan cao, tác dụng lâm sàng đáng chú ý, tác dụng phụ nhẹ và hiệu quả điều trị tốt cho bệnh sỏi tiết niệu, đặc biệt đối với sỏi vùng chậu thận và sỏi niệu quản(https://patents.com/patent/CA2931528A1/en).
Nghiên cứu của Zhou J. và cộng sự (2018) cho thấy flavonoid tổng số của D. styracifolium làm suy yếu sự hình thành của sỏi niệu canxi oxalat do hydroxy-L-proline gây ra ở chuột. styracifolium được coi là một loại thuốc 7 thảo dược Trung Quốc, đã được báo cáo để điều trị các bệnh sỏi thận.
Tuy nhiên, các thành phần hoạt động hóa học tiềm năng và các cơ chế cơ bản liên quan đến hiệu quả của nó trong việc nhắm mục tiêu sỏi tiết niệu vẫn còn tiếp tục được làm sáng tỏ. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng chống tiết niệu của flavonoid tổng số của D. styracifolium (TFDS trên sỏi thận canxi oxalat (CaOx)trên chuột Sprague-Dawley. Kết quả chứng minh rằng TFDS có tác dụng có lợi trong việc ức chế sự hình thành CaOx ở thận chuột có thể thông qua sự kết hợp của các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm, kiềm hóa nước tiểu và làm giảm nồng độ các thành phần tạo sỏi trong nước tiểu.
Do đó, TFDS có thể có ý nghĩa lâm sàng trong việc ngăn ngừa tổn thương tế bào thận oxy hóa và cuối cùng là hình thành sỏi thận. Dữ liệu cung cấp một lý do cho việc sử dụng TFDS trong điều trị bệnh sỏi thận và xác định tác nhân này là một nguồn tiềm năng của thuốc chống lợi tiểu mới(Zhou J.và cộng sự, 2018). và cộng sự (2018 cũng tiến hành nghiên cứu tổng flavone của D. styracifolium làm giảm bớt apoptosisvà autophagy của các tế bào HK-2 gây ra bởi COM bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường p38/MAPK.
Mục đích của nghiên cứu là điều tra cơ chế tổng flavone của D. styracifolium (TFDS trong việc điều chỉnh sự hình thành của nước tiểu.