Luận văn thạc sĩ xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms

Luận văn: Xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng LC-MS/MS. Nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để phát hiện Ochratoxin hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà Bình
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Xác Định Ochratoxin Trong Thực Phẩm Bằng Phƣơng Pháp Sắc Ký Lỏng Khối Phổ (LC-MS/MS)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan Ochratoxin và vai trò của phương pháp LC MS MS

Ochratoxin là một nhóm các độc tố nấm mốc (mycotoxin) nguy hiểm, được sinh ra bởi các chủng nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Chúng có khả năng nhiễm vào nhiều loại nông sản như ngũ cốc, cà phê, và các sản phẩm chế biến. Trong số các loại ochratoxin, Ochratoxin A (OTA) là loại phổ biến và độc tính cao nhất, được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2B, có khả năng gây ung thư cho người. Sự tồn tại của độc tố này trong chuỗi thực phẩm là một mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, gây ra các bệnh về thận và gan. Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích nhạy, chính xác để xác định Ochratoxin là vô cùng cấp thiết. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) nổi lên như một công cụ phân tích hiện đại và hiệu quả, cho phép phát hiện và định lượng Ochratoxin ở nồng độ rất thấp với độ tin cậy cao, đáp ứng các yêu cầu khắt khe về an toàn vệ sinh thực phẩm.

1.1. Phân loại tính chất và cơ chế gây độc của Ochratoxin

Ochratoxin bao gồm nhiều loại, trong đó Ochratoxin A (OTA) và Ochratoxin B (OTB) là hai đối tượng chính được quan tâm trong nghiên cứu này. OTA có cấu trúc phân tử chứa một nguyên tử Clo, làm tăng độc tính so với OTB (không chứa Clo). Đây là những hợp chất tinh thể không màu, bền với nhiệt nhưng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng hoặc trong môi trường kiềm. Chúng tan tốt trong dung môi hữu cơ phân cực và có khả năng phát huỳnh quang dưới tia UV, một đặc tính được ứng dụng trong một số phương pháp phân tích. Cơ chế gây độc chính của Ochratoxin là ức chế quá trình tổng hợp protein trong tế bào, ảnh hưởng đến chức năng của các cơ quan quan trọng như gan và thận. Luận văn của tác giả Nguyễn Thị Hà Bình trích dẫn, độc tố này "ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tARN) và các axitamin", dẫn đến tổn thương tế bào và là tác nhân gây ung thư.

1.2. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật LC MS MS hiện đại

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) là sự kết hợp giữa hai kỹ thuật mạnh mẽ: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ hai lần (MS/MS). Hệ thống HPLC có nhiệm vụ tách các hợp chất trong hỗn hợp mẫu dựa trên sự tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh (thường là cột C18) và pha động. Sau khi được tách, các chất phân tích sẽ đi vào hệ thống khối phổ. Tại đây, chúng được ion hóa (ví dụ bằng kỹ thuật ESI - ion hóa phun điện tử), sau đó được phân mảnh và phân tích dựa trên tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z). Ưu điểm vượt trội của LC-MS/MS là độ nhạy và độ chọn lọc rất cao. Kỹ thuật này không chỉ xác định chất dựa vào thời gian lưu như HPLC thông thường mà còn khẳng định cấu trúc thông qua việc xác định ion mẹ và các ion con đặc trưng, giúp loại bỏ hoàn toàn các kết quả dương tính giả do ảnh hưởng của nền mẫu phức tạp.

II. Thách thức trong việc kiểm soát Ochratoxin trong thực phẩm

Việc kiểm soát Ochratoxin trong chuỗi cung ứng thực phẩm đối mặt với nhiều thách thức lớn. Thứ nhất, độc tố này có thể hình thành từ giai đoạn canh tác, thu hoạch cho đến bảo quản và chế biến, khiến việc ngăn chặn sự nhiễm bẩn trở nên khó khăn. Thứ hai, Ochratoxin rất bền với nhiệt, các quy trình chế biến thông thường như nấu, nướng không thể loại bỏ hoàn toàn độc tố. Thứ ba, chúng tồn tại ở nồng độ rất thấp (vết hoặc siêu vết, tính bằng phần tỷ - ppb), đòi hỏi các phương pháp phân tích phải có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cực kỳ nhạy. Các phương pháp truyền thống như ELISA hay HPLC-RF (detector huỳnh quang) tuy có giá trị nhưng vẫn tồn tại những hạn chế về độ đặc hiệu và có thể bị ảnh hưởng bởi nền mẫu. Do đó, việc xây dựng một phương pháp chuẩn, có độ tin cậy pháp lý cao như LC-MS/MS là yêu cầu bắt buộc để bảo vệ người tiêu dùng và đáp ứng các tiêu chuẩn xuất khẩu.

2.1. Giới hạn dư lượng tối đa MRL cho phép của Ochratoxin A

Để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, nhiều quốc gia và tổ chức đã ban hành các quy định nghiêm ngặt về giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL) của Ochratoxin A trong thực phẩm. Theo luận văn, Việt Nam cũng đã có quy định cụ thể. Bảng 1.1 trong tài liệu gốc chỉ rõ: MRL đối với ngũ cốc chưa qua chế biến là 5 µg/kg, hạt cà phê rang là 5 µg/kg, rượu vang là 2 µg/kg và đặc biệt nghiêm ngặt với thực phẩm dành cho trẻ em là 0,5 µg/kg. Việc tuân thủ các MRL này đòi hỏi hệ thống kiểm nghiệm phải có khả năng định lượng chính xác Ochratoxin ở nồng độ rất thấp, đặt ra yêu cầu cao về năng lực phân tích của các phòng thí nghiệm.

2.2. Hạn chế của các phương pháp phân tích truyền thống

Trước khi LC-MS/MS trở nên phổ biến, các phương pháp như ELISA và HPLC với detector huỳnh quang (RF) đã được sử dụng rộng rãi. Phương pháp ELISA có ưu điểm nhanh, đơn giản nhưng dễ cho kết quả dương tính hoặc âm tính giả do phản ứng chéo. Phương pháp HPLC-RF có độ nhạy tốt, nhưng việc xác định chất chỉ dựa vào thời gian lưu. Trong các nền mẫu phức tạp như ngũ cốc hay gia vị, nhiều hợp chất khác có thể có cùng thời gian lưu với Ochratoxin, dẫn đến sai sót trong định lượng. Luận văn nêu rõ, "nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định đúng đắn chất cần phân tích". Điều này nhấn mạnh sự cần thiết của một phương pháp có khả năng khẳng định cấu trúc như LC-MS/MS.

III. Hướng dẫn tối ưu điều kiện máy LC MS MS xác định Ochratoxin

Để đạt được độ nhạy và độ chính xác cao nhất, việc tối ưu hóa phương pháp trên hệ thống LC-MS/MS là bước không thể thiếu. Quá trình này bao gồm hai phần chính: tối ưu các thông số của máy khối phổ (MS/MS) và tối ưu điều kiện chạy sắc ký lỏng (HPLC). Mỗi thông số, từ thế ion hóa, năng lượng va chạm đến thành phần pha động, đều có ảnh hưởng trực tiếp đến tín hiệu phân tích và khả năng tách các chất. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà Bình đã thực hiện một cách có hệ thống việc khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu để phân tích đồng thời Ochratoxin A và Ochratoxin B, tạo ra một quy trình phân tích mạnh mẽ và đáng tin cậy. Việc tối ưu hóa này không chỉ giúp tăng cường tín hiệu của chất phân tích mà còn giảm thiểu nhiễu nền, từ đó cải thiện đáng kể giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp.

3.1. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS MS

Quá trình tối ưu khối phổ bắt đầu bằng việc xác định ion mẹ ([M-H]⁻) và các ion con đặc trưng cho từng chất. Trong nghiên cứu, kỹ thuật ion hóa phun điện tử ở chế độ ion âm (ESI⁻) được lựa chọn. Ochratoxin A (khối lượng phân tử 403) có ion mẹ là m/z 402, trong khi Ochratoxin B (khối lượng phân tử 369) có ion mẹ là m/z 368. Sau khi xác định được ion mẹ, các thông số quan trọng như thế đầu vào (DP), năng lượng va chạm (CE) và thế ra khỏi buồng va chạm (CXP) được khảo sát để tìm ra cặp ion con cho tín hiệu mạnh nhất. Bảng 3.2 và 3.3 trong luận văn đã liệt kê chi tiết các giá trị tối ưu, ví dụ, với OTA, năng lượng va chạm (CE) tối ưu cho các mảnh ion con là -24V và -35V. Việc lựa chọn chính xác các thông số này là chìa khóa để đảm bảo độ chọn lọc và độ nhạy của phép phân tích.

3.2. Lựa chọn pha động và chương trình gradient cho HPLC

Việc tách tốt Ochratoxin A và Ochratoxin B ra khỏi các tạp chất trong nền mẫu phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống sắc ký lỏng. Nghiên cứu đã sử dụng cột C18 (pha đảo) và khảo sát các thành phần pha động khác nhau. Kết quả cho thấy, hệ pha động bao gồm kênh A là dung dịch đệm amoniacetat (CH₃COONH₄) 10mM và kênh B là Methanol (MeOH) cho tín hiệu cao và hình dạng pic đẹp nhất. Để rút ngắn thời gian phân tích và cải thiện hiệu quả tách, một chương trình rửa giải gradient đã được xây dựng. Chương trình này thay đổi tỷ lệ của kênh A và B theo thời gian, bắt đầu với tỷ lệ dung môi yếu (nhiều nước hơn) và tăng dần tỷ lệ dung môi mạnh (MeOH). Chương trình gradient tối ưu được trình bày trong Bảng 3.7, giúp rửa giải các chất phân tích trong khoảng 10 phút với các pic sắc nhọn và tách biệt hoàn toàn.

IV. Bí quyết xử lý mẫu hiệu quả để phân tích Ochratoxin

Giai đoạn xử lý mẫu được xem là bước quan trọng và thường tốn nhiều thời gian nhất trong quy trình phân tích, quyết định trực tiếp đến độ chính xác và độ thu hồi của phương pháp. Mục tiêu của xử lý mẫu là chiết rút hoàn toàn Ochratoxin ra khỏi nền mẫu thực phẩm phức tạp (như ngũ cốc, rượu) và loại bỏ tối đa các tạp chất có thể gây nhiễu. Một quy trình xử lý mẫu tốt phải đảm bảo hiệu suất chiết cao, độ lặp lại tốt và ít tốn kém dung môi, hóa chất. Luận văn đã tiến hành khảo sát chi tiết nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này, từ việc lựa chọn dung môi chiết, kỹ thuật làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE), đến ảnh hưởng của pH, nhằm xây dựng một quy trình tối ưu, phù hợp cho việc phân tích Ochratoxin A và Ochratoxin B bằng LC-MS/MS.

4.1. Lựa chọn dung môi và tối ưu hóa quy trình chiết

Nghiên cứu đã so sánh ba quy trình chiết khác nhau sử dụng các dung môi như Chloroform (CHCl₃), NaHCO₃, và Ethyl acetate. Kết quả từ Bảng 3.8 cho thấy quy trình sử dụng Chloroform kết hợp với dung dịch NaHCO₃ 1% cho độ thu hồi cao nhất, đạt 84% đối với OTA và 78% đối với OTB. Việc khảo sát sâu hơn về thể tích dung môi chiết cho thấy, chiết lặp 2 lần, mỗi lần với 15 ml CHCl₃, là tối ưu để đảm bảo chiết kiệt chất phân tích mà vẫn tiết kiệm dung môi. Quá trình này giúp tách Ochratoxin ra khỏi nền mẫu một cách hiệu quả, tạo điều kiện thuận lợi cho bước làm sạch tiếp theo.

4.2. Kỹ thuật chiết pha rắn SPE để làm sạch mẫu hiệu quả

Sau khi chiết, dịch chiết vẫn còn chứa nhiều tạp chất. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được áp dụng để làm sạch và cô đặc chất phân tích. Luận văn đã so sánh hiệu quả giữa cột SPE C18 và cột HLB, kết quả cho thấy cột C18 cho hiệu suất thu hồi tốt hơn (86% cho OTA) do phù hợp với bản chất ít phân cực của Ochratoxin. Các điều kiện của quá trình SPE như tốc độ dòng, thể tích dung môi rửa giải cũng được tối ưu hóa. Tốc độ nạp mẫu và rửa giải được chọn là 1 ml/phút và thể tích dung môi rửa giải (MeOH-acid acetic) là 2 ml để đảm bảo Ochratoxin được giữ lại và giải hấp hoàn toàn khỏi cột, giúp dịch chiết cuối cùng sạch và phù hợp để tiêm vào hệ thống LC-MS/MS.

4.3. Tối ưu ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi Ochratoxin

Giá trị pH của môi trường chiết có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi. Ochratoxin là một axit yếu, trạng thái ion hóa của nó phụ thuộc vào pH. Nghiên cứu đã khảo sát hiệu suất chiết trong khoảng pH từ 1 đến 10. Kết quả (Hình 3.8) cho thấy hiệu suất chiết Ochratoxin vào dung môi cloroform đạt cao nhất trong môi trường axit mạnh (pH 1-2). Điều này được giải thích là do ở pH thấp, Ochratoxin tồn tại ở dạng phân tử trung hòa về điện, giảm độ phân cực và dễ dàng hòa tan vào dung môi hữu cơ không phân cực như cloroform. Việc axit hóa mẫu không chỉ cải thiện độ thu hồi mà còn giúp làm ẩm cơ chất, hỗ trợ quá trình chiết diễn ra triệt để hơn.

V. Kết quả thẩm định và ứng dụng phương pháp LC MS MS thực tế

Sau khi xây dựng và tối ưu hóa toàn bộ quy trình từ xử lý mẫu đến phân tích trên máy, bước tiếp theo là thẩm định phương pháp để chứng minh tính hiệu quả và độ tin cậy của nó. Thẩm định phương pháp là quá trình đánh giá các thông số quan trọng như độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và độ chính xác (độ đúng, độ chụm). Các kết quả thẩm định này khẳng định rằng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng hoàn toàn đáp ứng các yêu cầu phân tích lượng vết. Cuối cùng, phương pháp được áp dụng để phân tích các mẫu thực phẩm thực tế thu thập trên thị trường, cung cấp những dữ liệu quý giá về tình hình ô nhiễm Ochratoxin trong ngũ cốc và rượu tại Việt Nam, cho thấy tính ứng dụng cao của nghiên cứu.

5.1. Xác định giới hạn phát hiện LOD và định lượng LOQ

Một trong những chỉ số quan trọng nhất của một phương pháp phân tích lượng vết là giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). LOD là nồng độ thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện được sự có mặt của chất phân tích, trong khi LOQ là nồng độ thấp nhất có thể định lượng một cách chính xác. Bảng 3.14 của luận văn cho thấy kết quả thẩm định rất ấn tượng: LOD và LOQ đối với Ochratoxin A lần lượt là 0.2 µg/kg và 0.5 µg/kg; đối với Ochratoxin B là 0.3 µg/kg và 0.8 µg/kg. Các giá trị này thấp hơn nhiều so với mức MRL do Bộ Y tế quy định, chứng tỏ phương pháp có đủ độ nhạy để kiểm soát ô nhiễm Ochratoxin trong thực phẩm.

5.2. Phân tích hàm lượng Ochratoxin trên các mẫu thực tế

Để kiểm chứng tính thực tiễn, phương pháp đã được áp dụng để phân tích các mẫu ngũ cốc (ngô, lạc) và rượu thu thập tại Hà Nội và một số tỉnh thành. Kết quả cho thấy sự hiện diện của Ochratoxin trong một số mẫu. Đáng chú ý, sắc ký đồ từ Hình 3.21 và 3.22 cho thấy có mẫu lạc và mẫu ngô bị nhiễm Ochratoxin A và Ochratoxin B. Điều này một lần nữa khẳng định tính cấp thiết của việc kiểm soát chặt chẽ độc tố nấm mốc trong nông sản. Việc áp dụng thành công phương pháp trên mẫu thực tế chứng tỏ quy trình đã xây dựng không chỉ có giá trị học thuật mà còn có khả năng ứng dụng cao trong công tác kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng. Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có các vụ ngộ độc mycotoxin đặc biệt nghiêm trọng …đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm về các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây trên cả nước: - Năm 2009: Toàn quốc xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, có 5026 người mắc; 3958 người nhập viện; 33 người tử vong. - Năm 2010: Tình hình NĐTP trong năm 2010 phức tạp.

Toàn quốc đã xảy ra 175 vụ ngộ độc trong đó có 34 vụ ngộ độc trên 30 người làm 5664 người mắc 42 trường hợp tử vong, so sánh với số liệu trung bình trên năm của giai đoạn 2006- 2009, số vụ ngộ độc giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% và số tử vong giảm 19,2%. - Năm 2011: 148 vụ, 4700 người mắc, 27 người tử vong. - Năm 2012: 168 vụ, 5541 người mắc, 34 người tử vong. Theo TS Trần Quang Trung, Cục trưởng Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong 9 tháng của năm 2013, cả nước đã có 108 vụ ngộ độc thực phẩm làm hơn 2.800 người mắc, trong đó có 18 ca tử vong.

Trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm được thống kê trong quý III này thì nguyên nhân do vi sinh vật là 23 vụ, do độc tố tự nhiên 4 vụ, do hóa chất 2 vụ và 11 vụ chưa xác định được nguyên nhân. Các vụ ngộ độc xảy ra khắp nơi, từ gia đình riêng đến tập thể. Ochratoxin là một loại độc tố được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng.

Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin nó không gây ngộ 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc gia cầm và con người. Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là Mycotoxin. Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nấm mốc , được hình thành khi nấm chuyển hóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu. Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào đó.

Tùy vào địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới , nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao. Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiê ̣p ở Viê ̣t Nam tình tra ̣ng nhiễm đô ̣c tố nấ m mố c là khá phổ biến. Sự hình thành nấm mốc và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi.

Như vậy, không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người. Để kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ ochratoxin ở lượng vết hay siêu vết. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích, chúng tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”.

Mục tiêu của thực hiện đề tài nghiên cứu là: 1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: - Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình - Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu. - Thẩm định phương pháp đã xây dựng. Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.

10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.Giới thiệu chung [14-15] 1.Định nghĩa Độc tố ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm mốc. Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê. trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước. Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi.

Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa bị nhiễm A. Ở Đức tìm thấy Ochratoxin thường xuyên trong thịt. Ở Anh, chúng được tìm thấy trong đậu nành, bắp bột, ca cao.Nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% ở hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg ở 47 mẫu café được nhập vào Nhật Bản từ các nước Nam Phi , và một số nước ASIAN.

Tại Việt Nam, nghiên cứu tiến hành trên 123 mẫu ngô của 2 xã Cán Tỷ và Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Kết quả cho thấy: trong 123 mẫu ngô được phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát hiện có ochratoxin A, trong số đó có 2 mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định của Bộ Y tế. Cho tới nay đã phát hiện được 3 loại ochratoxin khác nhau. Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến ochratoxin A và B Ochratoxin A Ochratoxin B Hình 1.1: Cấu trúc các Ochratoxins 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình 1.Tính chất hóa lý của Ochratoxins Ochratoxins là đốc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như chloroform, methanol, …, ít tan trong nước và tan trong đệm carbonat loãng).

Ochratoxins rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Độc tố được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-250C. Sự sản sinh ochratoxins phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. Ochratoxins dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa.

Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm. Ochratoxin A có điểm nóng chảy ở 1690C. Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các píc có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 và pKa2 = 7,0- 7,3. Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC) chiếu tia UV ở 366nm.

Ochratoxin B có trọng lượng phân tử 369,37. Ochratoxin B có thể phát huỳnh quang màu xanh khi chiếu tia UV bước sóng 318 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2210C. Cơ chế tác động của ochratoxins: ochratoxins gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tARN) và các axitamin.

Ochratoxins còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine - tARN ở gan. Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể. Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ức chế tế bào lympho. Ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tARN tương ứng ochratoxin A gây ức chế hydroxylase phenylalanine, một nửa phenylalanine của ochratoxin A là một phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể.

Ochratoxin ức chế sự tổng hợp ARN làm ảnh hưởng đến các protein trong vòng tuần hoàn. Tác động đến các tế bào màng ti thể và gây ra các hiệu ứng khác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành ADN trong thận, gan và lá lách. Các ADN này là các sợi đơn bị phá vỡ.

Các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố này như cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê. Dư lượng ochratoxin cũng được tìm thấy trong thịt heo và thịt gia 12 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình cầm. Độc tố này gây hại đến gan và thận động vật. Với nồng độ lớn hơn 1 ppm có thể làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ, nồng độ lớn hơn 5 ppm có thể gây nên những tổn thương ở gan và ruột.

Tương tự như Aflatoxin, độc tố này cũng gây nên sự giảm sức đề kháng và là tác nhân gây ung thư ở người. - Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác định sự ngộ độc Ochratoxin đều có bệnh tích giống nhau ở chỗ gan bị hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà tình trạng bệnh trên gan khác nhau. Biểu hiện chung là ban đầu gan động vật (điển hình là gà) biến thành màu vàng tươi, mật sưng sau đó gan sưng phồng và bắt đầu nổi các mụn nhỏ trên bề mặt làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng, sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở và dễ vỡ - Thận sưng to làm cho việc đào thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên hết sức khó khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể, có thể gây tử vong cho động vật.

Khi nhiễm độc ochratoxin cơ thể rất mẫn cảm với các loại bệnh thông thường - Bào mòn niêm mạc của ống tiêu hóa do lớp tế bào niêm mạc bị chết bong ra và bị khô lại hình thành nên một lớp màng bọc làm cản trở sự chuyển thức ăn đi trong ống tiêu hóa - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường gây rối loạn sinh sản. Ở thú mang thai có thể gây chết thai.