MỞ ĐẦU Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI được thành lập năm 1984 theo quyết định số 58 NN-TCCB/QĐ ngày 28 tháng 3 năm 1984 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và PTNT. Ngoài nhiệm vụ kiểm nghiệm thuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm là nơi lưu giữ giống vi sinh vật thú y để phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn đoán cũng như chế tạo vắc xin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và được nhập từ nước ngoài. Hiện nay, Trung tâm lưu trữ và bảo tồn 48 chủng giống vi sinh vật thú y. Phần lớn các giống vi sinh vật thú y này có xuất xứ từ Trung Quốc, một số khác do cán bộ thú y mang từ nước ngoài về theo con đường không chính thức (hoặc chính thức) và một số do Viện Thú y, Trung tâm Chẩn đoán thú y quốc gia cung cấp.
Do sự eo hẹp về kinh phí, hàng năm Trung tâm chỉ có thể bảo tồn giống vi sinh vật bằng các phương pháp truyền thống rồi đông khô, lưu giữ. Gần như tất cả các giống vi sinh vật hiện có chưa được giám định đầy đủ về kháng nguyên tính, độc lực, tính ổn định và cấu trúc gen một cách có hệ thống. Những năm gần đây, do sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học phân tử. Các chủng vi sinh vật được lưu giữ tại Trung tâm đã và đang được tiêu chuẩn hoá, dần dần tiệm cận với chuẩn hoá của quốc tế.
Trước đây, nhưng nghiên cứu virus viêm gan vịt chỉ dừng ở mức độ lâm sàng, bệnh tích, chẩn đoán virus học và sản xuất vắc xin truyền thống để phòng chống (OIE, 2008). Tuy nhiên, trong vòng 5 năm nay, virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt trên thế giới gồm ba genotype khác nhau: Genotype I (DHAV- 1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Tại Việt Nam, chủng virus viêm gan vịt đang lưu giữ từ trước tới nay mới chỉ xác định được virus gây bệnh viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1).
Việc xác định chủng virus thuộc genotype I như đã công bố hay đã biến đổi hoặc có những khác biệt so với các chủng trên thế giới? 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin". Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu: Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Ứng dụng chủng cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt. Nội dung nghiên cứu: 1.
Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc (gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định, tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ. Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường độc bằng chủng cường độc viêm gan vịt. Những đóng góp mới của luận văn: Là nghiên cứu về sinh học phân tử và giải mã hệ gen virus đầy đủ và chi tiết nhất của chủng virus cường độc viêm gan vịt thuộc nguồn gen quốc gia.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT 2. Lịch sử và phân bố bệnh Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi.
Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn. Cách đây hơn chục năm, virus viêm gan vịt được xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae và việc xếp loại được dựa mối quan hệ về huyết thanh học, bao gồm 3 serotype khác nhau là DHV-1, DHV-2 và DHV-3. Trong đó, phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt serotype 1 (DHV-1) (Fabricant, Levine, 1957 ; Levine et al., 1950; Asplin, 1965; 1970 ; Toth, 1969; Haider, Calnek, 1979). Virus viêm gan vịt serotype 2 và serotype 3 mới được tìm thấy ở Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không đáng kể (Woolcock, 2003).
Virus viêm gan vịt serotype 1 còn được gọi chung là virus viêm gan vịt. Ngày nay, nhờ công nghệ sinh học phân tử, đã xác định virus gây bệnh viêm gan vịt trên thế giới gồm có 3 genotype khác nhau, bao gồm genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Phổ biến nhất là virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay, virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm 15 chủng vừa phân lập ở Trung Quốc và Hàn Quốc. Bệnh có biểu hiện đặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng.
Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử. Bệnh viêm gan do virus ở vịt (Duck Hepatitis Virus) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945), nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant theo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island (Mỹ) và có tới 70 trại vịt lớn mắc bệnh gây thiệt hại nặng nề. Ban đầu ở những trại mắc bệnh nặng tỷ lệ chết lên tới 95%, thời điểm cuối ổ dịch ở một số trại còn sót lại khi vịt mắc bệnh tỷ lệ chết giảm dần chỉ còn 15%.
Tổng số vịt chết trong ổ dịch lên tới 75. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hình ảnh vịt chết khi Hình 2. Gan vịt xuất huyết khi nhiễm virus viêm gan vịt mắc bệnh (Nguồn: Nanovet) (Nguồn:www.vn) Năm 1950, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant đã phân lập được virus viêm gan vịt type I (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002).
Năm 1953, bệnh xảy ra trên các ñàn vịt xảy ra ở các vùng khác của nước Mỹ. Sau đó bệnh cũng được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới: Anh, Canada, Niderland, Ai Cập và Tây Ban Nha, ở Bỉ. Ở Liên Xô cũ bệnh được xác định trên lãnh thổ Ucraina và nước cộng hoà Nga. Ở Mỹ, Canada, Anh bệnh viêm gan vịt con thuộc bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải đăng ký như bệnh Newcastle (Nguyễn Xuân Bình, 1995).
Năm 1956, bệnh tiếp tục được phát hiện ở bang Massachuset, Illinois và Michigan; sau đó bệnh xảy ra trên khắp cả nước Mỹ. Năm 1965, ở Norfolk (Anh) hiện tượng bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra trên những đàn vịt con đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc viêm gan vịt serotype 1. Bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus typ I, tỉ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30%. Haider và Calnek đã đặt tên virus này là virus viêm gan vịt typ III và cho đến nay virus viêm gan vịt typ III mới chỉ được công bố ở Mỹ (Haider và Calnek, 1979).
Ở Trung Quốc, virus viêm gan vịt lần đầu tiên được phân lập và xác nhận năm 1982 (Guo, Pan, 1984). Theo các báo cáo gần đây nhất, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, trong đó có cả Trung Quốc và Triều Tiên (OIE, 2003). 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới Có nhiều phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu xác định virus viêm gan vịt (Toth, 1969; Rispens, 1969), đặc biệt là sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu (hemagglutination test, HA), phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA).
Gần đây, khoa học ngày càng phát triển với nhiều phương pháp mới hiện đại hơn, chính xác hơn trong nghiên cứu sâu về sinh học phân tử virus Viêm gan vịt. Phổ biến hơn cả là phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác virus gây bệnh cũng như nghiên cứu sâu về sinh học phân tử của virus. Đến nay, bệnh Viêm gan vịt do virus serotype 1 (còn được gọi là virus Viêm gan vịt) đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam.1 Đường xâm nhập và cách lây lan Virus Viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao (100%). Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950).
Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh Viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con; có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày. Bệnh Viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958). Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân trong 8 tuần.
Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961). Chuột cống nâu có thể là vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type I. Ở loại động vật này virus được thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau ñó ñược bài tiết ra bênh ngoài trong khoảng thời gian 18 – 22 ngày sau khi nhiễm. Trong huyết thanh của chuột có kháng thể và kháng thể tồn tại 12 – 24 ngày.
Priz, 1973 đã gây bệnh cho vịt con bằng đường gây nhiễm qua không khí. Trong các trường hợp này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường hô hấp trên (Priz, 1973). Có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống (Asplin, 1958).