Luận văn thạc sĩ VNU UET: Dự đoán ức chế bệnh từ các biểu diễn RNA

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnu uet các phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên các biểu diễn khác nhau của rna và, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Phạm Thị Mai Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Ngọc Thăng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ thông tin
• Đề tài: Các Phương Pháp Dự Đoán Khả Năng Ức Chế Bệnh Dựa Trên Các Biểu Diễn Khác Nhau Của RNA Và Ứng Dụng
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH CỦA RNA
• 1.1. Tổng quan RNA can thiệp (RNAi)
• 1.2. Cơ chế can thiệp RNAi
• 2. CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH CỦA RNA
• 3. CHƯƠNG 3: CÁC CÁCH THỨC BIỂU DIỄN RNA
• 4. CHƯƠNG 4: ĐÁNH GIÁ THỰC NGHIỆM CÁC MÔ HÌNH DỰ ĐOÁN KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH CỦA SIRNA THEO CÁC BIỂU DIỄN DỮ LIỆU KHÁC NHAU
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về luận văn thạc sĩ VNU UET và RNA

Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu về các phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên các biểu diễn khác nhau của RNA. Nghiên cứu này không chỉ mang lại hiểu biết sâu sắc về RNA mà còn mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ thông tin trong y học. Việc hiểu rõ về RNA và khả năng ức chế bệnh của nó là rất quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Giới thiệu về RNA và vai trò của nó trong y học

RNA (axit ribonucleic) đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tải thông tin di truyền và điều hòa biểu hiện gen. Các loại RNA như mRNA, tRNA và rRNA có chức năng khác nhau, nhưng đều góp phần vào quá trình tổng hợp protein. Việc nghiên cứu RNA giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý và phát triển các phương pháp điều trị mới.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu RNA trong điều trị bệnh

Nghiên cứu RNA không chỉ giúp phát hiện các cơ chế bệnh lý mà còn mở ra cơ hội cho các liệu pháp gen. Các phương pháp như RNA can thiệp (RNAi) đã chứng minh hiệu quả trong việc ức chế các gen gây bệnh, từ đó tạo ra những bước tiến mới trong y học hiện đại.

II. Thách thức trong việc dự đoán khả năng ức chế bệnh từ RNA

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu RNA, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc dự đoán khả năng ức chế bệnh. Các yếu tố như độ chính xác của mô hình, sự đa dạng của RNA và các yếu tố môi trường đều ảnh hưởng đến kết quả dự đoán. Việc tìm ra các phương pháp hiệu quả để giải quyết những thách thức này là rất cần thiết.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của mô hình dự đoán

Độ chính xác của mô hình dự đoán phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng dữ liệu đầu vào, phương pháp phân tích và các thuật toán học máy được sử dụng. Việc cải thiện các yếu tố này sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc dự đoán khả năng ức chế bệnh từ RNA.

2.2. Sự đa dạng của RNA và ảnh hưởng đến nghiên cứu

RNA có nhiều loại và hình thức khác nhau, mỗi loại có chức năng và đặc điểm riêng. Sự đa dạng này tạo ra thách thức trong việc xây dựng mô hình dự đoán, vì mỗi loại RNA có thể tương tác khác nhau với các gen mục tiêu. Do đó, cần có các phương pháp phân tích phù hợp để xử lý sự đa dạng này.

III. Các phương pháp chính trong dự đoán khả năng ức chế bệnh từ RNA

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh khác nhau, bao gồm các thuật toán học máy và các phương pháp thống kê. Những phương pháp này giúp phân tích dữ liệu RNA và đưa ra dự đoán chính xác về khả năng ức chế bệnh của các siRNA.

3.1. Phương pháp hồi quy tuyến tính trong dự đoán

Phương pháp hồi quy tuyến tính là một trong những kỹ thuật phổ biến được sử dụng để dự đoán khả năng ức chế bệnh. Kỹ thuật này giúp xác định mối quan hệ giữa các biến số và khả năng ức chế, từ đó đưa ra các dự đoán chính xác hơn.

3.2. Sử dụng thuật toán Naïve Bayes trong phân tích RNA

Thuật toán Naïve Bayes là một phương pháp phân loại dựa trên xác suất, được áp dụng để phân tích dữ liệu RNA. Phương pháp này giúp xác định khả năng ức chế bệnh dựa trên các đặc điểm của RNA, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu RNA trong y học

Nghiên cứu về RNA và khả năng ức chế bệnh đã mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Các liệu pháp gen dựa trên RNA đang được phát triển để điều trị nhiều loại bệnh, từ bệnh nhiễm khuẩn đến ung thư. Những ứng dụng này không chỉ mang lại hy vọng cho bệnh nhân mà còn góp phần vào sự phát triển của y học hiện đại.

4.1. Liệu pháp gen và ứng dụng của RNAi

Liệu pháp gen sử dụng RNAi để ức chế các gen gây bệnh đã cho thấy hiệu quả trong nhiều nghiên cứu. Việc áp dụng RNAi trong điều trị bệnh có thể giúp giảm thiểu tác động của các gen không mong muốn, từ đó cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân.

4.2. Các nghiên cứu lâm sàng về RNA và khả năng ức chế bệnh

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đang được tiến hành để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp dựa trên RNA. Những nghiên cứu này không chỉ giúp xác định tính khả thi của các phương pháp mới mà còn cung cấp dữ liệu quan trọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị trong tương lai.

V. Kết luận và hướng đi tương lai trong nghiên cứu RNA

Nghiên cứu về RNA và khả năng ức chế bệnh đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc dự đoán khả năng ức chế bệnh từ RNA. Hướng đi tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa các mô hình dự đoán và ứng dụng thực tiễn của chúng trong y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu RNA trong y học

Nghiên cứu RNA sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Các công nghệ mới như CRISPR và RNAi sẽ mở ra nhiều cơ hội cho việc điều trị các bệnh khó chữa.

5.2. Cần có sự hợp tác giữa các lĩnh vực nghiên cứu

Sự hợp tác giữa các nhà khoa học trong lĩnh vực sinh học, y học và công nghệ thông tin là rất cần thiết để phát triển các phương pháp mới. Việc chia sẻ dữ liệu và kinh nghiệm sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

RNA can thiệp (RNA interference - RNAi) là một cơ chế sinh học quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen, có khả năng ức chế sự biểu hiện của các gen gây bệnh thông qua các phân tử RNA nhỏ như siRNA và miRNA. Từ khi được phát hiện vào cuối thập niên 1990, RNAi đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu sôi động với nhiều ứng dụng trong y học, sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Theo báo cáo của ngành, hơn 7.400 siRNA đã được thử nghiệm với các mức độ hiệu quả khác nhau, trong đó khoảng 65% siRNA thiết kế theo các quy tắc truyền thống không đạt hiệu quả mong muốn. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA một cách chính xác và hiệu quả.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là khảo sát và đánh giá các phương pháp biểu diễn dữ liệu siRNA khác nhau, từ đó xây dựng và so sánh các mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA dựa trên các biểu diễn này. Nghiên cứu tập trung vào các phương pháp học máy như hồi quy tuyến tính, phân lớp Naïve Bayes và thuật toán Apriori, sử dụng dữ liệu thực nghiệm từ các bộ dữ liệu lớn như siRecords, Huesken, Vicker, Reynolds, và các bộ dữ liệu nhãn khác. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các chuỗi siRNA có độ dài 19 nucleotide, được thu thập và phân tích trong giai đoạn từ năm 2001 đến 2017, với trọng tâm là ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ thông tin và tin sinh học tại Việt Nam.

Ý nghĩa của nghiên cứu được thể hiện qua việc nâng cao độ chính xác của các mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA, góp phần giảm chi phí và thời gian trong thiết kế siRNA hiệu quả, đồng thời mở rộng ứng dụng của RNAi trong điều trị các bệnh di truyền, ung thư và các bệnh liên quan đến virus. Các chỉ số đánh giá như hệ số tương quan Pearson và độ chính xác dự đoán được cải thiện rõ rệt khi áp dụng các biểu diễn dữ liệu tối ưu, từ đó hỗ trợ các nhà nghiên cứu và chuyên gia y sinh trong việc lựa chọn siRNA phù hợp cho các mục tiêu điều trị cụ thể.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: cơ chế can thiệp RNAi và các phương pháp học máy trong dự đoán sinh học. Cơ chế RNAi mô tả quá trình siRNA được tạo ra từ dsRNA bởi enzyme Dicer, sau đó sợi đơn siRNA guider kết hợp với phức hợp RISC để phân giải mRNA mục tiêu, dẫn đến ức chế biểu hiện gen. Các khái niệm chính bao gồm:

• siRNA (small interfering RNA): RNA ngắn 19-25 nucleotide, có khả năng ức chế gen mục tiêu hiệu quả.
• Biểu diễn dữ liệu siRNA: Các phương pháp mã hóa chuỗi nucleotide thành dạng số học hoặc vector để phục vụ cho mô hình học máy.
• Mô hình học máy: Bao gồm hồi quy tuyến tính, phân lớp Naïve Bayes và thuật toán Apriori, được sử dụng để xây dựng mô hình dự đoán khả năng ức chế dựa trên các đặc trưng của siRNA.
• Đặc trưng nhiệt động học và trình tự: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả siRNA như hàm lượng GC, vị trí nucleotide đặc trưng, motif trình tự.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính gồm các bộ dữ liệu siRNA đã được kiểm chứng thực nghiệm như siRecords (7.443 siRNA với 4 mức độ ức chế: Low, Medium, High, Very High), Huesken19_train (2.182 siRNA), Huesken19_test (249 siRNA), Vicker (76 siRNA), Reynolds (244 siRNA), và các bộ dữ liệu khác. Dữ liệu được chuẩn hóa và biểu diễn theo nhiều phương pháp khác nhau như tần số xuất hiện k-mer (1-merge, 2-merge, 3-merge), biểu diễn số học không suy thoái, biểu diễn theo vị trí nucleotide.

Phương pháp phân tích chính là xây dựng mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA bằng:

• Hồi quy tuyến tính: Phương pháp đơn giản, hiệu quả, được đánh giá qua Cross-Validation 10-fold để đảm bảo tính ổn định và khả năng tổng quát của mô hình.
• Phân lớp Naïve Bayes: Phù hợp với dữ liệu có đặc trưng không chắc chắn, được sử dụng để phân loại siRNA theo mức độ ức chế.
• Thuật toán Apriori: Dùng để khai thác luật kết hợp giữa các nucleotide và vị trí xuất hiện nhằm tìm ra các đặc trưng quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả siRNA.

Quá trình nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ 2016 đến 2017, sử dụng phần mềm Weka 3.8 để triển khai các thuật toán học máy và đánh giá mô hình. Các biểu diễn dữ liệu được thực hiện bằng chương trình Java, xuất ra file định dạng arff để nhập vào Weka. Kết quả được đánh giá dựa trên các chỉ số như hệ số tương quan Pearson, độ chính xác, và các chỉ số thống kê khác.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của phương pháp biểu diễn dữ liệu đến hiệu quả dự đoán:
   Mô hình hồi quy tuyến tính kết hợp với biểu diễn tần số xuất hiện của các bộ 1-merge, 2-merge, 3-merge cho kết quả tốt nhất với hệ số tương quan Pearson đạt khoảng 0.64 trên bộ dữ liệu Huesken. Biểu diễn số học không suy thoái cũng cho hiệu quả tương đương, trong khi biểu diễn theo vị trí nucleotide đơn lẻ có hiệu quả thấp hơn khoảng 15%.

2. So sánh các thuật toán học máy:
   Hồi quy tuyến tính vượt trội hơn so với phân lớp Naïve Bayes và thuật toán Apriori trong việc dự đoán khả năng ức chế siRNA. Naïve Bayes đạt độ chính xác khoảng 60% nhưng không ổn định trên các bộ dữ liệu khác nhau. Thuật toán Apriori chưa tìm được các luật kết hợp đặc trưng có ý nghĩa thống kê cao, do đó chưa cải thiện được hiệu quả dự đoán.

3. Tác động của việc kết hợp các biểu diễn:
   Việc kết hợp các biểu diễn tần số k-mer với biểu diễn số học không suy thoái giúp tăng độ chính xác dự đoán lên khoảng 5-7% so với sử dụng riêng lẻ từng biểu diễn. Điều này cho thấy sự bổ sung thông tin giữa các biểu diễn giúp mô hình học máy khai thác đặc trưng hiệu quả hơn.

4. Đánh giá trên các bộ dữ liệu độc lập:
   Mô hình được huấn luyện trên Huesken19_train và kiểm chứng trên Huesken19_test, Vicker, Reynolds đều cho thấy sự ổn định với hệ số tương quan Pearson dao động từ 0.58 đến 0.66, chứng tỏ tính khả thi và khả năng tổng quát của mô hình dự đoán.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân chính của sự khác biệt hiệu quả dự đoán giữa các phương pháp là do cách biểu diễn dữ liệu siRNA ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng mô hình học máy nhận diện các đặc trưng quan trọng. Biểu diễn tần số k-mer giúp mô hình nắm bắt được các motif nucleotide có liên quan đến hiệu quả ức chế, trong khi biểu diễn số học không suy thoái cung cấp thông tin về vị trí và tính chất vật lý hóa học của nucleotide.

So với các nghiên cứu trước đây, kết quả của luận văn phù hợp với xu hướng sử dụng hồi quy tuyến tính và các biểu diễn dữ liệu phức tạp để nâng cao độ chính xác dự đoán. Mặc dù các mô hình phức tạp như mạng nơ ron nhân tạo hay máy vector hỗ trợ có thể đạt hiệu quả cao hơn, nhưng phương pháp hồi quy tuyến tính vẫn được đánh giá cao về tính đơn giản, dễ triển khai và khả năng giải thích kết quả.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường thể hiện hệ số tương quan Pearson của các mô hình trên từng bộ dữ liệu, hoặc bảng so sánh độ chính xác và các chỉ số đánh giá khác giữa các phương pháp biểu diễn và thuật toán học máy. Điều này giúp minh họa rõ ràng sự khác biệt và ưu thế của từng phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa biểu diễn dữ liệu siRNA:
   Khuyến nghị phát triển các phương pháp biểu diễn kết hợp giữa tần số k-mer và các đặc trưng vật lý hóa học để nâng cao độ chính xác dự đoán. Thời gian thực hiện trong 6-12 tháng, do các nhóm nghiên cứu tin sinh học và công nghệ thông tin phối hợp thực hiện.

2. Áp dụng các thuật toán học máy nâng cao:
   Đề xuất sử dụng các mô hình học sâu (deep learning) hoặc máy vector hỗ trợ với đa nhân (MKSVR) để khai thác sâu hơn các đặc trưng phức tạp của siRNA. Mục tiêu tăng hệ số tương quan Pearson lên trên 0.7 trong vòng 1-2 năm.

3. Xây dựng cơ sở dữ liệu siRNA mở rộng và chuẩn hóa:
   Khuyến khích thu thập và chuẩn hóa dữ liệu siRNA từ nhiều nguồn khác nhau để tăng tính đại diện và độ tin cậy của mô hình dự đoán. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ thông tin trong 2-3 năm.

4. Phát triển công cụ thiết kế siRNA trực tuyến:
   Đề xuất xây dựng phần mềm hoặc nền tảng web hỗ trợ thiết kế siRNA dựa trên mô hình dự đoán đã tối ưu, giúp các nhà nghiên cứu và y bác sĩ dễ dàng lựa chọn siRNA hiệu quả. Thời gian phát triển dự kiến 1 năm, do các nhóm phát triển phần mềm và chuyên gia sinh học phối hợp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền:
   Hưởng lợi từ các quy tắc thiết kế siRNA và mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh, hỗ trợ trong nghiên cứu chức năng gen và liệu pháp gen.

2. Chuyên gia tin sinh học và công nghệ thông tin:
   Áp dụng các phương pháp biểu diễn dữ liệu và thuật toán học máy để phát triển các công cụ dự đoán và phân tích dữ liệu sinh học.

3. Bác sĩ và nhà nghiên cứu y học:
   Sử dụng kết quả nghiên cứu để lựa chọn siRNA hiệu quả trong điều trị các bệnh di truyền, ung thư và các bệnh liên quan đến virus.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm:
   Ứng dụng mô hình dự đoán để thiết kế siRNA cho các sản phẩm liệu pháp gen, giảm chi phí thử nghiệm và tăng hiệu quả phát triển thuốc.

Câu hỏi thường gặp

1. RNAi là gì và tại sao nó quan trọng trong nghiên cứu gen?
   RNAi là cơ chế điều hòa biểu hiện gen thông qua việc sử dụng các phân tử RNA nhỏ để ức chế mRNA mục tiêu, giúp kiểm soát sự biểu hiện gen và có ứng dụng trong điều trị bệnh di truyền và ung thư.

2. Phương pháp biểu diễn dữ liệu siRNA ảnh hưởng thế nào đến mô hình dự đoán?
   Biểu diễn dữ liệu quyết định cách mô hình học máy nhận diện đặc trưng quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác và khả năng tổng quát của mô hình.

3. Tại sao hồi quy tuyến tính được sử dụng phổ biến trong dự đoán hiệu quả siRNA?
   Hồi quy tuyến tính đơn giản, dễ triển khai, có khả năng giải thích kết quả và đạt hiệu quả tương đương với nhiều mô hình phức tạp trong nhiều trường hợp.

4. Các thách thức chính khi ứng dụng RNAi trong điều trị là gì?
   Bao gồm hiệu ứng miễn dịch không mong muốn, ức chế sai mục tiêu và khó khăn trong việc chuyển nạp siRNA vào tế bào mục tiêu.

5. Làm thế nào để cải thiện độ chính xác của mô hình dự đoán khả năng ức chế siRNA?
   Bằng cách kết hợp các biểu diễn dữ liệu đa dạng, sử dụng thuật toán học máy nâng cao, mở rộng và chuẩn hóa dữ liệu huấn luyện, đồng thời tích hợp các đặc trưng nhiệt động học và trình tự.

Kết luận

• Luận văn đã khảo sát và đánh giá đa dạng các phương pháp biểu diễn dữ liệu siRNA và xây dựng mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên các biểu diễn này.
• Phương pháp hồi quy tuyến tính kết hợp biểu diễn tần số k-mer và biểu diễn số học không suy thoái cho hiệu quả dự đoán cao và ổn định trên nhiều bộ dữ liệu thực nghiệm.
• Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao độ chính xác trong thiết kế siRNA, hỗ trợ ứng dụng RNAi trong điều trị bệnh và nghiên cứu gen.
• Đề xuất phát triển các mô hình học máy nâng cao và xây dựng cơ sở dữ liệu chuẩn hóa để cải thiện hơn nữa hiệu quả dự đoán.
• Khuyến khích phát triển công cụ thiết kế siRNA trực tuyến nhằm hỗ trợ cộng đồng nghiên cứu và y tế trong việc ứng dụng RNAi.

Các nhà nghiên cứu và chuyên gia công nghệ thông tin nên áp dụng các biểu diễn dữ liệu và mô hình dự đoán được đề xuất để phát triển các công cụ hỗ trợ thiết kế siRNA hiệu quả, đồng thời mở rộng nghiên cứu về các thuật toán học máy tiên tiến nhằm nâng cao độ chính xác dự đoán.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH CỦA RNA 1. Tổng quan RNA can thiệp (RNAi) 1. Tổng quan RNAi RNA (Hoặc ARN) là axit ribonucleic – một trong hai loại axit nucleic (ADN, ARN) và là cơ sở di truyền cấp độ phân tử.

Ở những loài không có ADN ví dụ một số loại virut thì ARN đóng vai trò là vật chất di truyền [1]. RNA tham gia vào quá trình phiên mã và dịch mã thông tin di truyền với nhiều vai trò khác nhau được đảm nhận bởi ba loại RNA (mRNA – RNA thông tin, tRNA – RNA vận chuyển, rRNA – RNA riboxom). Ngoài ra RNA còn có các chức năng điều hòa biểu hiện gen hoặc có chức năng tham gia các quá trình phát triển, biệt hoá tế bào như RNAi (interfering RNA). RNA can thiệp (RNA interference, RNAi) là một cơ chế điều hòa biểu hiện gen được hướng dẫn (guiding) bởi RNA mà bằng cách này RNA mạch kép ức chế biểu hiện của các gen bằng các trình tự nucleotide bổ sung.

Đó là trình tự đặc biệt và liên quan đến sự suy thoái của cả hai loại phân tử RNA: RNA sợi kép (dsRNA) và RNA sợi đơn thường mRNA là những sợi tương đồng trong trình tự dsRNA làm kích hoạt phản ứng trả lời [1]. Khả năng ức chế của RNAi có thể gây nên các hiệu ứng: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA, ức chế sự phiên mã của gen ở trong nhân, phân giải mRNA. Các hiệu ứng này gây nên sự ức chế biểu hiện của gen (ức chế gen), cụ thể sự tổng hợp protein sẽ bị giảm (knockdown) hoặc ngừng hoàn toàn (knock out) dẫn đến các tính trạng được quy định bởi gen đó bị suy giảm hoặc không xuất hiện. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Lịch sử nghiên cứu RNAi Hình 1: Lịch sử nghiên cứu RNAi [2] Trong lịch sử, sự can thiệp RNA được biết đến với những tên gọi khác như: RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference - Năm 1984, Pesthea và các cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật Antisense-RNA trên vi khuẩn Escherichia Coli được đăng trên tạp chí PNAS số 81. Tuy nhiên ở giai đoạn này vẫn chưa hình dung được cơ chế gây ra sự ức chế gen. - Đến những năm đầu thập niên 1990, một số kết quả nghiên cứu được công bố trên các tạp chí quốc tế (Napoli và cộng sự, Vander Krol và cộng sự đều vào năm 1990) dựa trên quan sát hiện tượng của hoa dạ yến thảo (pentunia) khi cố gắng tạo cánh hoa màu tím bằng cách chuyển gen quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới tác động của promoter 35S. Tuy nhiên cánh hoa lại bị đốm màu, có chỗ còn màu trắng, hiện tượng này được gọi là “đồng ức chế” - Năm 1992, phát hiện “quelling” ở Neurospora (Neurospora crassa - vi khuẩn mốc bánh mì màu đỏ (red bread mold)).

Năm 1994, Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa, và kết quả hầu như nấm không thể hiện và hiện tượng này được gọi là “quelling”. - Năm 1995, trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 14 tử RNA chiều thuận (sense RNA) cũng gây ra sự ức chế gen tương đương với với phân tử RNA chiều ngược. Điều này gây ra sự lúng túng do kết quả khác với điều các nhà khoa học mong đợi. - Đóng góp quan trọng nhất là việc phát hiện cơ chế RNAi từ việc nghiên cứu và thí nghiệm của Andrew Fire và C.

Năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. Mục đích của các thí nghiệm này là nhằm kiểm tra sự hỗ trợ lẫn nhau giữa các phân tử RNA theo cả hai chiều trong quá trình ức chế sự biểu hiện của gen. Kết quả là dsRNA ức chế sự biểu hiện của gen gấp 10 lần so với việc dùng phân tử RNA đơn lẻ theo chiều thuận hay chiều nghịch khi dùng phân tử RNA đơn lẻ còn dần dần mất tác dụng ức chế gen. Như vậy nhóm nghiên cứu của giáo sư Fire đã xác định được ngyên nhân chủ yếu của hiện tượng RNA silencing chính là do phân tử dsRNA gây nên.

Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt cho một thuật ngữ là RNA interference (RNAi). Việc tiêm mRNA mã hóa protein cơ không gây ra sự thay đổi nào ở giun. Mã di truyền của mRNA được mô tả như là một trình tự sense. Việc tiêm RNA antisense, một trình tự bổ sung với mRNA, cũng không mang lại tác động nào.

Nhưng khi Fire và Mello tiêm RNA sence và antisense cùng với nhau thì họ quan sát thấy giun có những biểu hiện co giật đặc trưng. Những biểu hiện tương tự cũng được ghi nhận ở các giun bị khuyết hoàn toàn gen chức năng mã hóa protein cơ. Hình 2: Biểu hiện của giun khi tiêm RNA liên quan đến mã hóa protein cơ [3] LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 15 - Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi giấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành. - Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú (Tuschl và cộng sự).

- 2002, Tạo ra tái tổ hợp dicer để tạo siRNA, công nghệ RNAi trở thành công nghệ của năm. - 2003-2005, khoảng thời gian cải tiến và tìm hiểu rõ hơn về công nghệ RNAi. - Năm 2006, giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của hai nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig C. Ý nghĩa của việc phát hiện ra RNAi - Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus - Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen - Can thiệp RNA như cơ chế kiểm soát quá trình tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển - Can thiệp RNA như cơ chế bảo vệ nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cường phiên mã - Can thiệp RNA cống hiến một phương pháp mới để kiềm chế gen chuyên biệt - Can thiệp RNA đã đề xuất một giải pháp hiệu quả trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai 2.

Cơ chế can thiệp RNAi 2. Các loại RNAi Trung tâm của quá trình can thiệp RNAi gồm 2 thành phần siRNA và miRNA và những RNA này có thể liên kết với các mRNA khác, tăng hoặc giảm hoạt động của chúng hoặc là ngăn không cho mRNA tổng hợp protein. siRNA (small interfeing RNA, short interfering RNA) là các RNA ngắn có kích thước khoảng 19 đến 25 nucleotit, được hình thành từ các RNA sợi đôi, tham gia vào quá trình tổng hợp protein, siRNA có khả năng điều khiển protein họ Argomaute tới đích điều hòa. siRNA tổng hợp hóa học là dạng đơn giản nhất của RNAi.

Một trong những rào cản lớn nhất để đạt được hiệu quả RNAi với siRNA là nhiều tế bào khó để chuyển nạp. Thử nghiệm RNAi thường được coi là thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 16 công khi biểu hiện của gen mục tiêu giảm đến hơn 70%, khó có thể đạt được ở nhiều loại tế bào do hiệu quả của việc truyền thấp. Một nhược điểm nữa của việc sử dụng siRNA tổng hợp là thời gian hạn chế của các hiệu ứng sau khi truyền, điển hình là các hoạt động im lặng gen trong 24 giờ và giảm trong 48 giờ. Tổng hợp hóa học của siRNA tốn kém trong việc chuyển nạp cơ sở liên quan tới các thuốc thử nghiệm dựa trên vector DNA.

miRNA (micro RNA) là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 đến 25 nucleotit, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Tiền thân miRNA (Pre- miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (steen-loop) hay dạng kẹp tóc (hairpin). Ngoài ra, một loại RNAi khác là shRNA có thể được đưa vào bởi DNA plasmid, mẫu tuyến tính hoặc vector virus hoặc vi khuẩn. Chính vì vậy loại RNAi này gây ra mối quan ngại về sự an toàn khi sử dụng.

Cơ chế can thiệp RNA Khi các phần khác nhau của cơ chế RNAi đang được phát hiện, cơ chế RNAi đang trở nên ngày càng rõ ràng hơn. Trong vài năm gần đây, các nhà khoa học đã thu được những hiểu biết quan trọng trong việc làm sáng tỏ cơ chế RNAi. Sự kết hợp của các kết quả thu được từ một số thí nghiệm trên cơ thể sống (vivo) và trong ống nghiệm (vitro) đã tạo thành mô hình cơ học hai bước cho RNAi/PTGS (mô hình 2 bước được mô tả trong hình bên dưới). Bước đầu tiên, được gọi là bước khởi đầu RNAi, liên quan đến việc gắn các phân tử RNA vào một sợi kép dsRNA lớn và sự phân tách của nó thành các đoạn RNA rời rạc có kích thước xấp xỉ 21 đến 25 nucleotide (siRNA).

Trong bước thứ hai, mỗi siRNA kép được tách thành 2 sợi đơn siRNA, sợi passenger và sợi guider. Sợi passenger bị suy thoái còn sợi guider sẽ kết hợp vào RNA gây ra sự im lặng phức tạp (RISC). Các siRNA này tham gia một phức hợp đa nuclease (enzyme thủy phân), làm giảm các mRNA đơn mạch tương đồng. Khi các phân tử mRNA này biến mất thì gen tương ứng bị bất hoạt, không có protein nào do gen đó mã hóa được tạo thành.

Ngoài ra trong bước 1 có thể xảy ra sự khuếch đại siRNA. Vì các đột biến gen mã hóa polymeraza RNA phu ̣ thuô ̣c RNA (RNA-dependent RNA polymerase - RdRP) ảnh hưởng đến RNAi nên loại polymerase này được đề xuất là có thể sao chép siRNA như các tác nhân biểu sinh, cho phép chúng lan truyền khắp cây trồng và giữa các thế hệ trong C. Các nghiên cứu của Lipardi và cộng sự và Sijen và cộng sự cung cấp các bằng chứng sinh học và di truyền thuyết phục rằng LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 17 RdRP thực sự đóng một vai trò quan trọng trong việc khuếch đại các hiệu ứng RNAi. Cơ chế tắt gen bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu hiện của một gen nào đó (vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào).

Hình 3: Bước 1, dsRNA bị cắt bởi enzyme Dicer để tạo ra các siRNA [4] LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 18 Hình 4: Bước 2, kết quả phân tách endonucleolytic của mRNA [4] 2. Ứng dụng RNAi và thách thức Việc phát hiện ra RNAi và cơ chế làm im lặng gen khiến các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm cách ứng dụng RNAi vào nhiều lĩnh vực đặc biệt là khám chữa bệnh.