Luận văn thạc sĩ phân lập và nghiên cứu đặc tính nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và đặc tính nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose hiệu quả trong công nghiệp sinh học

• Tác giả: Hàn Thị Thu Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân Lập Và Nghiên Cứu Đặc Tính Nấm Mốc Chịu Nhiệt Có Khả Năng Thủy Phân Lignocellulose
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose
• 1.2. Lignocellulose
• 1.3. Cellulose
• 1.4. Hemicellulose
• 1.5. Lignin
• 1.6. Enzyme thủy phân lignocellulose
• 1.6.1. Cellullase
• 1.6.2. Endo-1,4-β-Cellulose glucanase (Endoglucanase)
• 1.6.3. Cellobiohydrolase (CBH)
• 1.6.4. β-glucosidase
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
• 2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
• 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol
• 2.3.2. Môi trường PDA
• 2.3.3. Môi trường lên men lỏng
• 2.3.4. Môi trường YM
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt
• 2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.4.3. Tách chiết enzyme
• 2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS
• 2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS
• 2.4.6. Điện di protein
• 2.4.7. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 2.4.8. Phương pháp điện di Zymogram
• 2.4.9. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc
• 2.4.10. Phương pháp tinh chế ADN
• 2.4.11. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
• 2.4.12. Phương pháp điện di ADN. Nhuộm gel và đọc kết quả
• 2.4.13. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt
• 3.1.1. Kết quả phân lập
• 3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
• 3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA
• 3.2. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập
• 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose
• 3.2.2. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocellulose
• 3.2.3. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau
• 3.2.4. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm mốc chịu nhiệt và lignocellulose

Nấm mốc chịu nhiệt là một nhóm vi sinh vật có khả năng phát triển và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy lignocellulose, một thành phần chính trong cấu trúc thực vật. Lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin, là nguồn nguyên liệu phong phú cho sản xuất năng lượng sinh học. Việc phân lập và nghiên cứu đặc tính của nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose sẽ mở ra nhiều cơ hội cho công nghệ sinh học và sản xuất năng lượng bền vững.

1.1. Đặc điểm của nấm mốc chịu nhiệt

Nấm mốc chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nhiệt độ cao, thường từ 50°C trở lên. Chúng có khả năng sản sinh enzyme thủy phân lignocellulose, giúp phân hủy các polymer phức tạp thành các monomer dễ tiêu hóa hơn. Một số chủng nấm mốc chịu nhiệt phổ biến như Aspergillus, Thermomyces và Scytalidium đã được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp.

1.2. Vai trò của lignocellulose trong sản xuất năng lượng

Lignocellulose là nguồn nguyên liệu chính cho sản xuất nhiên liệu sinh học. Việc thủy phân lignocellulose thành các đường đơn giản là bước đầu tiên trong quá trình chuyển hóa sinh học. Các enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm mốc chịu nhiệt có thể cải thiện hiệu suất của quá trình này, giúp giảm chi phí sản xuất và tăng tính khả thi của công nghệ năng lượng sinh học.

II. Thách thức trong việc thủy phân lignocellulose

Mặc dù lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú, nhưng việc thủy phân nó thành các monomer vẫn gặp nhiều thách thức. Các liên kết hóa học giữa cellulose, hemicellulose và lignin rất bền vững, làm cho quá trình thủy phân trở nên khó khăn. Hơn nữa, hiệu suất của các enzyme hiện có vẫn chưa đạt yêu cầu trong sản xuất thương mại. Do đó, việc tìm kiếm các hệ enzyme mới từ nấm mốc chịu nhiệt là rất cần thiết.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Nhiệt độ, pH và thời gian phản ứng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân lignocellulose. Nấm mốc chịu nhiệt có thể hoạt động hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ cao, nhưng pH cũng cần được tối ưu hóa để đạt được hoạt tính enzyme tốt nhất.

2.2. Giới hạn của các enzyme hiện có

Các enzyme thủy phân lignocellulose hiện tại thường có hiệu suất thấp và không ổn định trong điều kiện khắc nghiệt. Việc phát triển các enzyme mới từ nấm mốc chịu nhiệt có thể giúp cải thiện khả năng thủy phân và mở rộng ứng dụng trong công nghiệp.

III. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt

Phân lập nấm mốc chịu nhiệt là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các phương pháp phân lập bao gồm nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và sử dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại như điện di protein và PCR. Việc xác định hoạt tính enzyme của các chủng nấm mốc cũng rất cần thiết để đánh giá khả năng thủy phân lignocellulose.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập

Sử dụng môi trường nuôi cấy đặc biệt như PDA và môi trường lên men lỏng giúp phân lập các chủng nấm mốc chịu nhiệt. Các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ và pH cũng cần được điều chỉnh để tối ưu hóa sự phát triển của nấm.

3.2. Phân tích hoạt tính enzyme

Xác định hoạt tính cellulase và xylanase là bước quan trọng để đánh giá khả năng thủy phân lignocellulose của các chủng nấm mốc. Các phương pháp như điện di SDS-PAGE và phương pháp DNS được sử dụng để phân tích hoạt tính enzyme một cách chính xác.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chủng nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose hiệu quả. Các enzyme được sản sinh từ những chủng này có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất năng lượng sinh học, chế biến thực phẩm và xử lý môi trường. Việc ứng dụng các enzyme này không chỉ giúp tăng hiệu suất sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

4.1. Khả năng thủy phân lignocellulose của các chủng nấm mốc

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số chủng nấm mốc có khả năng thủy phân lignocellulose cao, với hoạt tính enzyme cellulase và xylanase đáng kể. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm enzyme thương mại từ nấm mốc chịu nhiệt.

4.2. Ứng dụng trong công nghiệp

Các enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm mốc chịu nhiệt có thể được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến thực phẩm và xử lý chất thải. Việc sử dụng enzyme tự nhiên không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose đang mở ra nhiều triển vọng cho công nghệ sinh học. Việc phát triển các enzyme mới từ nấm mốc chịu nhiệt không chỉ giúp cải thiện hiệu suất thủy phân mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp năng lượng sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cả môi trường và kinh tế.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các chủng nấm mốc mới và tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme. Việc ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại như chỉnh sửa gen cũng có thể giúp cải thiện khả năng thủy phân lignocellulose.

5.2. Tác động đến môi trường và kinh tế

Nghiên cứu và ứng dụng enzyme từ nấm mốc chịu nhiệt không chỉ giúp tăng hiệu suất sản xuất năng lượng sinh học mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo sẽ giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ tài nguyên thiên nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lignocellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, chiếm tỷ lệ lớn trong phế phụ phẩm nông nghiệp và rác thải hữu cơ, với hàm lượng cellulose dao động từ 15% đến 95%, hemicellulose từ 5% đến 85%, và lignin từ 0% đến 40% tùy loại nguyên liệu. Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng và cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch đã thúc đẩy nghiên cứu sử dụng lignocellulose làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học và các ứng dụng công nghiệp khác. Tuy nhiên, quá trình thủy phân lignocellulose hiện nay còn nhiều hạn chế về hiệu quả và chi phí, đặc biệt do tính bền vững và cấu trúc phức tạp của lignocellulose.

Luận văn tập trung vào phân lập và nghiên cứu đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose, nhằm tìm kiếm các enzyme thủy phân hiệu quả hơn, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ cao. Nghiên cứu được thực hiện trên 46 chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn, rơm ủ tại các tỉnh Hà Nội, Hà Nam, Vĩnh Phúc trong khoảng thời gian thu thập mẫu năm 2014. Mục tiêu chính là xác định đa dạng chủng loại, đặc điểm hình thái, hoạt tính enzyme cellulase và xylanase, cũng như khả năng bền nhiệt của enzyme từ các chủng này.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các enzyme thủy phân lignocellulose chịu nhiệt, góp phần nâng cao hiệu quả công nghệ sinh học trong sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến nông sản, công nghiệp giấy và xử lý môi trường. Các chỉ số hoạt tính enzyme và đặc tính sinh học của nấm mốc chịu nhiệt được đánh giá chi tiết, cung cấp cơ sở khoa học cho ứng dụng thực tiễn và phát triển công nghệ enzyme mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về cấu trúc lignocellulose và hệ enzyme thủy phân lignocellulose, bao gồm:

• Cấu trúc lignocellulose: Bao gồm cellulose (polymer β-1,4-glucose), hemicellulose (heteropolymer các loại đường pentose và hexose), và lignin (polymer phenylpropanoid). Cellulose có vùng tinh thể và vô định hình, trong đó vùng vô định hình dễ bị thủy phân hơn. Hemicellulose có cấu trúc phức tạp với các nhóm thế acetyl, arabinosyl, glucuronic acid liên kết với cellulose và lignin. Lignin là thành phần khó phân hủy nhất, ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của lignocellulose.

• Hệ enzyme thủy phân lignocellulose: Gồm cellulase (endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase), hemicellulase (xylanase, β-xylosidase, α-L-arabinofuranosidase, β-mannanase, α-glucuronidase, esterase), và ligninase (enzyme oxy hóa lignin). Các enzyme này thuộc các họ Glycoside Hydrolase (GH) và Carbohydrate Esterase (CE), hoạt động phối hợp để phân giải lignocellulose.

• Nấm mốc chịu nhiệt: Là nhóm nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao (45-62°C), thường phân bố trong đất, phân ủ, rác thải hữu cơ. Các loài phổ biến gồm Aspergillus fumigatus, Rhizomucor pusillus, Thermomyces lanuginosus, Scytalidium thermophilum. Nấm mốc chịu nhiệt có hệ enzyme cellulase và xylanase bền nhiệt, hoạt động hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ cao, phù hợp cho ứng dụng công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt được phân lập từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn, rơm ủ thu thập tại Hà Nội, Hà Nam, Vĩnh Phúc.

• Phương pháp phân lập: Mẫu được pha loãng, cấy trên môi trường Malt-glucose 2°Bx bổ sung chloramphenicol, ủ ở 50°C trong 2-3 ngày. Khuẩn lạc khác biệt được tách chiết, nuôi cấy trên môi trường PDA để giữ giống.

• Quan sát hình thái: Khuẩn lạc và tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40x, ghi nhận hình dạng, màu sắc, cấu trúc bào tử.

• Phân nhóm và định danh: Sử dụng kỹ thuật PCR fingerprinting với mồi MST2 (5’-(GAC)5-3’) để phân nhóm chủng. Vùng ITS của rDNA được khuếch đại và giải trình tự để xác định tên loài dựa trên so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank.

• Thu nhận enzyme: Nấm mốc được nuôi cấy lên men lỏng trong môi trường đặc biệt ở 50°C, 140 rpm trong 7 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm thu dịch enzyme thô.

• Xác định hoạt tính enzyme: Hoạt tính cellulase, CMCase và xylanase được đo bằng phương pháp DNS, dựa trên lượng đường khử tạo thành (glucose hoặc xylose) ở pH 5, 50°C. Đường chuẩn được chuẩn bị từ glucose và xylose tinh khiết.

• Phân tích protein và enzyme: Điện di SDS-PAGE và Zymogram được sử dụng để phân tích hệ protein và hoạt tính enzyme trên gel có bổ sung cơ chất CMC hoặc xylan.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập chủng trong vòng 3 tháng; nuôi cấy, thu nhận enzyme và phân tích hoạt tính trong 4 tháng; phân nhóm, định danh và phân tích dữ liệu trong 3 tháng tiếp theo.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đa dạng chủng nấm mốc chịu nhiệt: 46 chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn, rơm ủ tại Hà Nội, Hà Nam, Vĩnh Phúc. Các chủng thuộc các loài phổ biến như Aspergillus fumigatus (chiếm khoảng 20% số chủng), Thermomyces lanuginosus (chiếm khoảng 25%), Rhizomucor pusillus và Scytalidium thermophilum. Ngoài ra còn có các loài ít gặp như Malbranchea cinnamomea, Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus.

2. Hình thái đa dạng: Khuẩn lạc ban đầu trắng, sau 2-3 ngày chuyển sang màu nâu, xám, xanh đen hoặc đen. Hình dạng khuẩn lạc đa dạng từ nhung mịn đến bông xốp. Hầu hết chủng có bào tử với cấu trúc và kích thước khác nhau, phù hợp với đặc điểm từng loài.

3. Hoạt tính enzyme cellulase thấp nhưng đồng bộ: Hoạt tính cellulase trung bình của các chủng khoảng 0.04 IU/ml, thấp hơn nhiều so với các chủng nấm mesophilic như Trichoderma reesei. Tuy nhiên, sự phối hợp hoạt động của các enzyme cellulase (endo-glucanase, exo-glucanase, β-glucosidase) được ghi nhận, cho thấy hiệu quả thủy phân cellulose không chỉ phụ thuộc vào hoạt tính riêng lẻ mà còn vào sự đồng bộ của hệ enzyme.

4. Hoạt tính xylanase cao và bền nhiệt: Các chủng nấm mốc chịu nhiệt sản xuất xylanase với nhiệt độ tối ưu hoạt động từ 55-65°C, một số chủng như Thermoascus aurantiacus và Thermomyces lanuginosus có xylanase hoạt động tối ưu ở 70-80°C. Xylanase có pH tối ưu khoảng 4.5, khối lượng phân tử dao động 21-78 kDa, chủ yếu là glycoprotein.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy nhóm nấm mốc chịu nhiệt phân bố đa dạng và phong phú trong các môi trường giàu lignocellulose như phân ủ và đất. Hoạt tính cellulase thấp hơn so với nấm mesophilic có thể do sự khác biệt về điều kiện nuôi cấy hoặc đặc tính enzyme, nhưng khả năng thủy phân cellulose vẫn được duy trì nhờ sự phối hợp của các enzyme thành phần. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy β-glucosidase có thể kích thích hoạt động của endoglucanase và exoglucanase ngay cả khi lượng cellobiose tích lũy thấp.

Hoạt tính xylanase cao và bền nhiệt của các chủng nấm chịu nhiệt là điểm mạnh, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp giấy, thức ăn chăn nuôi và xử lý sinh học lignocellulose ở điều kiện nhiệt độ cao. Các đặc tính phân tử của enzyme như glycosyl hóa và cấu trúc bậc ba góp phần vào tính bền nhiệt và hiệu quả xúc tác.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính cellulase và xylanase của các chủng, bảng phân loại chủng nấm và phổ fingerprinting thể hiện sự đa dạng di truyền. Bảng phân tích hoạt tính enzyme ở các pH và nhiệt độ khác nhau cũng giúp minh họa đặc tính enzyme.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy tối ưu: Tăng cường điều kiện nuôi cấy để nâng cao hoạt tính cellulase, tập trung vào việc điều chỉnh pH, nhiệt độ và thành phần môi trường lên men trong vòng 6-12 tháng. Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

2. Tinh chế và cải tiến enzyme: Áp dụng kỹ thuật tinh chế enzyme và công nghệ protein tái tổ hợp để tăng cường hoạt tính và tính bền nhiệt của cellulase và xylanase trong 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: các trung tâm nghiên cứu enzyme và công ty công nghệ sinh học.

3. Ứng dụng enzyme trong công nghiệp: Thử nghiệm ứng dụng enzyme thủy phân lignocellulose trong sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến giấy và thức ăn chăn nuôi tại các nhà máy trong vòng 1-2 năm. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp công nghiệp và viện nghiên cứu.

4. Mở rộng nghiên cứu đa dạng sinh học: Tiếp tục phân lập và khảo sát các chủng nấm mốc chịu nhiệt từ các vùng sinh thái khác nhau để tìm kiếm enzyme mới có đặc tính ưu việt trong 2-3 năm tới. Chủ thể thực hiện: các trường đại học và viện nghiên cứu sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật học và enzyme: Nghiên cứu đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm mốc chịu nhiệt, phát triển công nghệ enzyme bền nhiệt.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học và nhiên liệu sinh học: Ứng dụng enzyme trong quá trình chuyển hóa lignocellulose thành nhiên liệu sinh học, cải thiện hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

3. Doanh nghiệp công nghiệp giấy và chế biến nông sản: Tận dụng enzyme xylanase và cellulase để nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm sử dụng hóa chất độc hại.

4. Chuyên gia môi trường và xử lý chất thải: Áp dụng enzyme thủy phân lignocellulose trong xử lý rác thải hữu cơ, phân hủy sinh học và tái chế chất thải nông nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm mốc chịu nhiệt là gì và tại sao quan trọng?
   Nấm mốc chịu nhiệt là nhóm nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao (45-62°C). Chúng quan trọng vì sản xuất enzyme bền nhiệt, phù hợp cho các quy trình công nghiệp yêu cầu nhiệt độ cao, giúp tăng hiệu quả thủy phân lignocellulose.

2. Hoạt tính cellulase của nấm mốc chịu nhiệt có cao không?
   Hoạt tính cellulase trung bình khoảng 0.04 IU/ml, thấp hơn so với nấm mesophilic như Trichoderma reesei. Tuy nhiên, sự phối hợp đồng bộ của các enzyme cellulase giúp nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose.

3. Xylanase của nấm mốc chịu nhiệt có đặc điểm gì nổi bật?
   Xylanase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55-80°C và pH axit (~4.5), có tính bền nhiệt cao và là glycoprotein, thích hợp cho ứng dụng trong công nghiệp giấy và thức ăn chăn nuôi.

4. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt được thực hiện như thế nào?
   Mẫu đất, phân ủ được pha loãng, cấy trên môi trường Malt-glucose bổ sung kháng sinh, ủ ở 50°C. Khuẩn lạc khác biệt được tách chiết và nuôi cấy trên môi trường PDA để giữ giống.

5. Làm thế nào để xác định tên loài nấm mốc?
   Sử dụng kỹ thuật PCR fingerprinting để phân nhóm chủng, sau đó khuếch đại và giải trình tự vùng ITS của rDNA, so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank để xác định tên loài chính xác.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định được 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt đa dạng từ các mẫu đất và phân ủ tại miền Bắc Việt Nam.
• Các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất enzyme thủy phân lignocellulose, trong đó xylanase có hoạt tính và tính bền nhiệt cao hơn cellulase.
• Hoạt tính cellulase thấp nhưng sự phối hợp đồng bộ của các enzyme cellulase góp phần nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển enzyme thủy phân lignocellulose bền nhiệt ứng dụng trong công nghiệp sinh học và xử lý môi trường.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong các ngành công nghiệp liên quan trong vòng 1-3 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển công nghệ enzyme bền nhiệt, đồng thời mở rộng khảo sát đa dạng sinh học nấm mốc chịu nhiệt để khai thác tiềm năng enzyme mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose, hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010).

Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khác nhau trong cùng một cây. Thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau được trình bày ở Bảng 1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến.

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40–55 24–40 18–25 Thân gỗ mềm 45–50 25–35 25–35 Vỏ lạc 25–30 25–30 30–40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85–99 0 0–15 Rơm lúa mì 30 50 15 Lá cây 15–20 80–85 0 Hạt bông 80–95 5–20 0 Cỏ ven biển Bermuda 25 35. Cellulose Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật và là một trong những hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trong sinh quyển. Cellulose là polyme mạch thẳng có công thức hóa học (C6H10O5)n (trong đó n khoảng 10 000 - 15 000 tùy thuộc từng loại vật liệu). Một đơn vị lặp lại bao gồm 2 phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa C1 của một phân tử glucose với C4 của phân tử glucose kế tiếp, được gọi là liên kết -1,4 glycoside [63], [59].

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hydro. Các liên kết hydro nội bộ và liên chuỗi mạng làm cho cellulose trở thành một polymer tương đối ổn định, và mang lại độ cứng cho các sợi cellulose. Cấu trúc phân tử cellulose (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Trong hệ sợi cellulose hình thành hai vùng: vùng tinh thể và vùng vô định hình.

Trong vùng tinh thể các sợi cellulose kết hợp với nhau theo một trật tự nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch kế tiếp. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Ngược lại các sợi cellulose trong vùng vô định hình liên kết với nhau khá lỏng lẻo bởi lực Van der Waals do đó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài [2]. Vùng vô định hình cũng dễ bị tác nhân thủy phân tấn công hơn so với vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết -1,4-glycoside làm giảm độ bền của liên kết đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro.

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose tinh thể. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose tinh thể nhiều và ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc -OCH COOH [1].

Hemicellulose Hemicellulose là polyme sinh học phong phú thứ hai trên trái đất, là heteropolymer của đường 5 carbon (xylose và arabinose), đường 6 carbon (glucose, galactose, mannose) và các acid (acetic). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung như mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-1,4, xylose là thành phần chủ yếu, nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3, mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D- Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ xylopyranoside. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên.

Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucoronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí của nó ở các mô, tế bào. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Christiane Laine 2005).

Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Xylan tồn tại ở dạng arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Hình 1.3) hay ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Hình 1.4), hay thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. Lignin Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung quanh các sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý.

Trong thực vật lignin đóng vai trò chất kết nối, liên kết các tế bào làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn độc tố đồng thời giúp thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn [1]. Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, và một vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol [63]. Cấu trúc của lignin rất đa dạng tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ.

Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân loại thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringy lignin. Lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc, bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô dịnh hình. Các vòng phenyl trong lignin gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào.

Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200˚C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Trong dinh dưỡng động vật lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ.

Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các cacbonhydrate khác bị bẻ gẫy. Enzyme thủy phân lignocellulose Để phân hủy một hợp chất polymer phức tạp như lignocellulose cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme này được phân loại là enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa lignin (FOLymes) [6], [18].

Cellulase và hầu hết hemicellulase thuộc về một họ các enzyme được gọi là Glycoside Hydrolase (GH). Sự phân loại Glycoside Hydrolase vào các họ khác nhau dựa trên cơ sở tương đồng về trình tự axit, các protein trong một họ nhất định sẽ có nếp gấp tương tự nhau cho phép mô hình hóa tương đồng [10], [11], [12]. Vì vậy các enzyme đặc trưng với các cơ chất khác nhau đôi khi được tìm thấy trong cùng một họ, cho thấy một sự phân kỳ tiến hóa để có được đặc trưng mới. Hiện nay hơn 2500 GH đã được xác định và phân thành 133 họ bao gồm các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật với các cơ chất khác nhau [9], [53], [61].

Cellullase Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose. Cellulase từ nấm mốc chủ yếu được tìm thấy trong một vài họ GH bao gồm GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Cellulase sử dụng hai cơ chế xúc tác khác nhau để thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose là cơ chế giữ và nghịch đảo. Hầu như tất cả các cellulase GH thủy phân liên kết glycoside bởi cơ chế giữ trừ GH 6 sử dụng cơ chế nghịch đảo.

Hầu hết các cellulase có một mô-đun liên kết carbohydrate (CBM), các CBM có trách nhiệm liên kết các enzyme với vùng cellulose tinh thể để tăng cường hoạt động của enzyme. Hiện nay nhiều CBM đã được xác định và phân loại thành 54 họ, tuy nhiên chỉ có một số họ (1, 13, 14, 18- 21, 24, 29, 32, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 47, 48, 50 và 52) được tìm thấy trong nấm mốc [9], [18], [61]. Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu: Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase. Mặc dù β-glucosidase không phân hủy trực tiếp cellulose, nhưng nó vẫn được coi là một thành phần của hệ thống cellulase vì nó kích thích quá trình thủy phân cellulose.

Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng. Trọng lượng Nhiệt Cơ chất tối pH tối Glycosyl Enzyme phân tử độ tối ưu ưu hóa (kDa) ưu Endo-1,4-β- Cellulose vô Monomer Chủ yếu Không có 50-70 glucanase định hình (22-45) 4-5 hoặc rất thấp Cellobiohydrola Cellulose tinh Monomer Chủ yếu Không có 37-60 se thể (50-65) 4-5 hoặc rất thấp Monomer, Cellobiose, Khác Thường rất β-glucosidase dimer, trimer 45-75 cellodextrin nhau cao (35-450)  Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.