Tổng quan nghiên cứu

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và tại Việt Nam. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2020 ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca ung thư mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 200.000 ca mắc mới và tỷ lệ tử vong lên đến 73,5%, cao hơn mức trung bình toàn cầu là 59,7%. Đặc biệt, ung thư gan là một trong những loại ung thư phổ biến và nguy hiểm, với hơn 840.000 ca mắc mới và 700.000 ca tử vong trên toàn cầu năm 2018. Việt Nam đứng thứ 4 thế giới về tỷ lệ mắc ung thư gan, trong đó 78% nguyên nhân liên quan đến virus viêm gan B và C.

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và xác định các tính chất sinh học của exosome từ tế bào ung thư gan nhằm làm rõ cơ chế tăng sinh mạch máu trong ung thư gan. Exosome là các túi ngoại bào kích thước 30-150 nm, vận chuyển protein, lipid và vật chất di truyền, đóng vai trò quan trọng trong giao tiếp tế bào và phát triển khối u thông qua việc thúc đẩy tăng sinh mạch máu. Mục tiêu nghiên cứu là chế tạo thiết bị vi lưu nuôi cấy đồng thời tế bào ung thư gan và tế bào mạch máu, phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy, đánh giá đặc điểm và tác động của exosome lên sự phát triển tế bào nội mô mạch máu.

Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2022, sử dụng dòng tế bào HepG2 (ung thư gan) và HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch người). Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư gan mới, đặc biệt là hướng điều trị dựa trên cơ chế ngăn chặn tăng sinh mạch máu, góp phần giảm tỷ lệ tử vong do ung thư gan tại Việt Nam và trên thế giới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: lý thuyết tăng sinh mạch máu (angiogenesis) và vai trò của exosome trong giao tiếp tế bào. Tăng sinh mạch máu là quá trình hình thành mạch máu mới từ mạch máu hiện có, được kích hoạt bởi các yếu tố như VEGF-A và metalloproteinase (MMPs). Quá trình này giúp cung cấp oxy và dưỡng chất cho tế bào ung thư phát triển và di căn. Exosome, các túi ngoại bào kích thước 30-150 nm, vận chuyển các phân tử sinh học như protein, lipid, microRNA, đóng vai trò trung gian trong việc truyền tín hiệu giữa tế bào ung thư và tế bào nội mô, thúc đẩy tăng sinh mạch máu và phát triển khối u.

Các khái niệm chính bao gồm:

  • Exosome: túi ngoại bào vận chuyển tín hiệu sinh học.
  • VEGF-A: yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, kích thích tăng sinh mạch.
  • MMPs: enzyme phân hủy chất nền ngoại bào, hỗ trợ di chuyển tế bào nội mô.
  • HIF-1: yếu tố kích thích tăng sinh mạch trong điều kiện thiếu oxy.
  • Thiết bị vi lưu: hệ thống nuôi cấy tế bào nhỏ gọn, cho phép nuôi cấy đồng thời và phân lập môi trường nuôi cấy riêng biệt.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng dòng tế bào HepG2 (ung thư gan người) và HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch người) được nuôi cấy trong thiết bị vi lưu chế tạo từ vật liệu PMMA và kính, với khối hydrogel PEGDA làm ngăn cách. Thiết bị được thiết kế và gia công bằng công nghệ cắt và khắc laser, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất quy mô phòng thí nghiệm.

Quy trình nuôi cấy: tế bào HepG2 và HUVEC được bơm vào hai giếng riêng biệt trong thiết bị với nồng độ 10^3 tế bào/mL, môi trường nuôi cấy được luân chuyển qua khối hydrogel với tốc độ 0,3 µL/phút trong 72 giờ. Exosome được phân lập từ môi trường nuôi cấy tế bào HepG2 bằng bộ kit kết tủa ExoQuick-TC, sau đó được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (25°C, 4°C, -20°C, -80°C) để khảo sát độ ổn định.

Phân tích kích thước và điện tích bề mặt exosome được thực hiện bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Các phân tử đánh dấu bề mặt exosome (CD63, CD81, NKG2D, HSP70) được xác định bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy (FACS) và Western blot. Ảnh hưởng của exosome lên sự phát triển tế bào HUVEC được đánh giá qua số lượng tế bào sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy bổ sung exosome.

Cỡ mẫu gồm ít nhất ba thí nghiệm độc lập cho mỗi phân tích, dữ liệu được xử lý thống kê bằng phương pháp Student-t với mức ý nghĩa p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Chế tạo thiết bị vi lưu thành công với chi phí dưới 100.000 VNĐ, thiết bị có khả năng nuôi cấy đồng thời tế bào HepG2 và HUVEC, duy trì sự sống sót tế bào trên 95% sau 72 giờ. Dòng môi trường nuôi cấy lưu thông ổn định qua khối hydrogel PEGDA 8%, đảm bảo trao đổi chất giữa hai vùng nuôi cấy.

  2. Phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy HepG2 thu được 1 mg exosome từ 3 L dịch nuôi cấy, kích thước trung bình 65,4 nm, điện thế zeta -7,78 mV, phù hợp với đặc điểm exosome chuẩn. Hình ảnh TEM xác nhận kích thước và hình dạng túi ngoại bào.

  3. Độ ổn định exosome phụ thuộc nhiệt độ bảo quản: ở 25°C và 4°C, kích thước và chỉ số đồng nhất (PDI) tăng nhanh, đến ngày 14 kích thước lên đến 436,5 nm và PDI vượt ngưỡng 0,2, cho thấy sự kết tụ và không ổn định. Ở -20°C, kích thước tăng chậm hơn, PDI vẫn trong giới hạn chấp nhận. Ở -80°C, exosome duy trì kích thước và PDI ổn định nhất trong 14 ngày, phù hợp cho bảo quản dài hạn.

  4. Exosome biểu hiện các dấu hiệu đặc trưng CD63, CD81 và NKG2D, trong đó khoảng 25% exosome biểu hiện HSP70, cho thấy exosome mang đặc tính của tế bào nguồn HepG2. Western blot xác nhận sự hiện diện của NKG2D trên tế bào HepG2 và exosome phân lập, chứng minh exosome có thể làm dấu ấn sinh học cho ung thư gan.

  5. Exosome từ HepG2 thúc đẩy sự phát triển tế bào HUVEC: sau 72 giờ nuôi cấy bổ sung exosome, số lượng tế bào HUVEC tăng đáng kể so với đối chứng không bổ sung (p < 0,05), tương tự hiệu quả khi nuôi cấy đồng thời HepG2 và HUVEC trong hệ vi lưu. Điều này chứng minh exosome đóng vai trò quan trọng trong tăng sinh mạch máu, hỗ trợ phát triển khối u.

Thảo luận kết quả

Thiết bị vi lưu chế tạo từ PMMA và kính với khối hydrogel PEGDA 8% cho phép nuôi cấy đồng thời hai loại tế bào riêng biệt nhưng vẫn duy trì trao đổi tín hiệu qua môi trường nuôi cấy, tạo điều kiện thuận lợi cho phân lập exosome. So với các mô hình nuôi cấy hai chiều truyền thống, hệ vi lưu mô phỏng tốt hơn môi trường sinh lý ba chiều, giúp nghiên cứu tương tác tế bào chính xác hơn.

Kết quả phân lập exosome có kích thước và điện tích phù hợp với các nghiên cứu trước đây, đồng thời độ ổn định exosome được bảo quản tốt nhất ở -80°C, phù hợp cho các ứng dụng nghiên cứu và lâm sàng. Việc phát hiện các dấu hiệu đặc trưng trên exosome như CD63, CD81 và NKG2D khẳng định nguồn gốc từ tế bào ung thư gan, mở ra khả năng sử dụng exosome làm dấu ấn sinh học trong chẩn đoán và theo dõi ung thư gan.

Ảnh hưởng tích cực của exosome lên sự phát triển tế bào nội mô HUVEC chứng minh vai trò của exosome trong cơ chế tăng sinh mạch máu, phù hợp với lý thuyết về việc tế bào ung thư sử dụng exosome để vận chuyển các yếu tố như VEGF, MMPs nhằm thúc đẩy hình thành mạch máu mới nuôi dưỡng khối u. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về vai trò của exosome trong ung thư và tăng sinh mạch máu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ kích thước exosome theo thời gian bảo quản, biểu đồ tăng trưởng tế bào HUVEC với và không có exosome, cũng như bảng so sánh các dấu hiệu phân tử trên exosome và tế bào nguồn.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ứng dụng thiết bị vi lưu trong nghiên cứu ung thư: Khuyến nghị các phòng thí nghiệm sinh học và y sinh học áp dụng thiết bị vi lưu chế tạo từ PMMA và kính để nuôi cấy đồng thời tế bào ung thư và tế bào nội mô, giúp phân lập exosome hiệu quả, tiết kiệm chi phí và thời gian. Thời gian triển khai: 6-12 tháng.

  2. Bảo quản exosome ở nhiệt độ -80°C để duy trì tính ổn định về kích thước và chức năng sinh học, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng lâm sàng. Chủ thể thực hiện: các trung tâm nghiên cứu và bệnh viện.

  3. Phát triển các xét nghiệm chẩn đoán dựa trên dấu hiệu exosome như NKG2D để phát hiện sớm ung thư gan, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tỷ lệ tử vong. Thời gian nghiên cứu và phát triển: 2-3 năm.

  4. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của exosome lên tăng sinh mạch máu và thử nghiệm các thuốc ức chế exosome hoặc ngăn chặn tín hiệu tăng sinh mạch máu nhằm phát triển liệu pháp điều trị ung thư gan mới. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu và công ty dược phẩm, thời gian 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu sinh học tế bào và ung thư: Nghiên cứu về cơ chế tăng sinh mạch máu và vai trò của exosome trong ung thư gan, sử dụng thiết bị vi lưu để mô phỏng môi trường sinh học.

  2. Bác sĩ và chuyên gia y học lâm sàng: Áp dụng kiến thức về exosome làm dấu ấn sinh học trong chẩn đoán và theo dõi tiến triển ung thư gan, hỗ trợ lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

  3. Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và dược phẩm: Phát triển các sản phẩm xét nghiệm chẩn đoán dựa trên exosome và nghiên cứu thuốc ức chế tăng sinh mạch máu.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, y sinh học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong hệ vi lưu và phân lập exosome, nâng cao kỹ năng thực nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Exosome là gì và tại sao quan trọng trong nghiên cứu ung thư?
    Exosome là các túi ngoại bào nhỏ vận chuyển protein, lipid và RNA giữa các tế bào. Chúng đóng vai trò quan trọng trong giao tiếp tế bào, đặc biệt trong ung thư, giúp tế bào ung thư truyền tín hiệu thúc đẩy tăng sinh mạch máu và di căn.

  2. Thiết bị vi lưu có ưu điểm gì so với phương pháp nuôi cấy truyền thống?
    Thiết bị vi lưu cho phép nuôi cấy đồng thời nhiều loại tế bào trong môi trường riêng biệt nhưng vẫn duy trì trao đổi tín hiệu qua môi trường nuôi cấy, mô phỏng tốt hơn môi trường sinh lý, tiết kiệm chi phí và thời gian.

  3. Làm thế nào để phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào?
    Sử dụng bộ kit kết tủa polymer như ExoQuick-TC, kết hợp ly tâm và lọc để thu nhận exosome từ dịch nuôi cấy, sau đó bảo quản và phân tích đặc tính bằng DLS, TEM và các kỹ thuật sinh học phân tử.

  4. Điều kiện bảo quản exosome tốt nhất là gì?
    Bảo quản ở nhiệt độ -80°C giúp duy trì kích thước và tính đồng nhất của exosome trong thời gian dài, tránh hiện tượng kết tụ và mất chức năng sinh học.

  5. Exosome ảnh hưởng như thế nào đến sự phát triển của tế bào nội mô mạch máu?
    Exosome từ tế bào ung thư gan chứa các yếu tố như VEGF và microRNA thúc đẩy tăng sinh mạch máu bằng cách kích thích tế bào nội mô phát triển, hỗ trợ nuôi dưỡng và phát triển khối u.

Kết luận

  • Thiết bị vi lưu chế tạo thành công với chi phí thấp, cho phép nuôi cấy đồng thời tế bào ung thư gan và tế bào nội mô, duy trì sự sống sót cao.
  • Exosome phân lập từ tế bào HepG2 có kích thước trung bình 65,4 nm, điện tích gần trung tính, biểu hiện các dấu hiệu đặc trưng CD63, CD81 và NKG2D.
  • Bảo quản exosome ở -80°C duy trì tính ổn định tốt nhất trong 14 ngày.
  • Exosome thúc đẩy sự phát triển tế bào nội mô HUVEC, chứng minh vai trò trong tăng sinh mạch máu và phát triển ung thư gan.
  • Nghiên cứu mở ra hướng điều trị ung thư gan mới dựa trên ngăn chặn tăng sinh mạch máu và ứng dụng exosome làm dấu ấn sinh học.

Tiếp theo, cần triển khai nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử của exosome trong tăng sinh mạch máu và phát triển các liệu pháp điều trị dựa trên kết quả này. Các nhà nghiên cứu và chuyên gia y tế được khuyến khích áp dụng thiết bị vi lưu và kỹ thuật phân lập exosome để mở rộng ứng dụng trong nghiên cứu và điều trị ung thư.