Nghiên cứu đặc điểm đột biến FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy tại Việt Nam

Nghiên cứu đột biến FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy Việt Nam. Phân tích đặc điểm phân tử và sàng lọc đột biến FLT3.

• Tác giả: Đỗ Thị Thanh Trung
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yến
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML)
• 1.2. Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.3. Phân loại các thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML
• 1.5. Hướng điều trị đối với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.6. Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.7. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3
• 1.8. Các loại đột biến FLT3
• 1.9. Mối liên hệ giữa đột biến trên gen FLT3 và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.10. Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các hóa chất và bộ kít
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. Phương pháp
• 2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu máu
• 2.3.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến
• 2.3.3. Nhân dòng gen FLT3 chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• 2.3.4. Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phể băng đột biến
• 2.3.5. Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger
• 2.3.6. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số
• 3.2. Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD
• 3.2.1. Thiết kế trình tự mồi
• 3.2.2. Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến FLT3
• 3.2.3. Bước đầu sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm
• 3.3. Kết quả đưa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp
• 3.4. Phân tích các đặc điểm phân tử của đột biến gen FLT3-ITD
• 3.4.1. Số lượng đột biến gen FLT3-ITD trong một mẫu (số đột biến/mẫu)
• 3.4.2. Kích thước đột biến
• 3.4.3. Trình tự đột biến
• 3.4.4. Mức độ đột biến
• 4. KẾT LUẬN
• 5. KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Đột biến FLT3 là gì Tổng quan gen trong bệnh AML

Đột biến gen FLT3 là một trong những thay đổi di truyền phổ biến và có ý nghĩa lâm sàng quan trọng nhất trong bệnh bạch cầu myeloid cấp tính (AML), hay còn gọi là ung thư bạch cầu cấp dòng tủy. Gen này đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa sự tăng trưởng, biệt hóa và sống còn của các tế bào gốc tạo máu. Khi xảy ra đột biến, gen FLT3 có thể bị kích hoạt liên tục, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát của các nguyên bào tủy ác tính, là đặc điểm cốt lõi của AML. Việc hiểu rõ về các loại đột biến này, đặc biệt là FLT3-ITD và FLT3-TKD, là nền tảng để chẩn đoán chính xác, tiên lượng bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Các nghiên cứu, bao gồm cả những công trình tại Việt Nam, đã xác nhận sự hiện diện của đột biến này và đang nỗ lực xây dựng quy trình sàng lọc hiệu quả. Việc xác định tình trạng đột biến FLT3 không chỉ giúp phân loại nguy cơ cho bệnh nhân mà còn mở ra cơ hội tiếp cận các liệu pháp nhắm trúng đích hiện đại, mang lại hy vọng cải thiện kết quả điều trị so với hóa trị liệu truyền thống.

1.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 và thụ thể tyrosine kinase

Gen FLT3 (FMS-like Tyrosine Kinase-3) nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa cho một protein thụ thể xuyên màng thuộc họ thụ thể tyrosine kinase loại III. Protein FLT3 đóng vai trò là một 'công tắc' phân tử trên bề mặt các tế bào gốc tạo máu non trong tủy xương. Ở trạng thái bình thường, protein này chỉ được kích hoạt khi có phối tử (ligand) đặc hiệu gắn vào, tạo ra sự dimer hóa và phosphoryl hóa, từ đó khởi động một chuỗi các tín hiệu nội bào. Các tín hiệu này điều khiển chặt chẽ quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào, đảm bảo các tế bào máu được tạo ra một cách có trật tự. Cấu trúc của protein FLT3 bao gồm một miền ngoại bào, một miền xuyên màng, một miền cận màng (JM) và hai miền tyrosine kinase (TKD) nội bào. Sự toàn vẹn của các miền này, đặc biệt là miền JM và TKD, là cực kỳ quan trọng để duy trì chức năng điều hòa bình thường của tế bào.

1.2. Phân loại hai đột biến chính FLT3 ITD và FLT3 TKD

Có hai loại đột biến chính trên gen FLT3 thường gặp trong AML. Loại thứ nhất và phổ biến hơn là FLT3-ITD (Internal Tandem Duplication - lặp đoạn nội phân tử). Đột biến này xảy ra khi một đoạn gen ở vùng cận màng (mã hóa bởi exon 14 và 15) bị nhân đôi và chèn vào ngay sau đó. Hậu quả là cấu trúc protein bị thay đổi, khiến thụ thể luôn ở trạng thái 'bật' mà không cần đến phối tử, dẫn đến tín hiệu tăng sinh liên tục. Loại thứ hai là FLT3-TKD (Tyrosine Kinase Domain - đột biến điểm ở miền tyrosine kinase), thường là đột biến thay thế axit amin Aspartic ở vị trí 835 (D835). Đột biến này cũng gây ra sự kích hoạt thụ thể một cách độc lập, mặc dù cơ chế có phần khác so với FLT3-ITD. Cả hai loại đột biến đều là tác nhân thúc đẩy bệnh, nhưng FLT3-ITD thường liên quan đến tiên lượng bệnh AML xấu hơn.

II. Thách thức từ đột biến FLT3 Tiên lượng xấu cho AML

Sự hiện diện của đột biến FLT3, đặc biệt là FLT3-ITD, được xem là một trong những yếu tố tiên lượng xấu hàng đầu đối với bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy. Các nghiên cứu trên toàn thế giới đã chứng minh một cách nhất quán rằng bệnh nhân AML có đột biến này thường có số lượng bạch cầu cao hơn tại thời điểm chẩn đoán, tỷ lệ đạt được lui bệnh hoàn toàn thấp hơn và quan trọng nhất là nguy cơ tái phát AML cao hơn đáng kể so với nhóm không có đột biến. Điều này đặt ra một thách thức lớn trong điều trị. Các phác đồ hóa trị liệu tiêu chuẩn thường kém hiệu quả hơn ở nhóm bệnh nhân này. Hơn nữa, sự kích hoạt liên tục con đường tín hiệu FLT3 còn thúc đẩy khả năng kháng thuốc điều trị của các tế bào ác tính. Do đó, việc xác định sớm đột biến FLT3 là yêu cầu cấp thiết để phân tầng nguy cơ và xây dựng một chiến lược điều trị tích cực hơn, có thể bao gồm ghép tế bào gốc hoặc các liệu pháp tiên tiến khác.

2.1. Cơ chế gây bệnh Tăng sinh nguyên bào tủy không kiểm soát

Cơ chế cốt lõi mà đột biến FLT3 gây ra AML là thông qua việc kích hoạt liên tục các con đường truyền tín hiệu xuôi dòng như PI3K/AKT và RAS/MAPK. Các con đường này vốn dĩ điều khiển sự sống còn và tăng sinh của tế bào. Khi gen FLT3 bị đột biến, tín hiệu 'tăng trưởng' được gửi đi không ngừng nghỉ, khiến các nguyên bào tủy (tế bào máu non) phân chia một cách mất kiểm soát. Các tế bào này không thể trưởng thành để thực hiện chức năng bình thường, thay vào đó chúng tích tụ với số lượng lớn trong tủy xương. Sự tích tụ này lấn át không gian và nguồn lực dành cho việc sản xuất các tế bào máu khỏe mạnh khác như hồng cầu và tiểu cầu. Hậu quả lâm sàng là bệnh nhân bị thiếu máu, nhiễm trùng và chảy máu, những triệu chứng đặc trưng của bệnh bạch cầu cấp.

2.2. Nguy cơ tái phát AML và tình trạng kháng thuốc điều trị

Một trong những thách thức lớn nhất liên quan đến đột biến FLT3 là nguy cơ tái phát AML rất cao. Ngay cả khi bệnh nhân đạt được lui bệnh sau đợt hóa trị liệu tấn công đầu tiên, các tế bào bạch cầu ác tính mang đột biến FLT3 có khả năng tồn tại và phát triển trở lại. Sự kích hoạt liên tục của thụ thể FLT3 dường như cung cấp một lợi thế sống còn cho các tế bào ung thư, giúp chúng chống lại tác động gây chết của hóa chất. Điều này dẫn đến tình trạng kháng thuốc điều trị. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tế bào này có khả năng tự bảo vệ và phục hồi hiệu quả hơn sau tổn thương do hóa trị. Do đó, việc chỉ sử dụng phác đồ hóa trị đơn thuần thường không đủ để loại bỏ triệt để quần thể tế bào ác tính này, đòi hỏi các phương pháp điều trị bổ sung và mạnh mẽ hơn.

III. Phương pháp xét nghiệm di truyền đột biến FLT3 hiệu quả

Việc chẩn đoán chính xác sự hiện diện của đột biến FLT3 là bước quyết định để xây dựng phác đồ điều trị tối ưu. Hiện nay, các xét nghiệm di truyền phân tử là tiêu chuẩn vàng để phát hiện những thay đổi này. Phương pháp phổ biến và kinh điển nhất để sàng lọc đột biến FLT3-ITD là Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR). Kỹ thuật này khuếch đại đoạn gen chứa vùng cận màng, sau đó sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel. Sự hiện diện của một băng ADN có kích thước lớn hơn băng bình thường cho thấy có đột biến lặp đoạn. Đây là phương pháp được đề cập trong nghiên cứu của Đỗ Thị Thanh Trang (2014) nhằm thiết lập quy trình sàng lọc tại Việt Nam. Ngoài ra, các kỹ thuật tiên tiến hơn như Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cũng đang được áp dụng, cho phép phát hiện đồng thời cả FLT3-ITD, FLT3-TKD và nhiều đột biến gen khác trong một lần xét nghiệm, cung cấp một bức tranh toàn diện về hồ sơ di truyền của khối u.

3.1. Kỹ thuật PCR và điện di để sàng lọc đột biến FLT3 ITD

Quy trình sàng lọc đột biến FLT3-ITD bằng PCR và điện di là một phương pháp đáng tin cậy và tương đối dễ thực hiện. Đầu tiên, ADN tổng số được tách chiết từ mẫu máu hoặc tủy xương của bệnh nhân. Sau đó, một cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại đoạn gen FLT3 bao quanh vùng thường xảy ra lặp đoạn (exon 14-15). Phản ứng PCR sẽ tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn gen này. Sản phẩm PCR sau đó được chạy điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide. Đối với bệnh nhân không có đột biến, chỉ một băng ADN với kích thước chuẩn (khoảng 330 bp) sẽ xuất hiện. Ngược lại, ở bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD, bên cạnh băng chuẩn, sẽ có thêm ít nhất một băng ADN có kích thước lớn hơn, tương ứng với đoạn gen đã bị chèn thêm một đoạn lặp. Kích thước của đoạn lặp có thể được ước tính dựa trên độ di chuyển của băng này so với thang chuẩn.

3.2. Vai trò sàng lọc trong xây dựng phác đồ điều trị AML

Việc sàng lọc đột biến FLT3 có vai trò then chốt trong việc cá thể hóa điều trị. Kết quả xét nghiệm di truyền giúp các bác sĩ phân loại bệnh nhân vào các nhóm nguy cơ khác nhau. Bệnh nhân có đột biến FLT3 được xếp vào nhóm nguy cơ cao và cần một phác đồ điều trị AML tích cực hơn. Ví dụ, các hướng dẫn điều trị quốc tế hiện nay khuyến nghị bổ sung một thuốc ức chế FLT3 như Midostaurin (Rydapt) vào phác đồ hóa trị tấn công cho bệnh nhân AML mới chẩn đoán có đột biến FLT3. Đối với trường hợp bệnh tái phát hoặc kháng trị, việc xét nghiệm lại tình trạng đột biến là cần thiết để lựa chọn các thuốc ức chế thế hệ mới như Gilteritinib (Xospata). Sàng lọc không chỉ định hướng lựa chọn thuốc ban đầu mà còn là công cụ theo dõi bệnh tồn dư tối thiểu (MRD), giúp đánh giá hiệu quả điều trị và phát hiện sớm nguy cơ tái phát AML.

IV. Cách mạng hóa điều trị AML với liệu pháp nhắm trúng đích

Sự ra đời của các liệu pháp nhắm trúng đích đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có đột biến FLT3. Thay vì tiêu diệt tế bào không chọn lọc như hóa trị liệu, các loại thuốc này được thiết kế để tấn công một cách đặc hiệu vào protein FLT3 bị đột biến, vốn là động lực chính thúc đẩy sự phát triển của khối u. Bằng cách ức chế hoạt động của thụ thể tyrosine kinase bất thường này, các thuốc ức chế FLT3 có thể chặn đứng con đường tín hiệu tăng sinh, buộc các tế bào ung thư phải ngừng phân chia và chết theo chương trình (apoptosis). Các thử nghiệm lâm sàng lớn đã chứng minh rằng việc kết hợp các chất ức chế FLT3 với hóa trị liệu giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ sống sót chung và thời gian sống không bệnh tật ở bệnh nhân AML. Đây là một bước tiến vượt bậc, mang lại hy vọng mới cho nhóm bệnh nhân có tiên lượng bệnh AML vốn rất khó khăn.

4.1. Các thuốc ức chế FLT3 Midostaurin và Gilteritinib

Các thuốc ức chế FLT3 được chia thành nhiều thế hệ. Thế hệ đầu tiên, tiêu biểu là Midostaurin (Rydapt) và Sorafenib, là các chất ức chế đa kinase, tác động lên cả FLT3 và nhiều protein kinase khác. Midostaurin là thuốc đầu tiên được FDA phê duyệt để kết hợp với hóa trị tiêu chuẩn cho bệnh nhân AML mới chẩn đoán có đột biến FLT3. Thế hệ thứ hai, bao gồm Gilteritinib (Xospata) và Quizartinib, có tính đặc hiệu và hiệu lực cao hơn đối với FLT3. Gilteritinib được phê duyệt để điều trị cho bệnh nhân người lớn bị tái phát AML hoặc kháng trị có đột biến FLT3. Các thuốc thế hệ mới này cho thấy khả năng gây lui bệnh cao hơn và cải thiện tỷ lệ sống sót so với hóa trị cứu vớt đơn thuần ở nhóm bệnh nhân khó điều trị này. Việc lựa chọn thuốc phụ thuộc vào giai đoạn bệnh và tình trạng của bệnh nhân.

4.2. So sánh hiệu quả với hóa trị liệu và ghép tế bào gốc

Liệu pháp nhắm trúng đích không thay thế hoàn toàn các phương pháp truyền thống mà hoạt động bổ trợ để tăng cường hiệu quả. Khi kết hợp với hóa trị liệu, các thuốc ức chế FLT3 giúp tăng độ sâu của đáp ứng, tiêu diệt hiệu quả hơn các tế bào ác tính. So với hóa trị đơn thuần, phác đồ kết hợp này giúp kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Về phần ghép tế bào gốc (ghép tủy), đây vẫn là phương pháp điều trị triệt căn tiềm năng nhất cho bệnh nhân AML nguy cơ cao, bao gồm cả nhóm có đột biến FLT3. Vai trò của thuốc ức chế FLT3 trong bối cảnh này là rất quan trọng: chúng có thể được sử dụng như một liệu pháp 'bắc cầu' để đưa bệnh nhân về trạng thái lui bệnh hoàn toàn trước khi ghép, hoặc dùng như một liệu pháp duy trì sau ghép để giảm nguy cơ tái phát. Sự kết hợp thông minh giữa ba phương pháp này đang là hướng đi chính trong điều trị hiện nay.

V. Nghiên cứu đột biến FLT3 tại Việt Nam Kết quả thực tiễn

Việc nghiên cứu đặc điểm phân tử của đột biến FLT3 ở bệnh nhân Việt Nam có ý nghĩa vô cùng quan trọng để hiểu rõ hơn về dịch tễ học và đặc điểm sinh học của bệnh tại địa phương. Các nghiên cứu ban đầu, như luận văn của Đỗ Thị Thanh Trang (2014), đã tiên phong trong việc thiết lập quy trình sàng lọc và phân tích các đột biến này. Mặc dù quy mô mẫu còn hạn chế, những kết quả này cung cấp cái nhìn đầu tiên về tỷ lệ và đặc điểm của đột biến FLT3-ITD trong quần thể bệnh nhân AML tại Việt Nam. Việc xác định được tỷ lệ mắc bệnh, kích thước và vị trí của các đoạn lặp là cơ sở khoa học quý giá. Những dữ liệu này không chỉ giúp đối chiếu với các nghiên cứu quốc tế mà còn là nền tảng để xây dựng các hướng dẫn chẩn đoán và điều trị phù hợp với điều kiện thực tế trong nước, hướng tới việc áp dụng các liệu pháp điều trị tiên tiến một cách hiệu quả và kịp thời.

5.1. Tỷ lệ đột biến FLT3 ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp

Một trong những kết quả đáng chú ý từ nghiên cứu tiên phong tại Việt Nam là việc xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD. Trong nghiên cứu sàng lọc trên 200 mẫu bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư bạch cầu cấp dòng tủy, tỷ lệ phát hiện các mẫu có khả năng chứa đột biến FLT3-ITD là 7.5% (15/200 mẫu). Con số này có thể thấp hơn so với một số báo cáo từ các nước phương Tây (thường dao động từ 15-35%), nhưng tương đồng với một số nghiên cứu khác trong khu vực châu Á. Sự khác biệt này có thể do đặc điểm di truyền của quần thể, phương pháp chọn mẫu hoặc các yếu tố ngẫu nhiên. Tuy nhiên, kết quả này khẳng định rằng đột biến FLT3 là một vấn đề hiện hữu và cần được quan tâm trong công tác chẩn đoán và điều trị AML tại Việt Nam. Cần có thêm các nghiên cứu quy mô lớn hơn để đưa ra con số thống kê chính xác hơn.

5.2. Đặc điểm phân tử và ý nghĩa tiên lượng từ xét nghiệm

Ngoài việc xác định tỷ lệ, các nghiên cứu ban đầu còn đi sâu vào phân tích đặc điểm phân tử của các đột biến FLT3-ITD được tìm thấy. Các phân tích cho thấy sự đa dạng về kích thước của đoạn lặp, dao động từ vài chục đến gần một trăm cặp base. Một số bệnh nhân thậm chí còn mang nhiều hơn một loại đột biến lặp đoạn trên cùng một mẫu. Những đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng về mặt tiên lượng bệnh AML. Một số nghiên cứu quốc tế đã gợi ý rằng tỷ lệ allele (mức độ đột biến) và kích thước của đoạn lặp có thể ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của bệnh. Việc có được dữ liệu phân tử chi tiết từ các thử nghiệm lâm sàng và nghiên cứu trong nước sẽ giúp các bác sĩ hiểu rõ hơn về sinh học khối u, từ đó đưa ra những dự đoán chính xác hơn về diễn tiến bệnh và đáp ứng điều trị cho từng bệnh nhân cụ thể.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIIOA HỌC TỰ NIIÊN Đỗ Thị Thanh Trung SANG LOC VA PHAN TICH BAC DIEM PHAN TU CAC DOT BIEN FLT3 XUAT HIEN TREN BENH NHAN MAC BENH UNG THU’ BACH CAU CAP DONG TUY G VIET NAM LUAN VAN THAC SIKHOA HOC 11à Nội - Năm 2014 Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang PAI HOC QUOC GIA HA NỘI TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HOC TU NHIÊN Dỗ Thị Thanh Trung SANG LOC VA PHAN TICH DAC DIEM PHAN TU CAC DOT BIEN TLT3 XUẤT IMEN TREN BỆNH NHÂN MAC BENILUNG THU BACH CAU CAP DONG TUY G VLET NAM. Chuyén nganh: Sinh hoc thue nghiém Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SÍKHOA HỌC. NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HOC: TS. PHAM BAO YEN Ha Ndi — Nam 2014 Léi cim on Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang Em xin bày tố lòng biết ơn sâu sắc nhất dén 1S.

Pham Bao Yên người dã tận tình hướng dẫn chỉ bảo em trong suốt quá trình học tận và thực hiện luận văn. Em xin chân thành câm ơn các thấu cô trong Bộ môn Sinh ly thie vật và Hóa sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã rạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cho em hoàn thành luận văn Em cũng cảm ơn sự giúp đồ tạo điều kiện về vậi chất và trang thiết bị từ Phòng Enzym học và Phân tích hoạt tình Sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điễm Céng nghé protein va enzyme. Dé tai tee hién có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Thiết lập quụy trành phát biện một số đột biên trên gen KLT3, NPMI va CEBPA gay bénh ung the bach cau cấp dòng tủy ở bệnh nhân Việt Nam” mã số KI,BTT.02 của Phòng thí nghiệm Trong diém Céng ngh¢Enzyme va Protein, Dai hoc Quốc gia Hà Nội. Cuối cùng, em xin gửi lời căm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người thân đã kuôn â bên cạnh động viên, chia sẽ giúp đ'em.

lâm xin chân thành cảm ơn! Hạc viên D6 Thi Thanh Trung Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang MODAL. CHUONG1: TONG QUAN 1. Bénh ung thy back c: cắn dòng tấy (Acute Myelaid Leukemia-AML) 1. Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp động tây và tình hình ng hiện cứu trên thể giới và ở Việt Nam.

Phin loai cac thé bénb ung thu bach cau cap dong tidy. Các phương pháp chân đoán bệnh AM 13 1. Hướng điều trị đôi với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy. Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cân cấp đồng tủy.

Cấu trúc và chức năng của gen FLT3. Các loại dột biển ELT3. Mối liên bê giữa đột biển trên gen FILT3 và bệnh bạch cầu cá ip dong tiiy21 1. Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLTS trong chân đoán và điều trị AML.

22 CHUONG 2: NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP. Các hóa chất vả bộ lựt. Máy móc và thiết bị - - - - 25 2. Phương pháp.

Tach DNA téng số từ mẫu máu. Thiết kế cặp mỗi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến. 2? Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang 2. Nhân doan gen FLT3chửa đột biến với cặp môi đặc hiệu bằng, phần ứng, chuỗi polymerase (PCE)).4, Điện đi agarose boặc aorylarmidc để phân lích phé bang đột biến, 3.

Nhân đòng đoạn gen FL.T3 và đọc trình hy gen bằng phương pháp Sanger. Một số phần mẻm sử dụng trong luận văn. KET UA NGHIEN CUU VA THAO LUAN. Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số 3.

Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến gen FL/L3-LLD. Thiết kế trình tự mỗi. Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiên đột biến FT. Bước đầu sảng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm.

Kết quá đưa sản nhằm PCR vào vectv tái tổ hợp. Phan tich các đặc điểm phân tủ của đột biến gen ELT3-ITD. Số hrợng đột biển gen FLT3-TTD trong một mẫu (số đột biên/mẫu). Kích thước đột biến.

Trinh te dat bién.4 Mức độ đột hiến 45 KET LUAN. KIEN NGUI TAT LIEU THAM KHAO. Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang DANH MUC CAC BANG BIfU, HINH VE DANII MUC CAC BANG BIEU Trang Bang 1. Giá trí của phương pháp hình thải học và phương pháp 10 heá tế bảo trong chấn đoán phân dòng bệnh ung thư bạch cầu cấp Bang 1.2 Các chất ức chế kinase Tyrosine (TKIs) dược Cục Quản 19 lý thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (DA) phê chuẩn Bang 2.1 Thành phần của phân ting PCR doan gen FILT3 28 Bang 3.1 Nông độ của một số mẫu ADN tổng số 31 Bảng 3.2 Số băng có kích thước lớn hơn bing thường trên mẫu — 3E Bang 3.3 Dộ di động của các băng của marker trong điện di 39 Bảng 34 Kich thude cae dét bién FLT3-ITD 40 Tảng 3.5 Trình tự đột biển các đội biển F1UT3-TTD, 41 Bing 3.6 Múc độ đột biển trên mẫu (%) 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang, Hình 1.1 Sự phát sinh các loại tế bào máu 9 linh 1.2 Phân loại bệnh ung thư máu theo tế bảo học.3 Tỷ lệ dột biến của một số gen gây bệnh ung thu bạch 12 cau cấp (WHO, 2008) Hinh1.4 Cau we phan tirprotein FLT3 26 Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phân ứng PCR.1 Ảnh điện di ADN téng số sau khi tách 36 Tỉnh32 Quy trình pháthiện độtbiếngenFLT3ITD 37 Hinh 3.3 Điện đi sản phẩm PCR một số mẫu máu 38 Hình 3.4 Điện đi một số mẫu chứa đột biên FLT3-ITD 39 Hình35 — Điện disản phẩm ADN tình sach tir gel 40 Hình 3.6 kiểm tra ADN trong khuẩn lạc bằng PCR.7 Đường chuẩn xác định kích thước băng điện di 45 Hinh 3.8 Trình tự protein của một số mẫu đột biến AG Taiän văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHY VIET TAT Ki hiệu, Chữ viết đầy đủ Nội đưng đây đủ Aeule T.cukemia Bach cau cap dong lympho Avutc Mycloid T.cukemia Bach cau cap dong tủy Acute Myeloid Leukemia - Bach cdu cap ding bly —kidu normal karyotype tình NST bình thường ATP Adenosine triphosphate Phần tử ATP ATRA Alltrans retinoic acid Acct all-trans retinoic Brain and Acute 3 BAALC Leukemia, Cytoplasmic Tên gen CBF Core binding factor Yến tố bám ` CEBPA CCAAT-enhancer binding Protein bam : vdeo trinh ty ting protein a.

cudmg CCAAT a Cu Chronic Lymphoid Leukernia | Bach cdumén dong lyinpho Chronic Myclogenous Bệnh mãn lĩnh đồng tủy rong CML-DC Leukemia in Blastic Crisis thời ki phát bệnh ERG V-Es Avian VinsHrytlroblastosis H26 Tên gena KAB French-American-British Hệ thêng phân loại bệnh bạch : cầu Pháp-Mỹ-Anh. FDA Food & Drug Administration | Cuc Quản lý thực ă n phẩm T rợ và Dược phẩm Mỹ TLK2 Fetal liver kinase 2 Tén enzyme FLT3 Fims-like tyrosine kinase 3 Tén enzyme Enzyme isocitrate ` IDH deliydrogenase Tén enzyme TTD Tntermal tandem đụpHeatien —- | Tặp đoạn ngẫu nhiên nội phẩm tử IM Juxtamembrane Ving can mang v-kit Hardy-Znckerman 4 feline KIT sarcoma viral oncogene Tên gen homolog, MIL Mixed lineage leukemia Bạch cầu Taiän văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang MM Multiple Mycloma Bệnh uug thư da đỏng tủy xương NPMI Nucleophosmin 1 Tên gen PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phan tng polymerase ; RELE Restriction fragment length | Tinh da hinh dé dai. doan cat nha polymorphism enzyme giới hạn. sscp — SinglesuandeonfenmaHeml polymorphism | pb oh edu tre mach don srls7, — ŸlEtaHbmmsduetionindiblor | Chất úc chế dẫn tuyềnth: hiệu %1 #1 8IK1 8tem celÍ kmase 1 Kinase eta té bao nguồn 1 TKD Tyrosine kinase domain Céu tric tyrosine kinase TKIs Tyrosine Kinase Inhibitor Các chất úc chế kinase Tyrosme TM Transmembrane Vimg xuyén mang WHO World health organivalion Tổ chức y tế thế giới Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang MO DAU Tiên nay, dĩ truyền học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học ở cấp độ phân tử (gen và hệ gen) ngày cảng được xem một tiêu chuản quan treng trong chân doan và tiên lượng các loại bệnh, trong đó có bệnh img thir bach cau.

Ung thư bạch câu được chia làm 4 loại tùy theo tính chất cấp Linh hay mạn tính và phần loại tế bảo dòng tủy hay dong lympho. Va theo thông kẽ trên thế giới, ưng thư bạch cầu cấp đông tủy (AML) là loại có mức độ phổ biển cao và bộc phát nhanh nên được quan tầm nhất. Các bác sĩ thường tiến hành các xét nghiệm dị truyền đối với bệnh nhân. ung thu bach cau cấp dòng tủy, nhằm quyết định phác để điểu trị đặc hiệu cho người bệnh đề đạt được kết quả tốt nhất.

Hầu hắt bệnh nhân tp thư bach cau cập déng tủy đạt t lệ hủ bệnh 100% sau một đợt điều trị tấn công, 75- 80% lui béuh “hoàn toàn trên 5 năm và phần nhiều trong số đó có thê coi là đã được chữa khởi. Ủng thư bạch câu cap dong tiy cé dic điểm là các tế bảo tăng sinh không kiểm soát, chưa biết hoá, gợi là ào non, cùng với các đặc điểm (ế bảo dòng tuỷ Tỷ lệ mắc là 1/150.000 trong suốt thời kỳ niên thiểu và đậy thì. Thắng kẻ cho thấy„ xnỗi năm số bệnh nhân vào Viên Huyết học Truyền máu ung ương đều gia tăng , và trong tổng số bệnh nhân bị ung thư máu có tới 2⁄3 bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp đồng tủy. Hầu hết cáo trường hợp nay déu không có nguyên nhân rõ ràng.

Tuy xhiên, một số nghiên cứu đã chỉ rø mối liên quan giữa ty lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan như nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hỏa chất, hoặc kèm theo mắc các bệnh. khảo như thiểu máu Fanconi bay hội chúng Down. Ngoài ra, ung thư bạch cầu cấp đồng tủy phát sinh đo các tay dỗi bất thường (dột biến) trong tế bào gốc tạo bạch câu gây ra trong đời sống của một cá thể, lảm rồi loạn quá trình sản sinh bạch câu, tao ra nhiều tế bảa bạch câu bat thường, dẫn đến mắt chức năng bảo vệ co thể. Nếu không được chân đoán, điểu trị kịp thời và hiệu qué, bệnh nhân AML só thể tử vong, do bị nhiễm tring, chảy máu, thiếu máu.

Những bệnh nhân đã phát hiện ra bệnh ung thư bạch câu cấp thường sẽ được điều trị ngay, nhằm tiêu diệt các tế bảo bạch cầu ác tỉnh và để tuỷ xương phục hồi Tuân văn thạc sĩ Dé Thi Thanh Trang trở lại bình thường. Điều trị hoá chất là phương thức diễu trị chính déi voi bénh ung thư bạch câu cấp. Thông thường, sự kết hợp giữa các thuốc hoá chất (các thuốc steroid) được sử đựng theo một kế hoạch điều trị (thường được gọi là một phác đỏ) Điều trị hóa chất được chúa làm nhiều giai đoạn: điều trị tấn công, diều trị dự phòng, thâm nhiễm hệ thân kinh trung trong, điều trị duy trì. Ngoài điều trị bằng hóa chất, bệnh nhân AMI, có thể được điều Irị leo một số phương pháp khác: ghép tuỷ xương, tia xạ khối tu.