ĐẠI HỌC QUOC GIA HA NOI TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN PHAM THI BiCH PHAN TICH BIEN DOI CUA GEN CXCL12 O BENH NHAN UNG THU DAI TRUC TRANG LUAN VAN THAC Si KHOA HOC Hà Nội - 2012 DAI HOC QUOC GIA HA NOI TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN Pham Thi Bich PHAN TICH BIEN DOI CUA GEN CXCL12 O BENH NHAN UNG THU DAI TRUC TRANG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 6042 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội - 2012 MUC LUC MÔ ĐẦU. Chuong 1 — TONG QUAN TAI LIBU. TÌM HIỂU VE UNG THU PAI TRUC TRANG.
Khải quát về ung thư. Ứng thư đại trực trang là gì. Các tác nhân gây ng thư đại trực Hằng, - 4 1. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực trăng, 6 1.
CHỈ THỊ SINH HOC TRONG UNG THU DAT TRUC TRANG. Chi thi sinh học là gì - - 8 1. Mệt số biến đối về gen liên quan đến ung thư đại trực trang 9 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU BIẾN ĐỐI GEN LIEN QUAN DEN I20)09)icáy: 0.
CHEMOKINE CYCI12 VA VAT TRO TRONG UNG THU BAI TRUC 1. Chemokine CXCL12 va thy thé otta nd CRCR4 oes eects 1. CAC NGHTEN CUU VE BA HINA VA METHYL HOA GEN CXCII2 6 BỆNH NHÂN UNG FHƯ ĐẠI TRỰC TRÁNG. 1 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP,.
HH H HH HH HH HH re 33 2.ccccsccceccre TH HH 220220111 cai 24 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU. Tách chiết ADN tổng số từ mô 2. Tách chiết ADN tổng số từ máu.
Khuếch đại gen CXC7.72 bằng phương pháp PCR 2. Phân tích RELP. Khuéch đại vùng promotor của gen CXCL72 bằng kỹ thuật MSP.6 Điện di kiém tra sẵn phẩm: 3. Kỹ thuật nhuộm bac 33 2.
Dự đoán vùng momoler và xác định phân bố dao CpG xung quanh vị trí khởi dâu phiên rã của gen ÝCƑ, 12. sàng ¬ Phân tich số liệu bằng phương pháp thông kẽ. CHUONG 3 - KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN. KET QUA PHAN TÍCH PCR - RELP.
Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu: 35 3. Kết quả khuếch đại doan gen CYCL. Kết quả phân lích RELP. Phân tích số hiệu bằng phương pháp thông kẻ.
KET QUA PHAN TICH TINH TRANG METHYL HOA GEN CXCLI2. Kêt quả tách chiết ADN từ mẫu mô. Kết quả xác định phân bổ đão CpŒ xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của BOD CXŒE,2. Khuyếch đại doạn trình tự nằm trong dão CpỠ thuộc vùng prorotcr của gen CXCLI2 bang kỹ thuật MSP.4, Phan tich tich tinh trang methyl héa vimg promoter cia gen CXCLI2Z ở bênh tnp thư đại trực tràng.
- - 62 KIÊN NGHỊ - - - - 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO. siceiereierreei PHÙ LỤC 3. Si neeereieeeeree PHU LUC 5. BANG KY HIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TAT ADN Acid Deoxyribo Nucleic AICC American Join Conunitice on Cancer APC Adenomatous polyposis coli Ammonium persulfate Careinoemlnyonic anligen (kháng nguyên ung thư) Chromosomal instability (sự bất ôn dịnh nhiễm sắc thẻ) CPG-CIMP CpG island methylator phenotype CRC Colorectal cancer (ung thu dai trye trang) vs Cộng sự CXCL12 CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12) CXCR4 CXC receptor 4 (thy thé dang CXC 4) DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography FAP Familial adcnomatous polyposis (hội chứng polyp utuyén theo dong họ) FOBT Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân) TUAC International Union Against Cancer HNPCC Hereditary nonpolyposis colon eaneer (ung thư ruột kết khéng polyp di truyén) TỐT Loss of imprinting (su mal.
dau an) MAPK Mitogen activated protein kinase MSI Microsatellite instability (su bat én định vi vệ tỉnh) MST Methyl specific polymerase chain reaction (phan img chuỗi tring hop dic higu methyl) NCBI National Center for Biotechnology Information PIXKCA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit PCR- RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism (Da hinh mucleotide don) SSCP Single strand conformation polymorphism Tris borate EDTA TH ‘Eris - EDTA TEMED Totramothylethylenediamine TGF B Transforming, srowth factor ñ (yếu tổ tăng trưởng chuyến. héa B) TNI ‘Tumor necrosis factor (Yéuté gay hoai bi khéi u) TNM Tumor- lymph node- metastases (khéi w-hach-di cin) VWEDTT Ung thu dai truc trang NST Nhiễm sắc thể DANH MUC CAC BANG Bang 1 Phan biét hai khai nigm u linh tinh va ung thu theo dic diém sinh hoc Bang 2 Cac chemokine thude ho CKC Bang 3 Các thành phần của phản img PCR Bang4 Các thành phân của phản ứng cắt sản phẩm PCR bang enzyme EasIDigest MspT Thanh phan phan ing PCR (véi thé tich 12,5 ui) Thanh phan bin gel polyacrykamide 10% (ban Jem) Phân bé genotype gitta mau bénh và mẫu đổi chứng theo vị trí khối u Bang8 Phan bé genotype theo gidi tinh của bệnh nhân Bang 9 8o sánh phân bó genotype giữa nhỏm người bệnh trên 70 tuổi và dưới T0 Luỗi Bang 10 Tần xuất alen của gen CXŒF.ï2 của mẫu đối chứng và mẫu hệnh theo vi trí khổi n Bang 11 'Lần xuất alen của gen CJXC/.12 của mẫu bệnh theo giới tỉnh Bang 12 Tần xuất alen của gen CXCT,12 của mẫu bệnh theo độ tuôi Bang 13 ‘Ty Id methyl hoa va không methyl hỏa vũng promoter của gen CXCLI2Z trên mô u và mô lân cậnứ Bang 14 Théng ké ty 1é methyl héa trong ving promoter ctia gen CXCL 12 thea các đặc điểm lâm sàng gủa bệnh nhân tmg thụ đại trực trắng DANH MỤC CÁC HÌNH Hinh 1 Tình ảnh đại trực tràng và polyp dại tràng nội sơi THỉnh 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng Tình 3 Tỉnh ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu. Hình 4 Hình ảnh điện di sán phẩm PCR của gen CXCL12 Hinh 5 Hinh anh dién di san phdm cat ADN bang enzyme Mspl voi 3 bang 302bp, 202bp va LOObp Hình 6 Hình ảnh diện di sắn phẩm cắt ADN bang enzyme Afspl voi 2 băng 202bp và 1009p Hình 7 Hinh anh điệu di sản phẩm cốt ADN bằng cn4vrne ÄZp] với 3 băng 302bp, 202bp va 100bp (genotype di hop tử) THỉnh § Tlinh ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme Afspl vai | bang 302bp Tình 9 Fink anh điện di ADN tổng số tách từ môi Hình 10 kết quả khão sát đảo CpG sử dung phan mém MethPrimer Tình 11 Kết quả khảo sát đảo CpŒ sử địng phan mém cpgplot Hình 12 Hình ảnh diện đi sản pham PCR cia gen CXCLI2 THỉnh 13 Tỷ lệ methyl và nmethy1 khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u Hình 14 Hình ảnh điện di san phẩm MMSP của gen XCT.12 dủa bệnh nhân ¡mg hư dai truc trang Luéin vén cao hoe Pham Thj Bich — K18 Sinh học MỞ ĐÀU TÍng thư trực tràng là bệnh ly hay gp trong ung thư đường Liên hóa, đứng hàng thứ bai sau ung thu da đây và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến triển tương đổi chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điêu trị kịp thời và triệt để tủ tý lệ sống trên S năm đại 60-80% [26] Tuy nhiên bệnh thường được phái hiện ở giai doạn muộn khi đã di căn hay biển chứng, do đỏ hiệu quả diều trị rất hạn chế Hàng năm, trên thể giới có khoảng 650.000 người được chân doán mắc bệnh ung thu dai trục tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai aây ra tử vong tại Mỹ.
Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoáng 15% trong số các loại cng thu và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gản đây, đo sự thay đối trong thói quen ăn. uống giàu chất đạm, íL chất xơ, bạn dụng thức an nhanh khiến ung thư đại tric trang ngày cảng phổ biển. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đá mắc tng thư đại trực tràng J30J Tiên thể giới ưng thư đại trực trắng luôn được các nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiền cửu genomies, transcriptomics, proteomies đã dược tiền hành.
Mục tiêu của những nghiên cứu nảy nhằm tim ra những chỉ thị sinh học cho việc chân đoán bệnh sớm hơn dé điểu trị kịp thời Tuy nhiên, dén nay, mới chỉ có careinoembryonic antdgen (CEHA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn II, IV, nhưng chỉ phí cho xét nghiệm con xát.Vì vậy, việc tìm ra những chỉ Ứu mới để nhận biết và có thẻ phát hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh vực nghiên cửu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công tác chân đoán, điều trị và lim nguyên nhân bệnh. Vi vậy, chúng lôi tiến hành dễ lài nghiên cửu: “Phân tích biễn đổi của gen CXCL12 ử bệnh nhân ung thư đại trực trảng”, nhằm mục tiêu: Luéin vén cao hoe Pham Thj Bich — K18 Sinh học 1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 8 bệnh nhân ung thư dui trực trang: ~ Xá định được tính da hình cửa gen CYCP,J2 ð bệnh nhân ng thư đại trực trảng, so sánh với các mẫu đối chứng, - Dánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXC1,j2 với cáo đặc điểm lâm sảng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam, 3 Phân tích tình trạng methyl hóa promoter cha gen CXCL12 & bénh nhân tụng thuc đại trực trang: - Xác dịnh dược sự phân bó của đảo CpG va mat d6 nucleotide CpG trong cae dio CpG thuge ving promoter cia gen CXCL12.
- Xão định được tỉnh trang methy] héa ctia | dao CpG thaée ving promoter cba gen CXCL 12 - Đánh giá mỗi liên quan giữa tình trang methyl héa gen CXCL12 vai cdc dae điểm hénh hoc Tarn sing ofia ung thu dai rực tràng ở người Việt Nam: Bể tai dược thực hiện tại phòng thí nghiêm Proteomics va Sinh hoe cdu trie thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Hnzyme và Protein, Trường Đại họ Khoa học Tự nhiên, Dại học Quốc gia Hà Nội. Luéin vén cao hoe Pham Thj Bich — K18 Sinh học Chuong 1— TONG QU TAI LIEU 1. TIM HIEU VE UNG THU DAI TRUC TRANG LLL. Khai quát về ung thư Ung, thu (u ác tỉnh} là một loại bệnh của các tế bảo, biểu hiện là sự phát triển.
không bình thường của các tế bảo, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách không kiểm soát được vá tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và. phát điển của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chủng di căn (lan trản tới các cơ quan ở xa) (bang 1). Phan biét hai khái niệm u lành tính và ung thư heo dặc diễm sinh bệnh bọc U lành tính U ác tỉnh (ung thu) 4 ~ Tê bào ít biệt hóa.
- Tê bảo biệt hóa cao. oe - Phan bao nhanh, không tuân theo sự kiểm - Phân bảo it và châm oe kas. soát của chu trình tẾ bảo - Không xâm lắn xung quanh.