CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và tính chất gelatin Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996). Theo Karim và cộng sự (2009) gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật.
Với trọng lượng khô cơ bản, gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein. Trọng lượng phân tử của gelatin lớn, dao động từ 20. Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain) có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự, 2011). Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới.
Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên kết peptit. Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe, 1997). Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%; Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe, 1997). Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%; Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12% (Hudson, 1994, Poppe, 1997).
Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998). Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng. Gelatin có nguồn gốc từ da cá Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%), thịt lợn và xương gia súc (23,1%). Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày càng gia tăng.
Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn, bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 ). Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá. Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995). Khoảng 30% chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002).
Việc chiết xuất gelatin từ da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson, 1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén., 2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder. Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000). Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị (Badii và Howell, 2006). Da cá chứa một lượng lớn collagen.
Nagai và Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối lượng khô). Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao. Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990). Năm 1992, quy trình sản 7 xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và Bergman (1992).
Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển. Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô. Tùy thuộc vào phương pháp mà collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất. Chất gelatin loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987).
Xử lý axít là thích hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò. Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau. Thông thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công đoạn tạo gelatin. Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45 oC) và xử lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ.
Theo Yang và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit acetic (1: 6 w/v). Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6 w/v), bước này lặp lại ba lần. Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C. Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu cùng đưa ra.
Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50- mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15 oC trong 18 giờ. Da được tiếp tục xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0. Quá trình tách chiết 8 có sự tham gia của pepsin. Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008).
Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ. Và nhóm nghiên cứu này cũng công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở 110ºC trong 16 giờ. Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion và được lọc. Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC).
Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn (Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013) Axit amin Số dư lượng/1000 Alanine 86 Arginine 78 Aspartic acid 50 Cystine 0 Glutamic acid 85 Glycine 250 Histidine 11 Hydroxyproline 58 Isoleucine 13 Leucine 22 Lysine 33 Methionine 92 Phenylalanine 16 9 Proline 115 Serine 38 Threonine 25 Tryrosine 6 Valine 22 Total 1000 Hydroxyproline + Proline 173 (Imino axit Thành phần axit amin trong gelatin của da cá da trơn (Bảng 1.1) cho thấy chủ yếu là glycine, chiếm 250 dư lượng /1000 dư lượng, sau đó là proline (115 dư lượng/1000), methionine (92 dư lượng/100), alanine (86 dư lượng/1000). Và axit imino (hydroxyprolinevà proline) của gelatin da cá da trơn chiếm 173 dư lượng trên 1000 dư lượng. Theo Kim và cộng sự (2000), khi thủy phân protein cá với các enzym thích hợp như alcalase, pronase, collagenase, pepsin, papain, protamex, bromelain, chymotrypsin và trypsin thu được các peptit hoạt tính sinh học và các axít amin.
Ưu điểm chính của enzym thủy phân protein là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và các thành phần có số lượng ít, thường bị phá hủy khi thủy phân protein bằng axít và kiềm. Theo Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) protein cá da trơn sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các axit amin khi được trộn với với nước cất theo tỉ lệ 1: 1,5 (w / v) và bổ sung enzym protex 0,5; 1,5 hoặc 3% v/w trong thời gian 60, 120 và 180 phút. Năm 2011, Alemán và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chống oxy hóa. Gelatin 2,5% được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate (0,01 M; pH 8) và bổ sung alcalase vào với tỷ lệ enzym/cơ chất gelatin là 1:20 và thủy phân ở 50 oC trong 3 giờ.
Gelatin từ mực và cá ngừ được thủy phân bằng enzym trypsin ở 37oC và trong dung dịch nước pH 7,5 và pepsin ở 37 oC và trong dung dịch 10 nước pH 4. Sau khi thủy phân các enzym bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 90oC trong 10 phút. Quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi nồng độ cơ chất là 200 g/L, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ thuỷ phân là 50oC, tại pH 7,0 và thuỷ phân trong thời gian là 3 giờ. Mức độ thuỷ phân tại điều kiện trên đạt 11,02%.
Khi thuỷ phân collagen bằng neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, cường độ sóng siêu âm 150W/ 20ml mẫu, cho hiệu suất thủy phân là 14,92%. Sản phẩm thuỷ phân bằng enzym kết hợp sóng siêu âm có phân tử lượng thấp hơn so với khi thuỷ phân bằng enzym. Hiệu suất thủy phân neutrase thu được có phân đoạn 19 ÷ 31 kDa, còn khi kết hợp neutrase và sóng siêu âm thì thu được phân đoạn 8,5 ÷12 kDa và 12 – 18kDa. Theo nghiên cứu của Karim và Bhat (2009), Go´mez-Guille´n và cộng sự (2002); Zhou và cộng sự (2006); Sarabia và cộng sự (2000); Eastoe và Leach (1977) đã công bố thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn cho kết quả ở bảng 1.2 cho thấy các loại axít amin chính và hàm lượng của chúng ở da cá tương đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn.