Nghiên cứu lựa chọn dòng đậu nành chứa hàm lượng sucrose cao từ quần thể đột biến qua xử lý EMS

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu selection high sucrose soybean lines from a mutation polulation derive fron ems treatment, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Duong Thi Bich Huong
• Người hướng dẫn: Prof. Lee Jeong-Dong
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Selection high sucrose soybean lines from a mutation population derive from EMS treatment
• Loại tài liệu: Bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNLOWLEDGMENTS
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• LIST OF ABBREVIATION
• 1. MARERIAL AND METHODS
• 1.1. Material and equipment
• 1.2. Equipment and chemical
• 1.3. Sucrose quantification by the GOPOD/invertase method (enzymatic method)
• 2. RESULTS AND DISCUSSION
• 2.1. The soybean seeds treated by EMS
• 2.2. Determination carbohydrates extraction
• 2.3. Preliminary evaluation of the sugar content
• 2.4. Selection of high sucrose content lines

Tóm tắt

I. Giới thiệu về đậu nành

Đậu nành (Glycine max) là một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới. Đậu nành chứa khoảng 35% carbohydrate, trong đó hàm lượng sucrose chiếm khoảng 2.2%. Sucrose là thành phần chính tạo nên vị ngọt cho các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành. Việc tăng cường hàm lượng sucrose trong hạt đậu nành không chỉ cải thiện chất lượng sản phẩm mà còn mở rộng khả năng tiêu thụ của các sản phẩm từ đậu nành. Do đó, nghiên cứu về việc chọn lọc các dòng đậu nành có hàm lượng sucrose cao là rất cần thiết cho ngành nông nghiệp và thực phẩm.

1.1. Vai trò của sucrose trong thực phẩm

Sucrose không chỉ cung cấp năng lượng mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu sắc, hương vị và kết cấu cho thực phẩm. Sucrose được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, từ sản xuất đồ uống đến chế biến thực phẩm. Việc cải thiện hàm lượng sucrose trong đậu nành sẽ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng và khả năng tiêu thụ của các sản phẩm từ đậu nành.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp đột biến bằng EMS (Ethyl Methane Sulphonate) để tạo ra quần thể đột biến của đậu nành. Phương pháp này cho phép tạo ra các biến thể gen mới, từ đó có thể chọn lọc các dòng đậu nành có hàm lượng sucrose cao. Quá trình này bao gồm việc xử lý hạt giống đậu nành bằng EMS, sau đó tiến hành phân tích hàm lượng sucrose bằng bộ kit Megazyme. Qua đó, 710 dòng đột biến đã được chọn từ tổng số 3777 dòng, trong đó có 31 dòng có hàm lượng sucrose cao hơn dòng đối chứng Pungsanamul.

2.1. Quy trình chọn lọc dòng đậu nành

Quy trình chọn lọc bao gồm nhiều bước, từ việc xử lý hạt giống đến phân tích hàm lượng sucrose. Sau khi xử lý bằng EMS, các dòng đột biến được trồng và thu hoạch. Hàm lượng sucrose trong các dòng này được xác định bằng phương pháp GOPOD/invertase. Kết quả cho thấy 31 dòng đậu nành có hàm lượng sucrose cao hơn đáng kể so với dòng đối chứng, cho thấy hiệu quả của phương pháp chọn lọc này.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng đậu nành PE 1472 có hàm lượng sucrose cao nhất, đạt 21.818 g/100g, trong khi dòng đối chứng Pungsanamul chỉ đạt khoảng 16 g/100g. Những dòng đậu nành này không chỉ có tiềm năng trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm mà còn có thể được sử dụng trong các chương trình giống cây trồng quy mô lớn. Việc chọn lọc các dòng đậu nành có hàm lượng sucrose cao sẽ góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng trong tương lai.

3.1. Ứng dụng thực tiễn

Các dòng đậu nành được chọn lọc có hàm lượng sucrose cao sẽ có giá trị lớn trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành. Điều này không chỉ giúp tăng cường giá trị dinh dưỡng mà còn mở rộng thị trường tiêu thụ cho các sản phẩm từ đậu nành. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần vào việc phát triển các giống đậu nành mới, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đậu nành (Glycine max (L.) Merr.) là một trong những cây trồng nông nghiệp quan trọng nhất trên thế giới, cung cấp nguồn dinh dưỡng dồi dào với khoảng 40% protein, 20% dầu và xấp xỉ 33–35% carbohydrate. Trong thành phần carbohydrate hòa tan của hạt đậu nành, sucrose chiếm tỷ lệ chủ yếu (khoảng 2,2% đến hơn 10% tùy giống), trong khi raffinose (0,1–0,9%) và stachyose (1,1–4,1%) là các oligosaccharide khó tiêu hóa đối với người và động vật dạ dày đơn, là nguyên nhân gây đầy hơi và tiêu chảy. Ngược lại, đường sucrose là thành phần tạo vị ngọt tự nhiên, dễ tiêu hóa, đóng vai trò quyết định đến hương vị, cấu trúc và khả năng tiếp nhận cảm quan của người tiêu dùng đối với các sản phẩm thực phẩm chế biến từ đậu nành như sữa đậu nành, đậu phụ, natto và bánh kẹo.

Trước sự gia tăng liên tục của nhu cầu tiêu thụ đậu nành và đường sucrose trên thị trường toàn cầu, các chương trình chọn giống cây trồng hiện đại tập trung mạnh vào mục tiêu nâng cao hàm lượng sucrose tự nhiên trong hạt đậu nành. Phương pháp gây đột biến thực nghiệm bằng hóa chất (Chemical mutagenesis) là công cụ hữu hiệu để nghiên cứu chức năng gen và tạo ra các nguồn vật liệu di truyền mới có các đặc tính ưu việt mà không bị coi là sinh vật biến đổi gen (non-GMO).

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

1. Xây dựng và chuẩn hóa quy trình chiết xuất carbohydrate và định lượng đường sucrose bằng phương pháp enzyme GOPOD/invertase nhanh, chi phí thấp trên quy mô lớn.
2. Sàng lọc sơ bộ hàm lượng đường sucrose trong hạt của 710 dòng đột biến từ quần thể 3.774 dòng đậu nành M2 được tạo ra bằng xử lý hóa chất Ethyl Methane Sulfonate (EMS).
3. Đánh giá chi tiết, phân tích lặp lại và lựa chọn các dòng đột biến mang hàm lượng sucrose vượt trội so với giống đối chứng ban đầu để cung cấp nguồn gen cho công tác chọn tạo giống đậu nành chuyên dụng.

• Đối tượng nghiên cứu: Quần thể đột biến đậu nành thế hệ M2 gồm 3.774 dòng được phát triển từ giống đậu nành Pungsanamul (thế hệ M1 được xử lý hóa chất EMS nồng độ 0,3% vào năm 2010 tại Hàn Quốc) và giống đối chứng Pungsanamul.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trong thời gian 5 tháng tại Phòng thí nghiệm của Giáo sư Lee Jeong-Dong (Đại học Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc) phối hợp với Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; dữ liệu và khóa luận được hoàn thành vào tháng 08/2016. Quy mô khảo sát gồm 710 dòng M2 ở bước sơ bộ và 31 dòng đột biến triển vọng ở bước đánh giá lặp lại.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

• Cơ chế gây đột biến hóa học của Ethyl Methane Sulfonate (EMS): EMS ($C_3H_8SO_3$) là tác nhân alkyl hóa mạnh, tác động lên vật liệu di truyền thông qua phản ứng alkyl hóa guanine tạo thành $O^6\text{-ethylguanine}$. Trong quá trình nhân đôi DNA, enzyme DNA polymerase thường bắt cặp thymine thay vì cytosine đối diện với $O^6\text{-ethylguanine}$, dẫn đến các đột biến thay thế nucleotide (đột biến điểm). EMS có khả năng tạo tần số đột biến cao ($5 \times 10^{-2}$ trên mỗi gen) mà không làm suy giảm nghiêm trọng sức sống của thực vật, tạo ra biến dị di truyền ổn định.
• Cấu trúc và vai trò sinh học, công nghệ của Sucrose: Sucrose là một disaccharide ($\alpha\text{-D-glucopyranosyl-(1}\rightarrow\text{2)-}\beta\text{-D-fructofuranoside}$) liên kết bởi cầu nối oxy giữa C1 của glucose và C2 của fructose. Trong cơ thể, sucrose cung cấp năng lượng ($4\ \text{kcal/g}$), là nguồn cung cấp glucose cho hệ thần kinh trung ương và cơ bắp, dự trữ dưới dạng glycogen và tham gia tổng hợp các đại phân tử (RNA, DNA, ATP). Trong công nghệ thực phẩm, sucrose đóng vai trò tạo vị ngọt chuẩn, cải thiện màu sắc (phản ứng caramel hóa, phản ứng Maillard), điều chỉnh cấu trúc và áp suất thẩm thấu giúp bảo quản sản phẩm.
• Tổng quan các phương pháp phân tích đường hòa tan: Các phương pháp truyền thống như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao kết hợp đầu dò đo dòng xung (HPAEC-PAD) hoặc quang phổ cận hồng ngoại (NIRS) đều có những ưu điểm nhất định nhưng thường đòi hỏi thiết bị đắt tiền, quy trình vận hành phức tạp, tốn thời gian hoặc khó phân tách chính xác các loại đường đơn và đường đôi phân tử lượng thấp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Quy trình trích ly carbohydrate hòa tan:

  • Lấy mẫu đại diện từ 10–15 hạt đậu nành ngẫu nhiên của mỗi dòng, nghiền thành bột mịn bằng máy nghiền Shinil (SFM-555SP) và rây qua lưới chuẩn kích thước $300\ \mu\text{m}$.
  • Cân chính xác $0,0125\ \text{g}$ bột hạt đậu nành cho vào ống Eppendorf $2\ \text{mL}$, thêm $1\ \text{mL}$ dung dịch chiết ethanol 50% (tỷ lệ ethanol : nước cất là 50:50 v/v).
  • Lắc đều bằng máy vortex, ủ nhiệt trong tủ sấy ở $70^\circ\text{C}$ trong 30 phút (lắc đảo mẫu mỗi 10 phút một lần).
  • Ly tâm hỗn dịch ở tốc độ $15.000\ \text{vòng/phút}$ trong 10 phút để thu lấy $700\ \mu\text{L}$ dịch nổi trong suốt chuyển sang khối giếng sâu (96 deep well block).

• Định lượng sucrose bằng phương pháp enzyme (Megazyme GOPOD/Invertase):

  • Thủy phân enzyme (Invertase): Chuyển $10\ \mu\text{L}$ dịch chiết đã pha loãng vào đĩa PCR 96 giếng chứa $10\ \mu\text{L}$ dung dịch enzyme $\beta\text{-fructosidase}$ (invertase), đậy kín và ủ ở $50^\circ\text{C}$ trong 20 phút để chuyển hóa toàn bộ sucrose thành D-glucose và D-fructose tự do ở $\text{pH } 4,6$.
  • Phản ứng tạo màu (GOPOD): Bổ sung $150\ \mu\text{L}$ thuốc thử GOPOD (hỗn hợp gồm Glucose oxidase, Peroxidase, 4-aminoantipyrine và $p\text{-hydroxybenzoic acid}$ ở $\text{pH } 7,4$). Ủ ở $50^\circ\text{C}$ trong 20 phút. Glucose oxidase oxy hóa D-glucose tạo ra $H_2O_2$, sau đó peroxidase xúc tác phản ứng giữa $H_2O_2$ với các hợp chất chỉ thị tạo phức màu đỏ quinoneimine dye.
  • Đo quang phổ: Chuyển $125\ \mu\text{L}$ dung dịch phản ứng sang đĩa đo quang chuyên dụng, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng $510\ \text{nm}$ bằng máy quang phổ microplate.

• Xây dựng đường chuẩn và công thức tính toán:

  • Dung dịch chuẩn D-glucose được thiết lập ở các dải nồng độ: $0;\ 62,5;\ 125;\ 187,5;\ 250\ \mu\text{g/mL}$ (tương ứng với $0%,\ 25%,\ 50%,\ 75%,\ 100%$) để dựng phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính ($y = ax + b$, với hệ số xác định $R^2 \approx 0,9889$).
  • Hàm lượng sucrose trong mẫu được tính toán theo công thức: $$\text{Hàm lượng sucrose (g/100g)} = \frac{\mu\text{g D-glucose đo được}}{\text{mg mẫu bột}} \times \frac{342}{180} \times \frac{1}{10}$$ Trong đó: tỷ số $342/180$ là hệ số chuyển đổi phân tử lượng từ D-glucose ($180\ \text{g/mol}$) sang sucrose ($342\ \text{g/mol}$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chapter I: Overview (Tổng quan tài liệu)

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận và thực tiễn về cây đậu nành, hóa sinh học đường sucrose và kỹ thuật đột biến thực nghiệm:

• Phân loại học, đặc điểm hình thái và sinh lý của cây đậu nành (Glycine max, $2n = 40$), thành phần hóa học hạt (protein, lipid, carbohydrate).
• Số liệu thống kê về sản lượng và thương mại đậu nành thế giới (Hoa Kỳ, Brazil, Argentina) và biến động tiêu thụ đường toàn cầu.
• Tác động sinh lý của sucrose đối với sức khỏe con người và chức năng công nghệ của đường trong chế biến các nhóm thực phẩm (bánh mì, bánh ngọt, đồ uống, sữa đông tụ, thịt chế biến, thực phẩm đông lạnh).
• Cơ chế tác động phân tử của hóa chất EMS gây alkyl hóa guanine, hình thành các đột biến điểm mà không làm biến dạng cấu trúc hình thái ngoài của cây.
• Đánh giá ưu nhược điểm của các kỹ thuật phân tích carbohydrate hòa tan (HPLC, GC, TLC, HPAEC-PAD, NIRS và Enzymatic assay).

Chapter II: Materials and Methods (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu sinh học, hóa chất, trang thiết bị và quy trình thao tác thực nghiệm:

• Nguồn gốc vật liệu: 3.774 dòng đậu nành M2 thu từ quần thể xử lý EMS 0,3% trên giống gốc Pungsanamul tại cánh đồng thực nghiệm Đại học Quốc gia Kyungpook (Gunwi, Hàn Quốc, $36^\circ 07'\text{N},\ 128^\circ 38'\text{E}$) năm 2010, bảo quản hạt ở $4^\circ\text{C}$.
• Danh mục thiết bị: Máy quang phổ đo đĩa microplate bước sóng $510\ \text{nm}$, tủ sấy ủ nhiệt $50\text{--}70^\circ\text{C}$, máy nghiền Shinil SFM-555SP, rây tiêu chuẩn $300\ \mu\text{m}$, đĩa PCR 96 giếng và khối giếng sâu 96 vị trí.
• Chi tiết các bước chuẩn bị hóa chất, trích ly bằng cồn $50%$ và các phản ứng thủy phân - oxy hóa enzyme từ kit Megazyme Sucrose/D-Glucose.
• Phương pháp lập đường chuẩn D-glucose và công thức toán học xác định nồng độ sucrose theo tỷ lệ khối lượng phân tử.

Chapter III: Results and Discussion (Kết quả và thảo luận)

Tập trung phân tích các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình sàng lọc và đánh giá di truyền:

• Đặc điểm hạt đậu nành xử lý EMS: Hạt thế hệ đột biến không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái bên ngoài so với giống gốc Pungsanamul do EMS chỉ gây các đột biến điểm mức độ phân tử.
• Hiệu quả trích ly: Phương pháp chiết xuất bằng ethanol $50%$ ở $70^\circ\text{C}$ trong 30 phút kết hợp ly tâm tốc độ cao $15.000\ \text{vòng/phút}$ cho dịch chiết trong, độ hòa tan đường triệt để.
• Kết quả sàng lọc sơ bộ 710 dòng đột biến M2:
  • $390$ dòng đột biến đạt hàm lượng sucrose cao hơn giống gốc Pungsanamul (chiếm tỷ lệ $55%$).
  • $320$ dòng đột biến có hàm lượng sucrose thấp hơn giống gốc (chiếm tỷ lệ $45%$).
  • Tỷ lệ các dòng đột biến tăng hàm lượng đường cao hơn nhóm dòng giảm đường là $10%$.
• Kết quả chọn lọc và đánh giá lặp lại 31 dòng triển vọng: Đã chọn lọc 31 dòng có hàm lượng sucrose cao nhất và tiến hành đo lặp lại 2 lần (2 replications) để đảm bảo độ tin cậy.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chi tiết trên 31 dòng đột biến chọn lọc

Toàn bộ 31 dòng đột biến được kiểm tra lại đều thể hiện hàm lượng đường sucrose cao hơn rõ rệt so với giống đối chứng Pungsanamul. Hàm lượng sucrose trung bình của toàn bộ 31 dòng đạt $18,794\ \text{g/100g}$, trong khi giống đối chứng Pungsanamul dao động trong khoảng $16,122\text{--}16,934\ \text{g/100g}$.

Nhóm phân loại theo hàm lượng sucrose	Tỷ lệ (%) trong 31 dòng	Số lượng dòng	Các dòng đột biến tiêu biểu	Hàm lượng sucrose trung bình (g/100g)
Nhóm cao nhất (Đột biến đỉnh)	$3,2%$	1 dòng	PE 1472	21,216 (đỉnh ghi nhận tới 21,818)
Nhóm rất cao ($\sim 20\ \text{g/100g}$)	$16,1%$	5 dòng	PE 919, PE 1256, PE 1356, PE 1457, PE 1856	20,130
Nhóm cao ($\sim 19\text{--}19,5\ \text{g/100g}$)	$19,4%$	6 dòng	PE 256, PE 85, PE 951, PE 1248, PE 1386, PE 1453	19,532
Nhóm trung bình khá ($\sim 17\text{--}18\ \text{g/100g}$)	$22,6%$	7 dòng	PE 238, PE 258, PE 793, PE 803, PE 813, PE 1300, PE 1304	17,804
Các dòng triển vọng khác	$38,7%$	12 dòng	PE 236, PE 785, PE 814, PE 839, PE 851, PE 852, PE 862, PE 1244, PE 1301, PE 1372, PE 1696, PE 2194	Dao động từ 16,5 đến 18,9
Dòng thấp nhất trong nhóm chọn	-	1 dòng	PE 831	16,0818
Giống gốc đối chứng (Pungsanamul)	-	-	Control line	16,122 – 16,934

Đóng góp mới so với các nghiên cứu trước đây

• Khóa luận đã sàng lọc thành công dòng đột biến PE 1472 đạt hàm lượng sucrose vượt trội ($21,216\ \text{g/100g}$). Đây là giá trị cao hơn đáng kể so với các nguồn gen đậu nành tự nhiên hoặc dòng đột biến từng được công bố trong các y văn quốc tế:
  • Cao hơn mức biến thiên hàm lượng sucrose $3,0\text{--}10,2\ \text{g/100g}$ trong các kiểu gen đậu nành được báo cáo bởi Hymowitz và cộng sự (1972).
  • Cao hơn dòng mang hàm lượng sucrose cao nổi tiếng PI 243545 ($10,55\ \text{g/100g}$) được công bố bởi Hou và cộng sự.
  • Cao hơn giống TADACHA ($11,57\ \text{g/100g}$) được phân tích theo phương pháp Stiff (Arlindo và cộng sự, 2012).
• Khẳng định tính hiệu quả, độ nhạy cao và khả năng ứng dụng thực tiễn của quy trình phân tích enzyme GOPOD/Invertase kết hợp đo quang đĩa 96 giếng để sàng lọc kiểu hình carbohydrate nhanh trên quần thể chọn giống quy mô lớn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở bước sàng lọc kiểu hình (phenotyping) hàm lượng đường trên 710 dòng M2, chưa đánh giá toàn bộ 3.774 dòng trong quần thể đột biến đã thu thập.
  • Phép đo quang phổ trên đĩa microplate có độ nhạy rất cao, do đó những sai số nhỏ trong thao tác hút vi thể tích dung dịch có thể tạo ra sự chênh lệch số liệu giữa các lần lặp lại.

• Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

  • Tiếp tục phát triển và ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định các locus tính trạng số lượng (Quantitative Trait Loci - QTL) kiểm soát hàm lượng sucrose trên các dòng đột biến ưu tú đã chọn lọc.
  • Phân tích chức năng gen và cơ chế điều hòa sinh tổng hợp carbohydrate hạt ở mức độ phân tử.
  • Đưa 31 dòng đột biến mang hàm lượng sucrose cao vào các chương trình lai tạo thực tế nhằm phát triển các giống đậu nành thương mại phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận là nguồn tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Di truyền và Chọn giống cây trồng: Tham khảo phương pháp thiết kế và xử lý đột biến thực nghiệm bằng EMS, cách quản lý và sàng lọc quần thể M2.
• Các nhà nghiên cứu công nghệ thực phẩm và hóa sinh thực vật: Tham khảo quy trình chuẩn bị mẫu, trích ly cồn $50%$ và quy trình định lượng đồng thời glucose/sucrose bằng phản ứng enzyme GOPOD/Invertase trên đĩa vi thể tích 96 giếng với chi phí thấp và độ chính xác cao.
• Các chương trình chọn tạo giống đậu nành: Cung cấp dữ liệu cụ thể về các dòng đột biến PE (đặc biệt là PE 1472, PE 919, PE 1256, PE 1356, PE 1457, PE 1856) phục vụ việc khai thác nguồn gen cải thiện chất lượng carbohydrate.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hóa chất gây đột biến được sử dụng trong nghiên cứu là chất gì và nồng độ bao nhiêu?

Nghiên cứu sử dụng hóa chất Ethyl Methane Sulfonate (EMS) ở nồng độ $0,3%$ để xử lý hạt giống đậu nành Pungsanamul (thế hệ M1) vào năm 2010 nhằm tạo ra quần thể đột biến M2 gồm 3.774 dòng.

2. Quy trình trích ly đường hòa tan từ hạt đậu nành được tiến hành như thế nào?

Mẫu hạt được nghiền mịn và rây qua rây chuẩn $300\ \mu\text{m}$. Cân $0,0125\ \text{g}$ bột mẫu, bổ sung $1\ \text{mL}$ cồn $50%$ (Ethanol : Nước cất tỷ lệ 50:50 v/v), lắc đều, ủ nhiệt ở $70^\circ\text{C}$ trong 30 phút (lắc đảo mẫu mỗi 10 phút) và ly tâm ở tốc độ $15.000\ \text{vòng/phút}$ trong 10 phút để thu lấy $700\ \mu\text{L}$ dịch chiết nổi trong suốt.

3. Nguyên lý định lượng sucrose bằng phương pháp GOPOD/Invertase là gì?

Ở $\text{pH } 4,6$, sucrose bị enzyme $\beta\text{-fructosidase}$ (invertase) thủy phân thành D-glucose và D-fructose. Sau đó, D-glucose được enzyme Glucose oxidase oxy hóa thành D-gluconate và $H_2O_2$ ở $\text{pH } 7,4$. Enzyme peroxidase tiếp tục xúc tác phản ứng giữa $H_2O_2$ với $p\text{-hydroxybenzoic acid}$ và 4-aminoantipyrine để tạo phức màu đỏ quinoneimine dye. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ glucose và được đo quang phổ ở bước sóng $510\ \text{nm}$.

4. Kết quả sàng lọc sơ bộ trên 710 dòng M2 cho thấy tỷ lệ dòng có sucrose cao hơn giống gốc là bao nhiêu?

Trong 710 dòng M2 được đánh giá sơ bộ, có 390 dòng đạt hàm lượng sucrose cao hơn giống gốc Pungsanamul (chiếm $55%$) và 320 dòng có hàm lượng sucrose thấp hơn giống gốc (chiếm $45%$). Tỷ lệ các dòng đột biến làm tăng hàm lượng sucrose cao hơn nhóm làm giảm sucrose là $10%$.

5. Dòng đột biến nào đạt hàm lượng sucrose cao nhất và giá trị ghi nhận là bao nhiêu?

Dòng đột biến đạt hàm lượng sucrose cao nhất trong nghiên cứu là PE 1472, với hàm lượng trung bình qua hai lần đo lặp lại đạt $21,216\ \text{g/100g}$ (trong phân tích sơ bộ ghi nhận đạt $21,818\ \text{g/100g}$), cao hơn vượt bậc so với giống đối chứng Pungsanamul ($16,122\text{--}16,934\ \text{g/100g}$) và các nguồn gen tự nhiên đã công bố trước đây.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Dương Thị Bích Hướng đã xây dựng và ứng dụng thành công quy trình định lượng sucrose bằng phương pháp enzyme GOPOD/Invertase trên đĩa microplate để sàng lọc 710 dòng đậu nành M2 đột biến tạo bởi EMS. Nghiên cứu đã chọn lọc được 31 dòng đậu nành có hàm lượng sucrose vượt trội so với giống gốc Pungsanamul, trong đó dòng PE 1472 đạt hàm lượng cao nhất ($21,216\ \text{g/100g}$). Các dòng đột biến ưu tú này là nguồn vật liệu di truyền non-GMO có giá trị cao phục vụ công tác xác định QTL, phân tích chức năng gen và chọn tạo các giống đậu nành chuyên dụng cho công nghiệp thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY DUONG THI BICH HUONG SELECTION HIGH SUCROSE SOYBEAN LINES FROM A MUTATION POPULATION DERIVE FROM EMS TREATMENT BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty : Biotechnology and Food Technology Batch : 2012 – 2016 Thai Nguyen, 2016/08/20 n THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY DUONG THI BICH HUONG SELECTION HIGH SUCROSE SOYBEAN LINES FROM A MUTATION POPULATION DERIVE FROM EMS TREATMENT BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty : Biotechnology and Food Technology Batch : 2012 – 2016 Supervisors : Prof. Lee Jeong-Dong ______________ Ph.D Duong Van Cuong _____________ Ph.D Pham Bang Phuong ____________ Thai Nguyen, 2016/08/20 n Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Major Biotechnology Student name Duong Thi Bich Huong Student ID DTN1253150047 Thesis Title Selection high sucrose soybean lines from a mutation population derive from EMS treatment. Lee Jeong Dr. Duong Van Cuong Dr.

Pham Bang Phuong Abstract: Soybean is one of the most important crops. Soybean seeds contain about 35% carbohydrate. Sucrose content of soybean carbohydrate range from 2.2%, raffinose ranges from 0. Sucrose content in soybean seeds is desired to be high because it is a sweetness-imparting component, it helps extends acceptance for soy- derived food products.

To improve of quality carbohydrate, the breeding programs primary focused on increasinge sucrose content. Mutagenesis is used to study gene function and obtain new genetic resources for plant breeding to find a new genetic resources. We developed EMS –mediated mutant population to select high sucrose concentration lines by megazyme kit to analyze sucrose content. Selection of 710 out of 3777 mutant lines derived from a mutation population which was treated EMS 0.

Finishing the preliminary analysis, as a results we obtained 390 lines with sucrose content of larger than that of Pungsanamul. The remaining 320 lines were lower. Selected 31 soybean lines have larger than that sucrose content Pungsanamul were selected and reanalyzed. Sucrose concentration of all 31 those lines were larger than that Pungsanamul sucrose content.

PE 1472 was confirmed as a unique germplasm with the highest sucrose content (21.818 g/100g) were confirmed with extremely low concentrations. Pungsanamul was identified around 16. The identified germplasm with high sucrose profiles will be valuable in breeding specialty soybeans for improved sugar content. The selection of 31 mutant lines with high sucrose profiles will facilitate in a large-scale soybean breeding program.

Keywords High sucrose, EMS, soybean mutaion Number of pages 63 Date of Submission 2016/08/20 i n ACKNLOWLEDGMENTS The firstly, I would like to express the gratitude and profound thanks to special person who always admire and respect. That is my wonderful supervision Professor, Jeong-Dong Lee. You was so kind, love the students, caring, sharing, listening, and always willing to do what's best for students. Thank you for having the faith in myself and giving me a gold opportunity to internship during the duration Exchange student’s program in your lab.

Here I have had many great experiences and learned a lot of experience from the learning environment and the social environment. In deep my heart, you are a greatest teacher. The secondly, I would also like to give acknowledgements to Park Cheolwoo. The day to day operations during my research and life would have been nearly impossible without the guidance Park Cheolwoo, he was by my side every step of the way and provided countless suggestions on how to better my studies.

I am very thankful for your time, help and support throughout my graduate studies. The thirdly, I would to thank my advisor Dr. Nguyen Minh Phuc, Master Huyn Jo although different major and university but whenever they always helped, supported, and guided carefully for their guidance and feedback during my academic research. They were crucial elements to the success of the entire research team.

They were always there to bounce ideas off of and give a helping hand wherever they could. I have benefited from the work of the groups around Korea over the years and I have enjoyed the friendship and collegiality of the students, staff, and others who collaborated in the group’s projects during this time.