Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và hóa dược, việc tìm kiếm, phân lập các hoạt chất có nguồn gốc thực vật đóng vai trò quan trọng trong định hướng phát triển dược liệu chăm sóc sức khỏe con người. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, sở hữu thảm thực vật đa dạng và phong phú. Trong đó, chi Polyscias (chi Đinh lăng) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) là một nhóm thực vật có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền và dược lý hiện đại. Các nghiên cứu trước đây trên một số loài cùng chi như Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng lá nhỏ) hay Polyscias balfouriana Balf. (Đinh lăng lá tròn) đã chứng minh sự hiện diện của các nhóm hoạt chất có giá trị sinh học cao như steroid, triterpenoid và saponin, gắn liền với các tác dụng bồi bổ, tăng cường sức đề kháng, chống stress, chống viêm và kích thích hoạt động thần kinh.
Cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.) là một loài cây bụi thuộc chi này nhưng tính đến thời điểm thực hiện đề tài (năm 2010), các dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học của cây ở cả Việt Nam và trên thế giới còn rất hạn chế (chỉ có nghiên cứu ghi nhận dịch chiết có khả năng quyến rũ ruồi trái cây). Xuất phát từ thực tế đó, tác giả Dương Nhật Huy đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học với đề tài: "Tìm hiểu thành phần hóa học cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae)", dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết tại Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm:
- Thu hái, xử lý nguyên liệu thực vật và điều chế các loại cao chiết phân đoạn từ lá cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.).
- Khảo sát, lựa chọn phân đoạn thích hợp để tiến hành phân lập, tinh chế các hợp chất hữu cơ sạch bằng các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
- Sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại (1D-NMR và 2D-NMR) để xác định và biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.), thuộc chi Polyscias, họ Nhân sâm (Araliaceae).
- Phạm vi không gian và nguồn gốc mẫu: Mẫu lá tươi được thu hái tại tỉnh Tiền Giang và được giám định tên khoa học bởi ThS. Liêu Hồ Mỹ Trang (Bộ môn Hóa Thực vật, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh).
- Phạm vi thực nghiệm: Quá trình chiết xuất và sắc ký phân lập được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Quá trình đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được thực hiện tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội).
- Thời gian hoàn thành: Khóa luận được nghiệm thu vào tháng 5 năm 2010.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận được xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là hóa học nhóm saponin triterpenoid khung oleanane thường gặp trong họ Araliaceae, kết hợp với các nguyên lý chiết tách phân đoạn và phổ nghiệm hữu cơ.
Các cơ sở lý thuyết, khái niệm và phương pháp chuyên ngành được tác giả vận dụng gồm:
- Lý thuyết về nhóm saponin triterpenoid: Cơ sở cấu trúc của aglycon khung oleanane (acid oleanolic) và phần mạch đường glycoside (D-glucose, acid D-glucuronic, 6'-O-metyl glucuronat).
- Phương pháp chiết ngấm kiệt/ngâm dầm phân đoạn: Sử dụng dung môi etanol để trích ly toàn bộ hợp chất hữu cơ từ bột lá khô, sau đó phân tách thành các cao phân đoạn có độ phân cực tăng dần (ete dầu hỏa, clorofom, metanol).
- Kỹ thuật sắc ký phân tách và tinh chế:
- Sắc ký cột pha thuận (Normal phase column chromatography): Sử dụng chất hấp phụ là Silica gel 60 (kích thước hạt 0,040–0,063 mm, Merck).
- Sắc ký cột pha đảo (Reversed Phase column chromatography): Sử dụng chất hấp phụ pha đảo Silica gel RP-18 (Merck).
- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn nhôm Kieselgel 60 $F_{254}$ và bản mỏng pha đảo RP-18 ($25\text{DC}$ RP-18, Merck) để theo dõi, kiểm tra độ tinh khiết và gộp các phân đoạn giải ly.
- Thuốc thử hiện hình: Dung dịch acid sulfuric ($H_2SO_4$) đậm đặc kết hợp sấy nhiệt.
- Phương pháp xác định cấu trúc phân tử (Phổ NMR 1D và 2D):
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$): Ghi ở tần số 500 MHz trên thiết bị BRUKER AC 500.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ($^{13}\text{C-NMR}$) kết hợp kỹ thuật DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer): Ghi ở tần số 125 MHz trên thiết bị BRUKER AC 200.
- Các kỹ thuật phổ tương quan hai chiều (2D-NMR): Phổ tương quan proton - proton ($^1\text{H}-^1\text{H}\text{ COSY}$), phổ tương quan đơn lượng tử dị hạt trực tiếp qua 1 liên kết ($\text{HSQC}$), và phổ tương quan đa liên kết dị hạt qua 2, 3 liên kết ($\text{HMBC}$). Dung môi đo phổ là pyridin-$d_5$.
- Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Dữ liệu hóa lý thu thập trực tiếp từ 1,06 kg bột lá khô Đinh lăng trổ và các số liệu phổ đo thực tế.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các dữ liệu thực vật học, dược lý học và thành phần hóa học đã được công bố liên quan đến chi Polyscias:
- Mô tả thực vật: Mô tả hình thái học của cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.): loài cây bụi cao từ 3–4 m, thân ít phân nhánh, lá đa dạng có màu lục sáng, lá hai lần kép, lá phụ thon, mép lá có răng cưa và viền đốm trắng (trổ trắng).
- Các nghiên cứu về dược tính trong chi Polyscias:
- Polyscias guilfoylei Bail.: Nghiên cứu ghi nhận lá tươi, dịch trích nước và dịch trích diclorometan ($CH_2Cl_2$) có hoạt tính quyến rũ ruồi trái cây.
- Polyscias filicifolia Bail.: Dịch chiết sinh khối nuôi cấy tế bào có hoạt tính kháng mạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus, kháng yếu với Micrococcus flavus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae; dịch chiết cồn 40% thể hiện hoạt tính kháng đột biến gen trên chủng Salmonella typhimurium TA 98 và TA 100.
- Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng lá nhỏ): Tăng sức chịu đựng của cơ thể chống kiệt sức; tăng tiết niệu hơn 5 lần trên chuột; chống stress và trầm cảm ở liều 45–180 mg/kg thể trọng (nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự, 2001); dịch chiết cồn của rễ nuôi cấy mô 6 tháng thể hiện tác dụng tăng lực và chống viêm tương đương rễ cây 5 năm tuổi tự nhiên.
- Polyscias scutellaria (Burm. f.) Merr.: Cao chiết chứa saponin giúp vết thương nhanh lên da non trên chuột albino.
- Polyscias amplifolia: Các hợp chất saponin phân lập từ quả có hoạt tính gây độc tế bào yếu trên dòng ung thư buồng trứng A2780 ở người ($IC_{50} = 6{,}5\text{–}18{,}0\ \mu\text{g/mL}$).
- Polyscias balfouriana Balf. (Đinh lăng lá tròn): Là thành phần trong thực phẩm chức năng CERATO (sản xuất bởi Công ty CP Dược vật tư y tế Thành Vinh) giúp tăng cường sinh lực nam giới, giảm đau lưng mỏi gối.
- Trình bày 7 bài thuốc dân gian sử dụng Đinh lăng (P. fruticosa) chữa mệt mỏi, sốt lâu ngày, lợi sữa, đau tử cung, mẩn ngứa dị ứng, phòng kinh giật ở trẻ em và kinh nghiệm y học dân gian tại Ấn Độ, Campuchia.
- Các nghiên cứu về hóa học: Tổng hợp cấu trúc của 36 hợp chất đã từng được cô lập từ các loài trong chi Polyscias:
- P. filicifolia: Acid béo tương tự rễ Panax ginseng, $\beta$-sitosterol.
- P. fruticosa: 24 cấu tử tinh dầu (chính là $\beta$-elemen, $\alpha$-bergamoten, germacren-D, $(E)$-$\beta$-bisabolen); 5 hợp chất polyacetylen (falcarinol, panaxydol và các dẫn xuất heptadeca-dien-diyn); acid oleanolic và 11 hợp chất saponin triterpenoid oleanane gắn các mạch đường glucose, galactose, acid glucuronic, rhamnose, arabinose.
- P. scutellaria: 5 saponin triterpenoid glycoside.
- P. amplifolia: 4 saponin triterpenoid có aglycon là acid oleanolic và hederagenin; hederagenin có hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư P-388, L-1210, U-937, HL-60.
- P. fulva: 1 dammarane triterpene glycoside và các dẫn xuất sapogenin.
- P. nodosa và Polyscias sp.: Sapogenin $C_{42}H_{66}O_{15}$ cùng 2 flavonoid glycoside (quercetin-3-O-$\beta$-D-galactosid và quercetin-3-O-$\beta$-D-glucosid).
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 2 trình bày chi tiết quy trình xử lý mẫu, chiết xuất và quy trình sắc ký cô lập các hợp chất:
- Xử lý nguyên liệu: 1,06 kg lá Đinh lăng trổ phơi khô trong bóng râm, sấy ở $60^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi, xay thành bột mịn.
- Điều chế các loại cao chiết:
- Bột lá khô (1,06 kg) ngâm dầm trong dung môi etanol nhiều ngày, lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 108 g cao etanol toàn phần.
- Tiến hành sắc ký cột silica gel trên 108 g cao etanol, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần (ete dầu hỏa $\rightarrow$ clorofom $\rightarrow$ metanol). Thu hồi dung môi tạo ra 3 loại cao:
- Cao ete dầu hỏa (Phân đoạn I): 11,00 g.
- Cao clorofom (Phân đoạn II).
- Cao metanol (Phân đoạn III): 62,00 g.
- Cô lập các hợp chất hữu cơ từ cao metanol: Do kết quả sắc ký bản mỏng của cao metanol cho thấy các vết tách rõ nét, tác giả chọn phân đoạn này (62,00 g) để tiếp tục phân lập:
- Sắc ký cột lần 1 trên cao metanol (62 g): Giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần ($CHCl_3 : MeOH = 9:1$; $4:1$; $CHCl_3 : MeOH : H_2O = 96:28:3$; $MeOH : H_2O = 19:1$), thu được 4 phân đoạn từ III.1 đến III.4 (III.1: 3,60 g; III.2: 10,50 g; III.3: 20,00 g; III.4: 1,20 g). Chọn phân đoạn III.3 do có nhiều vết sắc ký tách rõ.
- Sắc ký cột lần 2 trên phân đoạn III.3 (20 g): Giải ly bằng hệ $CHCl_3 : MeOH : H_2O = 96:28:3$, thu được 3 phân đoạn phụ: III.3.1 (3,00 g), III.3.2 (20,00 g) và III.3.3 (0,86 g).
- Phân lập hợp chất GUI-1: Tiến hành sắc ký cột silica gel nhiều lần trên phân đoạn III.3.1 (3,00 g) với hệ dung môi $CHCl_3 : MeOH$ tỉ lệ 9:1 và 4:1 (trên bản mỏng xuất hiện 1 vết màu đỏ sen có $R_f = 0{,}4$ khi hiện hình bằng $H_2SO_4$ đặc), thu được hợp chất sạch dạng bột vô định hình màu trắng, ký hiệu là GUI-1 (khối lượng thu được 10 mg ở quy trình thực nghiệm, mẫu dùng đo phổ ghi nhận 43 mg).
- Phân lập hợp chất GUI-4: Tiến hành sắc ký cột trên phân đoạn III.3.2 (20,04 g) với hệ $CHCl_3 : MeOH = 4:1$; $CHCl_3 : MeOH : H_2O = 240:80:7$; $MeOH : H_2O = 19:1$, thu được 5 phân đoạn (III.3.2.1 đến III.3.2.5). Phân đoạn III.3.2.3 (3,6 g) chạy bản mỏng RP-18 với hệ $CHCl_3 : MeOH = 7:3$ cho vết đỏ sen có $R_f = 0{,}5$. Thực hiện sắc ký cột pha đảo RP-18 nhiều lần trên phân đoạn này thu được hợp chất sạch dạng tinh thể dài màu trắng, ký hiệu là GUI-4 (khối lượng 25 mg).
Chương 3: Khảo sát thành phần và cấu trúc hóa học của các mẫu chất thu được
Chương này tập trung phân tích và biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất GUI-1 dựa trên các dữ liệu phổ nghiệm:
- Đặc điểm hóa lý của GUI-1: Chất bột vô định hình màu trắng, tan trong pyridin-$d_5$.
- Biện luận cấu trúc hóa học GUI-1:
- Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT xác định GUI-1 có 43 nguyên tử carbon, bao gồm: 9 carbon bậc bốn (gồm 2 nhóm carbonyl $>C=O$, 1 carbon olefin không no $=C<$); 15 nhóm methine $>CH-$ (gồm 1 carbon olefin $=CH-$, 9 carbon liên kết oxy $>CH-O-$, 2 carbon anomer của đường, 3 carbon methine no); 11 nhóm methylene $-CH_2-$; và 8 nhóm methyl $-CH_3$.
- Hai mũi cộng hưởng carbon anomer tại $\delta_C = 106{,}8\text{ ppm}$ và $105{,}0\text{ ppm}$ cùng 8 carbon $>CH-O-$ trong vùng $\delta_C = 71{,}6\text{–}82{,}6\text{ ppm}$ chứng minh GUI-1 là một saponin chứa 2 phân tử đường (disaccharide).
- Phần khung aglycon được xác định là acid oleanolic: Tín hiệu 2 carbon olefin tại $\delta_C = 122{,}5\text{ ppm}$ (C-12, $=CH-$) và $\delta_C = 144{,}8\text{ ppm}$ (C-13, $=C<$); carbon C-28 là nhóm carboxyl tự do tại $\delta_C \approx 180\text{ ppm}$. Phổ $^1\text{H-NMR}$ xác nhận qua proton olefin $H-12$ tại $\delta_H = 5{,}41\text{ ppm}$ (br s), proton $H-3$ tại $\delta_H = 3{,}27\text{ ppm}$ ($dd, J = 12{,}0/4{,}0\text{ Hz}$), và proton $H-18$ tại $\delta_H = 3{,}19\text{ ppm}$ ($dd, J = 13{,}0/3{,}5\text{ Hz}$).
- Phần đường gồm 2 đơn vị đường đều có cấu hình $\beta$ do hằng số ghép của 2 proton anomer là $J = 7{,}5\text{ Hz}$ ($\delta_H = 4{,}89\text{ ppm}, d, J = 7{,}5\text{ Hz}, H-1'$ và $\delta_H = 4{,}91\text{ ppm}, d, J = 7{,}5\text{ Hz}, H-1''$):
- Đơn vị đường gắn trực tiếp vào aglycon là $6'\text{-O-metyl glucuronat}$: Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ có tín hiệu nhóm methoxy $-OCH_3$ tại $\delta_C = 52{,}4\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}83\text{ ppm}$) và nhóm carbonyl ester $C-6'$ tại $\delta_C = 170{,}0\text{ ppm}$. Phổ HMBC cho thấy tương quan chéo giữa $H-1'$ ($\delta_H = 4{,}89\text{ ppm}$) với carbon $C-3$ ($\delta_C = 89{,}3\text{ ppm}$) của acid oleanolic; tương quan giữa $H-5'$ ($\delta_H = 4{,}54\text{ ppm}$) với $C-6'$ ($\delta_C = 170{,}0\text{ ppm}$) và giữa proton nhóm methoxy $-OCH_3$ với $C-6'$.
- Đơn vị đường thứ hai là $\beta\text{-D-glucose}$: Có tín hiệu carbon $C-6''$ tại $\delta_C = 62{,}5\text{ ppm}$. Tương quan trên phổ HMBC giữa proton anomer $H-1''$ ($\delta_H = 4{,}91\text{ ppm}$) với carbon $C-4'$ ($\delta_C = 78{,}2\text{ ppm}$) của gốc glucuronat chứng minh liên kết glycoside là $1\rightarrow 4$.
- Đối chiếu số liệu phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) của GUI-1 với hợp chất đã công bố từ cây Polyscias balfouriana cho thấy hoàn toàn trùng khớp.
- Tác giả kết luận GUI-1 là acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-6'-O-metyl-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic.
- Khảo sát hợp chất GUI-4: Thu được 25 mg dạng tinh thể dài màu trắng từ phân đoạn III.3.2.3 bằng sắc ký pha đảo RP-18; tác giả nêu rõ do điều kiện thời gian có hạn nên chưa tiến hành đo và giải cấu trúc phân tử của mẫu chất này.
Chương 4: Kết luận
Tóm lược kết quả đạt được về việc cô lập thành công 2 hợp chất (GUI-1 và GUI-4) và xác định hoàn chỉnh cấu trúc hóa học của hợp chất saponin GUI-1 lần đầu tiên tìm thấy trong cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.).
Kết quả và đóng góp
1. Kết quả thực nghiệm chính
Quá trình chiết tách và sắc ký từ 1,06 kg bột lá khô Polyscias guilfoylei var. đã phân lập được các phân đoạn và hợp chất với các số liệu cụ thể:
| Mẫu / Phân đoạn |
Khối lượng |
Trạng thái vật lý / Đặc điểm |
| Bột lá khô ban đầu |
$1{,}06\text{ kg}$ |
Bột mịn sấy khô ở $60^\circ\text{C}$ |
| Cao chiết etanol toàn phần |
$108{,}00\text{ g}$ |
Cao tổng chiết ngâm dầm |
| Cao ete dầu hỏa (Phân đoạn I) |
$11{,}00\text{ g}$ |
Sắc ký cột đơn dung môi |
| Cao metanol (Phân đoạn III) |
$62{,}00\text{ g}$ |
Sắc ký cột đơn dung môi, phân cực cao |
| Phân đoạn III.3 |
$20{,}00\text{ g}$ |
Cột silica gel hệ $CHCl_3 : MeOH : H_2O$ |
| Phân đoạn III.3.1 |
$3{,}00\text{ g}$ |
Cột silica gel hệ $CHCl_3 : MeOH$ |
| Hợp chất GUI-1 |
$10\text{–}43\text{ mg}$ |
Bột vô định hình màu trắng, $R_f = 0{,}4$ ($CHCl_3:MeOH\ 4:1$) |
| Hợp chất GUI-4 |
$25{,}00\text{ mg}$ |
Tinh thể dài màu trắng, $R_f = 0{,}5$ (RP-18, $CHCl_3:MeOH\ 7:3$) |
Số liệu phổ NMR quy kết cấu trúc hợp chất GUI-1 (đo trong dung môi Pyridin-$d_5$):
- Phần aglycon (Acid oleanolic): $\delta_C\text{ (C-3)} = 89{,}3\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}27\text{ ppm}, dd, J = 12{,}0/4{,}0\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-12)} = 122{,}5\text{ ppm}$ ($\delta_H = 5{,}41\text{ ppm}, br s$); $\delta_C\text{ (C-13)} = 144{,}8\text{ ppm}$; $\delta_C\text{ (C-18)} = 48{,}0\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}19\text{ ppm}, dd, J = 13{,}0/3{,}5\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-28)} = 180\text{ ppm}$.
- Phần đường $6'\text{-O-metyl glucuronat}$: $\delta_C\text{ (C-1')} = 105{,}0\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}89\text{ ppm}, d, J = 7{,}5\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-2')} = 74{,}8\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}02\text{ ppm}$); $\delta_C\text{ (C-3')} = 78{,}2\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}23\text{ ppm}$); $\delta_C\text{ (C-4')} = 78{,}2\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}36\text{ ppm}$); $\delta_C\text{ (C-5')} = 76{,}6\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}54\text{ ppm}$); $\delta_C\text{ (C-6')} = 170{,}0\text{ ppm}$ (carbonyl ester); $\delta_C\text{ (-OCH}_3\text{)} = 52{,}4\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}83\text{ ppm}$).
- Phần đường $\beta\text{-D-glucose}$: $\delta_C\text{ (C-1'')} = 106{,}8\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}91\text{ ppm}, d, J = 7{,}5\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-2'')} = 74{,}4\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}87\text{ ppm}, t, J = 8{,}0\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-3'')} = 78{,}5\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}09\text{ ppm}, t, J = 9{,}0\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-4'')} = 71{,}6\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}13\text{ ppm}, t, J = 8{,}0\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-5'')} = 78{,}5\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}89\text{ ppm}, t, J = 8{,}0\text{ Hz}$); $\delta_C\text{ (C-6'')} = 62{,}5\text{ ppm}$ ($\delta_H = 4{,}44\text{ ppm}, dd, J = 11{,}5/2{,}0\text{ Hz}$).
2. Đóng góp khoa học của khóa luận
- Mặc dù hợp chất acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-6'-O-metyl-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic từng được tìm thấy trong cây Polyscias balfouriana, đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam chứng minh và công bố sự hiện diện của hợp chất saponin triterpenoid này trong loài Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.).
- Xây dựng thành công quy trình chiết xuất, phân lập hợp chất nhóm saponin có độ phân cực cao từ cao chiết metanol của lá Đinh lăng trổ bằng việc kết hợp sắc ký cột pha thuận và sắc ký cột pha đảo RP-18.
- Cung cấp bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) chuẩn xác của hợp chất triterpene bidesmoside có nhóm ester hóa methyl tại vị trí C-6' của phân tử đường glucuronate.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Khóa luận tự chỉ ra một số điểm hạn chế do giới hạn về thời gian thực hiện nghiên cứu cử nhân:
- Hạn chế:
- Mới chỉ khảo sát sâu phân đoạn cao metanol (Phân đoạn III) và một nhánh phân đoạn phụ (III.3), chưa tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của cao ete dầu hỏa (Phân đoạn I) và cao clorofom (Phân đoạn II).
- Chưa tiến hành đo và biện luận cấu trúc phân tử cho hợp chất GUI-4 (25 mg, dạng tinh thể dài màu trắng) đã phân lập được từ sắc ký pha đảo RP-18.
- Chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, gây độc tế bào, chống oxy hóa...) trên các hợp chất tinh khiết thu được.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Tiếp tục đo các phổ nghiệm cần thiết ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, MS...) để xác định cấu trúc phân tử của hợp chất GUI-4.
- Tiếp tục triển khai sắc ký phân lập các hợp chất hữu cơ trong các phân đoạn còn lại của cao metanol cũng như các cao phân đoạn kém phân cực hơn (cao ete dầu và cao clorofom).
- Khảo sát hoạt tính sinh học và dược tính của các saponin cô lập được từ lá cây Đinh lăng trổ.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho các đối tượng và mục đích học thuật cụ thể:
- Đối tượng sử dụng:
- Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược học (Dược liệu học) và Thực vật học.
- Các nhóm nghiên cứu đang thực hiện đề tài về chiết tách, tinh chế hoạt chất tự nhiên từ các loài thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) hoặc họ Nhân sâm (Araliaceae).
- Các nội dung có giá trị tham khảo cao:
- Tổng quan tài liệu (Chương 1): Cung cấp danh mục tổng hợp 36 cấu trúc hóa học và các thử nghiệm dược lý chuyên sâu của các loài trong chi Polyscias (kèm hệ thống tài liệu tham khảo trong và ngoài nước).
- Phương pháp thực nghiệm (Chương 2): Quy trình điều chế cao phân đoạn, các hệ dung môi giải ly tối ưu cho phân tách saponin phân cực trên silica gel thường ($CHCl_3:MeOH:H_2O$) và silica gel pha đảo RP-18.
- Biện luận cấu trúc (Chương 3): Quy trình phân tích chi tiết phổ 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC) để xác định vị trí liên kết glycoside giữa các phân tử đường và liên kết giữa mạch đường với khung aglycon triterpenoid, đặc biệt là việc nhận diện nhóm ester metyl trên vòng glucuronat.
Câu hỏi thường gặp
1. Cây Đinh lăng trổ sử dụng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và do ai định danh tên khoa học?
Mẫu lá cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var.) được thu hái tại tỉnh Tiền Giang và được giám định tên khoa học chính xác bởi ThS. Liêu Hồ Mỹ Trang thuộc Bộ môn Hóa Thực vật, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Hợp chất GUI-1 được phân lập từ phân đoạn cao nào và có cấu trúc hóa học là gì?
Hợp chất GUI-1 được cô lập từ phân đoạn cao metanol (cụ thể là qua các phân đoạn cột III $\rightarrow$ III.3 $\rightarrow$ III.3.1) của lá cây Đinh lăng trổ. Cấu trúc hóa học của GUI-1 được xác định là acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-6'-O-metyl-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic, thuộc nhóm saponin triterpenoid khung oleanane có gắn 2 phân tử đường.
3. Dữ liệu phổ NMR nào chứng minh khung aglycon của GUI-1 là acid oleanolic?
Sự hiện diện của khung aglycon acid oleanolic được chứng minh qua 2 tín hiệu carbon olefin trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$ tại $\delta_C = 122{,}5\text{ ppm}$ (C-12) và $\delta_C = 144{,}8\text{ ppm}$ (C-13), nhóm carboxyl tự do tại C-28 ($\delta_C \approx 180\text{ ppm}$), kết hợp với các mũi cộng hưởng proton trên phổ $^1\text{H-NMR}$ tại $\delta_H = 5{,}41\text{ ppm}$ ($br\ s$, H-12), $\delta_H = 3{,}27\text{ ppm}$ ($dd, J = 12{,}0/4{,}0\text{ Hz}$, H-3) và $\delta_H = 3{,}19\text{ ppm}$ ($dd, J = 13{,}0/3{,}5\text{ Hz}$, H-18).
4. Dựa vào tương quan phổ nào để xác định vị trí nhóm ester 6'-O-metyl và liên kết giữa hai phân tử đường trong hợp chất GUI-1?
Vị trí nhóm ester được xác định nhờ tín hiệu methoxy tại $\delta_C = 52{,}4\text{ ppm}$ ($\delta_H = 3{,}83\text{ ppm}$) và tương quan chéo trên phổ HMBC giữa proton nhóm $-OCH_3$ với carbon carbonyl C-6' ($\delta_C = 170{,}0\text{ ppm}$), cùng tương quan giữa H-5' ($\delta_H = 4{,}54\text{ ppm}$) với C-6'. Vị trí liên kết giữa 2 phân tử đường được xác định là $1\rightarrow 4$ nhờ tương quan HMBC giữa proton anomer H-1'' ($\delta_H = 4{,}91\text{ ppm}$) của đường glucose với carbon C-4' ($\delta_C = 78{,}2\text{ ppm}$) của gốc glucuronat.
5. Khóa luận đã phân lập được bao nhiêu hợp chất sạch và tình trạng xác định cấu trúc của các chất này như thế nào?
Khóa luận đã phân lập được 2 hợp chất sạch từ cao metanol là GUI-1 (bột vô định hình màu trắng, 10–43 mg) và GUI-4 (tinh thể dài màu trắng, 25 mg). Trong đó, GUI-1 đã được giải và chứng minh hoàn chỉnh cấu trúc hóa học qua hệ thống phổ 1D và 2D-NMR, còn hợp chất GUI-4 chưa được xác định cấu trúc phân tử do hạn chế về thời gian thực hiện đề tài.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Dương Nhật Huy đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học từ lá cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei var., họ Araliaceae) thu hái tại Tiền Giang. Nghiên cứu đã chiết xuất phân đoạn và cô lập thành công 2 hợp chất hữu cơ sạch, trong đó đã làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của hợp chất saponin triterpenoid acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-6'-O-metyl-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic (GUI-1) bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR. Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên công bố sự hiện diện của hợp chất này trong loài Polyscias guilfoylei var., đóng góp dữ liệu khoa học thực nghiệm có giá trị cho việc nghiên cứu và khai thác nguồn tài nguyên thực vật chi Đinh lăng tại Việt Nam.
