Khóa luận: Phát hiện virus gây bệnh khảm lá khoai mì tại Tây Ninh bằng Multiplex PCR

Khóa luận công nghệ sinh học: Nghiên cứu virus khảm lá khoai mì tại Tây Ninh bằng multiplex PCR. Đánh giá hiện trạng nhiễm bệnh trên các giống khoai mì.

• Tác giả: Phan Huỳnh Thanh Tín
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Đức Toàn
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Sử dụng phương pháp Multiplex PCR chuẩn đoán, đánh giá hiện trạng nhiễm virus gây bệnh khảm lá trên các giống khoai mì (Manihot esculenta Crantz) tại Tây Ninh
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN CỦA TÁC GIẢ
• TÓM TẮT
• SUMARY
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu
• 1.3. Nội dung thực hiện
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về cây Khoai Mì
• 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
• 2.1.2. Tên khoa học và phân loại
• 2.1.3. Đặc điểm hình thái
• 2.1.4. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng
• 2.1.5. Tình hình sản xuất Khoai mì trên thế giới và Việt Nam
• 2.1.5.1. Tình hình sản xuất Khoai mì trên thế giới
• 2.1.5.2. Tình hình sản xuất khoai mì tại Việt Nam
• 2.2. Sơ lược về bệnh Khảm lá trên khoai mì
• 2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế gây bệnh
• 2.2.1.1. Cấu trúc RNA gây bệnh
• 2.2.1.2. Cơ chế gây bệnh
• 2.3. Tổng quan về Kỹ thuật PCR
• 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR
• 2.5. Một số nghiên cứu bệnh khảm lá Khoai mì trên thế giới và trong nước
• 2.5.1. Một số nghiên cứu bệnh khảm lá Khoai mì trên thế giới
• 2.5.2. Một số nghiên cứu bệnh khảm lá khoai mì tại Việt Nam
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu
• 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2.2. Hóa chất và thiết bị
• 3.2.3. Tổ hợp mồi dùng trong phản ứng Multiplex PCR
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Khảo sát và mô tả triệu chứng các giống bệnh
• 3.3.2. Sử dụng phương pháp Multiplex PCR để chuẩn đoán, phát hiện virus gây bệnh khảm trên các giống
• 3.3.2.1. Lấy và trích DNA
• 3.3.2.2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện virus gây bệnh
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả mô tả triệu chứng bệnh khảm lá trên 2 giống khoai mì bị bệnh KM505 và KM140
• 4.1.1. Kết quả mô tả triệu chứng trên lá non bị bệnh của giống KM505
• 4.1.2. Kết quả mô tả triệu chứng trên lá già bị bệnh của giống KM505
• 4.1.3. Kết quả mô tả triệu chứng trên thân bị bệnh của giống KM505
• 4.1.4. Kết quả mô tả triệu chứng trên lá non bị bệnh của giống KM140
• 4.1.5. Kết quả mô tả triệu chứng trên lá già bị bệnh của giống KM140
• 4.1.6. Kết quả mô tả triệu chứng trên thân bị bệnh của giống KM140
• 4.2. Kết quả phát hiện các chủng virus gây bệnh khảm lá khoai mì bằng phương pháp Multiplex PCR
• 4.2.1. Kết quả điện di tổng số DNA của 6 giống thu thập được
• 4.2.2. Kết quả PCR và Multiplex PCR phát hiện các chủng virus trên giống bị khảm KM505
• 4.2.2.1. Kết quả PCR phát hiện chủng virus SLCMV trên giống bị khảm KM505
• 4.2.2.2. Kết quả Multiplex PCR phát hiện 2 chủng virus ACMV và EACMV trên
• 4.2.3. Kết quả PCR và Multiplex PCR phát hiện các chủng virus trên giống bị khảm KM140
• 4.2.3.1. Kết quả PCR phát hiện chủng virus SLCMV trên giống bị khảm KM140
• 4.2.3.2. Kết quả Multiplex PCR phát hiện 2 chủng virus ACMV và EACMV trên giống bị khảm KM140
• 4.2.4. Kết quả PCR và Multiplex PCR phát hiện các chủng virus trên 2 giống kháng khảm HN97 và HN3
• 4.2.4.1. Kết quả PCR phát hiện SLCMV trên 2 giống kháng khảm HN97 và HN3
• 4.2.4.2. Kết quả Multiplex PCR phát hiện 2 chủng virus ACMV và EACMV trên 2 giống lưng
• 4.2.5. Kết quả PCR và Multiplex PCR phát hiện các chủng virus trên 2 giống kháng khảm HN5 và HN1
• 4.2.5.1. Kết quả PCR phát hiện SLCMV trên 2 giống kháng khảm HN5 và HN1
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan bệnh khảm lá khoai mì phương pháp PCR đa mồi

Bệnh khảm lá khoai mì, hay còn gọi là Cassava Mosaic Disease (CMD), là một trong những dịch bệnh nguy hiểm nhất, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng cây khoai mì (sắn) tại Việt Nam và nhiều quốc gia khác. Tác nhân chính gây bệnh là các chủng virus thuộc chi Begomovirus, trong đó ba chủng đã được xác định tại Việt Nam là Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV), African cassava mosaic virus (ACMV), và East African cassava mosaic virus (EACMV). Virus lây lan chủ yếu qua hai con đường: sử dụng hom giống nhiễm bệnh và qua vector truyền bệnh là bọ phấn trắng (Bemisia tabaci). Thiệt hại do bệnh khảm lá sắn có thể lên tới 82% năng suất, đe dọa an ninh lương thực và kinh tế của người nông dân. Do triệu chứng bệnh có thể không biểu hiện rõ ràng ở giai đoạn đầu hoặc dễ nhầm lẫn, việc giám định chính xác mầm bệnh trở nên cấp thiết. Để giải quyết thách thức này, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được ứng dụng, trong đó nổi bật là phương pháp Multiplex PCR. Đây là một kỹ thuật cho phép phát hiện đồng thời nhiều tác nhân virus khác nhau chỉ trong một phản ứng duy nhất. Bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu (primers), phương pháp này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian, chi phí mà còn tăng cường độ chính xác trong việc chẩn đoán virus SLCMV và các chủng khác, cung cấp thông tin quan trọng cho công tác quản lý dịch bệnh và chọn lọc vật liệu nhân giống sạch bệnh. Bài viết này sẽ đi sâu vào việc phân tích quy trình và ứng dụng của việc khảo sát virus khảm lá khoai mì bằng Multiplex PCR dựa trên các nghiên cứu thực tiễn.

1.1. Nhận diện bệnh khảm lá sắn Cassava Mosaic Disease CMD

Triệu chứng của bệnh khảm lá sắn rất đặc trưng và dễ nhận biết trên đồng ruộng. Trên lá non, bệnh biểu hiện qua các vết đốm vàng xen kẽ với mảng xanh bình thường, tạo thành thể khảm. Phiến lá thường bị biến dạng, nhăn nhúm, co lại và mép lá cong queo. Khi cây bị nhiễm bệnh nặng từ giai đoạn sớm (do trồng từ hom bệnh), cây sẽ trở nên còi cọc, lùn, phát triển kém, dẫn đến giảm năng suất củ nghiêm trọng hoặc không cho thu hoạch. Theo nghiên cứu của Phan Huỳnh Thanh Tín (2023), trên giống KM140 bị nhiễm bệnh, triệu chứng biểu hiện rất nặng ngay từ lá non với vết đốm lan rộng, bề mặt lá sần sùi và xoăn nhiều. Trong khi đó, giống KM505 có biểu hiện nhẹ hơn ở giai đoạn đầu. Việc nhận diện chính xác các triệu chứng này là bước đầu tiên quan trọng trong công tác giám định bệnh cây và khoanh vùng dịch hại.

1.2. Vai trò của kỹ thuật sinh học phân tử trong giám định bệnh

Việc chẩn đoán bệnh chỉ dựa vào triệu chứng bên ngoài có thể không chính xác, đặc biệt khi cây mới nhiễm bệnh hoặc nhiễm đồng thời nhiều loại virus. Các kỹ thuật sinh học phân tử cung cấp công cụ chẩn đoán với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) có khả năng khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần, cho phép phát hiện virus thực vật ngay cả khi chúng tồn tại với hàm lượng rất thấp trong mẫu cây. Kỹ thuật này đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong nhiều phòng thí nghiệm bệnh cây, giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh ở cấp độ phân tử, là nền tảng cho các chương trình quản lý dịch bệnh hiệu quả và bền vững.

II. Các thách thức trong việc giám định virus khảm lá sắn CMD

Việc kiểm soát bệnh khảm lá sắn đối mặt với nhiều thách thức lớn, bắt nguồn từ chính đặc tính sinh học của virus và phương thức canh tác. Thách thức lớn nhất là tốc độ lây lan nhanh chóng của bệnh. Virus không chỉ tồn tại trong cây bị nhiễm mà còn được lan truyền hiệu quả qua vector bọ phấn trắng, khiến dịch bệnh bùng phát trên diện rộng trong thời gian ngắn. Thêm vào đó, tập quán sử dụng hom giống từ vụ trước để trồng của nông dân vô tình trở thành con đường lan truyền bệnh chủ yếu. Một hom giống nhiễm bệnh có thể trở thành nguồn lây cho cả một ruộng khoai mì mới. Một thách thức khác đến từ sự đa dạng của các chủng virus. Một cây khoai mì có thể bị nhiễm đồng thời nhiều chủng virus (như SLCMV, ACMV, EACMV), gây ra triệu chứng phức tạp và mức độ thiệt hại nặng nề hơn. Điều này đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán phải có khả năng phân biệt và phát hiện đồng thời nhiều tác nhân. Các phương pháp giám định truyền thống dựa trên triệu chứng lâm sàng thường không đủ độ tin cậy. Do đó, việc xây dựng một quy trình giám định bệnh cây nhanh chóng, chính xác và hiệu quả như Multiplex PCR là yêu cầu cấp bách để đối phó với dịch bệnh, hỗ trợ công tác giám sát dịch tễ học phân tử và bảo vệ ngành sản xuất khoai mì.

2.1. Con đường lây nhiễm và tốc độ lan truyền của virus

Virus gây bệnh khảm lá sắn lan truyền qua hai con đường chính. Thứ nhất là qua hom giống: virus tồn tại trong thân, lá, củ nên khi nông dân sử dụng thân cây bị bệnh để làm giống, cây non mọc lên sẽ mang mầm bệnh ngay từ đầu và biểu hiện triệu chứng sớm. Đây là con đường lây truyền nguy hiểm nhất, làm dịch bệnh kéo dài từ vụ này sang vụ khác. Thứ hai là qua vector truyền bệnh, chủ yếu là bọ phấn trắng (Bemisia tabaci). Bọ phấn trắng chích hút nhựa cây bị bệnh sẽ mang theo virus và truyền sang cây khỏe mạnh khi chúng di chuyển và kiếm ăn. Tốc độ lan truyền qua bọ phấn trắng rất nhanh, có thể gây bùng phát dịch trên quy mô lớn.

2.2. Hiện tượng đồng nhiễm nhiều chủng virus trên một cây

Một trong những vấn đề phức tạp nhất trong việc quản lý CMD là hiện tượng một cây khoai mì có thể bị nhiễm cùng lúc nhiều chủng virus. Nghiên cứu của Lê Đức Hưng và cộng sự (2019) tại Tây Ninh đã xác nhận sự hiện diện của cả ba chủng ACMV, EACMV và SLCMV. Tình trạng đồng nhiễm này không chỉ làm cho triệu chứng bệnh trở nên nghiêm trọng hơn mà còn gây khó khăn cho công tác chẩn đoán nếu sử dụng các phương pháp đơn mục tiêu. Việc phát hiện virus thực vật đòi hỏi một công cụ có khả năng sàng lọc đa tác nhân, và đây chính là thế mạnh của kỹ thuật PCR đa mồi.

III. Hướng dẫn khảo sát virus khảm lá bằng Multiplex PCR tối ưu

Phương pháp khảo sát virus khảm lá khoai mì bằng Multiplex PCR là một giải pháp hiệu quả, cho phép phát hiện đồng thời nhiều chủng virus trong một lần chạy phản ứng. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên việc sử dụng một hỗn hợp gồm nhiều cặp mồi đặc hiệu (primers), mỗi cặp được thiết kế để nhận diện và khuếch đại một đoạn gen đặc trưng của một chủng virus nhất định. Khi thực hiện phản ứng, nếu trong mẫu DNA có chứa virus nào, đoạn gen của virus đó sẽ được nhân lên thành hàng triệu bản sao. Sản phẩm sau phản ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Sự xuất hiện của các vạch DNA (band) ở những kích thước xác định sẽ khẳng định sự hiện diện của từng chủng virus. Ví dụ, trong nghiên cứu của Phan Huỳnh Thanh Tín (2023), các cặp mồi được sử dụng để phát hiện ACMV (cho sản phẩm 368 bp), EACMV (650 bp), và SLCMV (1056 bp). Ưu điểm của phương pháp PCR đa mồi là tiết kiệm đáng kể thời gian, hóa chất và công sức so với việc thực hiện nhiều phản ứng PCR đơn lẻ. Hơn nữa, nó cung cấp một bức tranh toàn cảnh về tình trạng đồng nhiễm virus trên cây, một thông tin cực kỳ giá trị cho công tác nghiên cứu và quản lý dịch hại.

3.1. Nguyên lý hoạt động cốt lõi của phương pháp PCR đa mồi

Về cơ bản, Multiplex PCR vận hành dựa trên nguyên tắc của PCR truyền thống nhưng với sự phức tạp hơn trong thiết kế phản ứng. Các thành phần chính bao gồm DNA khuôn mẫu (chiết xuất từ lá cây nghi nhiễm), hỗn hợp dNTPs, enzyme Taq polymerase chịu nhiệt, dung dịch đệm và quan trọng nhất là một tổ hợp nhiều cặp mồi đặc hiệu. Mỗi cặp mồi được thiết kế cẩn thận để có nhiệt độ bắt cặp (Tm) tương đồng, tránh hiện tượng bắt cặp chéo với nhau (primer-dimer) và đảm bảo khuếch đại hiệu quả các đoạn gen mục tiêu có độ dài khác nhau. Quá trình này giúp phân biệt rõ ràng các sản phẩm trên gel điện di, từ đó xác định chính xác các chủng virus có mặt trong mẫu.

3.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu primers cho chẩn đoán virus

Thành công của một phản ứng Multiplex PCR phụ thuộc rất lớn vào chất lượng của các cặp mồi. Dựa trên tài liệu tham khảo, nghiên cứu tại Việt Nam đã sử dụng các cặp mồi đã được công bố và kiểm chứng hiệu quả. Ví dụ, tổ hợp mồi CMBRep/F, ACMVRep/R và EACMVRep/R được dùng để phát hiện đồng thời ACMV và EACMV, trong đó CMBRep/F là mồi xuôi chung cho cả hai chủng. Tương tự, cặp mồi SLCMV-F và SLCMV-R được dùng để phát hiện chuyên biệt SLCMV (Lê Đức Hưng & ctv, 2019). Việc lựa chọn các đoạn gen bảo tồn và đặc hiệu cho từng virus để thiết kế mồi là bước tối quan trọng, đảm bảo phản ứng chỉ khuếch đại đúng đối tượng cần tìm.

IV. Quy trình chuẩn đoán virus khảm lá bằng Multiplex PCR A Z

Quy trình khảo sát virus khảm lá khoai mì bằng Multiplex PCR là một chuỗi các bước được thực hiện nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy. Quy trình này bắt đầu từ khâu thu thập mẫu ngoài thực địa, tiếp đến là xử lý và chiết tách DNA tổng số trong phòng thí nghiệm, và cuối cùng là thực hiện phản ứng PCR và phân tích kết quả. Bước đầu tiên, thu mẫu, đòi hỏi chọn lựa các lá non có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ ràng, bảo quản trong điều kiện thích hợp để tránh sự phân hủy của vật chất di truyền. Tiếp theo, quá trình chiết tách DNA tổng số từ mẫu lá là bước nền tảng, quyết định chất lượng và độ tinh sạch của DNA khuôn. Các phương pháp như sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) thường được áp dụng. Sau khi có DNA tinh sạch, phản ứng Multiplex PCR được thiết lập với các thành phần và chu trình nhiệt đã được tối ưu hóa. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose. Kết quả được đọc dưới đèn UV, dựa vào sự xuất hiện của các vạch sáng ở các vị trí tương ứng với kích thước mong đợi của từng chủng virus. Toàn bộ quy trình này, từ khi lấy mẫu đến khi có kết quả, có thể hoàn thành trong vòng một ngày, cung cấp một công cụ giám định bệnh cây nhanh và hiệu quả.

4.1. Quy trình chiết tách DNA tổng số từ mẫu lá khoai mì

Chất lượng DNA khuôn là yếu tố tiên quyết cho sự thành công của phản ứng PCR. Quy trình chiết tách DNA từ mẫu lá khoai mì thường theo phương pháp SDS. Mẫu lá (khoảng 50-100 mg) được nghiền mịn trong dung dịch đệm ly giải (lysis buffer) chứa SDS để phá vỡ màng tế bào. Sau đó, hỗn hợp được xử lý với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol và Chloroform để loại bỏ protein và các tạp chất khác. DNA được tủa lại bằng ethanol lạnh, rửa sạch và hòa tan trong dung dịch đệm TE. Kết quả của quá trình này là dung dịch DNA tổng số tương đối tinh sạch, sẵn sàng cho các phân tích phân tử tiếp theo. Việc kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA bằng điện di hoặc máy đo quang phổ là cần thiết trước khi thực hiện PCR.

4.2. Phân tích kết quả điện di để phát hiện virus gây bệnh

Đây là bước cuối cùng để trực quan hóa kết quả của phản ứng Multiplex PCR. Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch tải mẫu (loading buffer) và nạp vào các giếng trên một bản gel agarose. Một thang DNA (DNA ladder) với các đoạn có kích thước đã biết cũng được chạy song song để làm chuẩn. Khi dòng điện được áp dụng, các đoạn DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương, với các đoạn nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn. Sau khi nhuộm gel bằng chất phát quang (ví dụ: GelRed) và quan sát dưới đèn UV, sự hiện diện của virus được xác nhận bởi các vạch sáng có kích thước trùng khớp với kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến. Ví dụ, một mẫu dương tính với cả 3 chủng sẽ cho 3 vạch ở 1056 bp (SLCMV), 650 bp (EACMV), và 368 bp (ACMV).

V. Ứng dụng Multiplex PCR Sàng lọc giống sắn kháng bệnh

Kết quả từ việc khảo sát virus khảm lá khoai mì bằng Multiplex PCR mang lại giá trị ứng dụng thực tiễn to lớn, đặc biệt trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Kỹ thuật này không chỉ xác nhận sự hiện diện của mầm bệnh mà còn là công cụ đắc lực để sàng lọc, tuyển chọn các giống sắn kháng bệnh và đảm bảo chất lượng của vật liệu nhân giống sạch bệnh. Nghiên cứu thực hiện tại Tây Ninh (Phan Huỳnh Thanh Tín, 2023) là một minh chứng rõ ràng. Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh trên hai giống KM505 và KM140 là 100% với cả ba chủng virus ACMV, EACMV, và SLCMV. Ngược lại, bốn giống khoai mì khác là HN97, HN3, HN5, và HN1 hoàn toàn không phát hiện thấy virus, với tỷ lệ nhiễm là 0%. Những dữ liệu này khẳng định được đặc tính kháng bệnh (hoặc sạch bệnh tại thời điểm khảo sát) của các giống HN và tính mẫn cảm của các giống KM. Dựa trên kết quả này, các cơ quan nông nghiệp có thể đưa ra khuyến cáo chính xác cho nông dân về việc lựa chọn giống canh tác, ưu tiên nhân rộng các giống sạch bệnh như HN97 và HN1. Đây là một bước đi chiến lược trong biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), giúp giảm thiểu rủi ro, bảo vệ năng suất và hướng tới một nền nông nghiệp bền vững.

5.1. Kết quả thực nghiệm phát hiện virus trên các giống khoai mì

Nghiên cứu của Phan Huỳnh Thanh Tín (2023) đã cung cấp dữ liệu định lượng cụ thể. Phản ứng PCR và Multiplex PCR đã phát hiện sự hiện diện của cả ba chủng virus ACMV, EACMV và SLCMV trên 100% các mẫu thuộc giống KM505 và KM140. Đáng chú ý, ngay cả những mẫu lá chưa biểu hiện triệu chứng rõ ràng cũng cho kết quả dương tính, cho thấy virus đã tồn tại trong cây trước khi gây ra các tổn thương có thể quan sát bằng mắt thường. Ngược lại, tất cả các mẫu từ giống HN97, HN3, HN5, và HN1 đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ đây là nguồn giống sạch bệnh tiềm năng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với hiện trạng thực tế các giống này đang được nhân rộng tại Tây Ninh.

5.2. Ý nghĩa trong việc chọn lọc vật liệu nhân giống sạch bệnh

Sử dụng vật liệu nhân giống sạch bệnh là biện pháp phòng trừ bệnh khảm lá sắn hiệu quả và bền vững nhất. Kết quả phân tích Multiplex PCR cung cấp một chứng nhận khoa học về tình trạng sức khỏe của cây giống. Các trung tâm giống, viện nghiên cứu và doanh nghiệp có thể áp dụng quy trình này để kiểm tra định kỳ nguồn giống bố mẹ, đảm bảo rằng chỉ những cây sạch bệnh mới được đưa vào sản xuất và cung cấp cho nông dân. Điều này giúp cắt đứt chu trình lây truyền bệnh qua hom giống, giảm thiểu sự bùng phát dịch ở các vụ sau và hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cây khoai mì hay còn gọi là San ( Manihot esculenta Crantz ) phố biến nhất ở Nam Mỹ, Châu Phi và Châu Á. Thuộc top cây lương thực quan trọng chỉ sau Lúa và Ngô. Không chỉ dùng làm thức ăn cho cả người hoặc trong chăn nuôi mà còn được sản xuất cho các doanh nghiệp chế biến sản phẩm trong nước và xuất khâu ra nước ngoài. Ở Việt Nam, theo báo cáo của Cục Trồng trọt (Bộ NN&PTNT), hiện nay khoai mi và các san phẩm từ khoai mì là một trong 13 sản phẩm nông sản chủ lực với kim ngạch xuất khâu 1,35 tỷ USD/năm, đứng thứ 2 thế giới chỉ sau Thái Lan.

Tây Ninh và Gia Lai hiện là 2 tỉnh dẫn đầu về diện tích và năng suất của khoai mì ở nước ta. Theo Sở NN&PTNT Tây Ninh cho biết, tinh có diện tích trồng khoai mì lớn thứ hai cả nước (sau Gia Lai) nhưng năng suất đứng nhất cả nước, diện tích trồng khoai mì hằng năm của Tây Ninh đạt khoảng 59.000 ha, chiếm 22,1% tổng diện tích đất sản xuất nông nghiệp của tỉnh, năng suất trung bình khoảng 33 tan/ha. Với diện tích lớn như vậy việc kiểm soát các nguồn bệnh trên cây khoai mì là vô cùng quan trọng. Và van đề lớn nhất hiện nay là sự xuất hiện của bệnh khám lá trên cây khoai mì.

Đây là bệnh do virus gây ra nghiêm trọng nhất trên cây khoai mì (Cassava Mosaic Virus -CMV) ở tiểu vùng Sahara Châu Phi (Legg & ctv, 2006). Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1894 tại Châu Phi, là dịch bệnh nguy hiểm có kha năng lây lan nhanh va gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và chất lượng khoai mì. Năm 2005, bệnh kham lá khoai mì (Casava Mosaic Disease - CMD) đã ảnh hưởng đến 9 quốc gia ở Đông và Trung Phi có diện tích 2,6 triệu km2 và gây thiệt hại ước tính 47% sản lượng ở các quốc gia bi ảnh hưởng tương đương với hơn 13 triệu tan (Legg & ctv, 2006). Đến nay, trên thé giới có 9 chủng virus thuộc chỉ Begomovirus, họ Geminiviridae đã được ghi nhận trên cây khoai mì (Duraisamy & ctv, 2013).

Tất cả các chủng này tấn công đều gây các triệu chứng bệnh trên cây khoai mì như : Lá đốm vàng, xoăn, cây còi cọc, kém phát triển. Cây có thé bị nhiễm một hoặc nhiều chủng khác nhau. Tại Tây Ninh, tính đến ngày 18/3/2022, tổng diện tích sản xuất khoai mì còn trên đồng là 46.613 ha, diện tích nhiễm bệnh kham lá còn trên đồng là 36.968 ha, chiếm 79,3% 1 diện tích khoai mì còn trên đồng của tỉnh Tây Ninh. Và Tây Ninh cũng là điểm đầu tiên ghi nhận bệnh kham lá xuất hiện vào tháng 6/2017 đã được xác định là do Sri Lanka Cassava Mosaic Virus (SLCMV) gây ra.

Năm 2019, phát hiện thêm 2 dòng virus gây bệnh khám có nguồn gốc từ Châu Phi là African Cassava Mosaic Virus ( ACMV) và East African Cassava Mosaic Virus ( EACMV) đều xuất hiện trên các giống khoai mì trên địa bàn (Lê Đức Hưng & ctv,2019). Nghiên cứu này nhằm xác định lại các giống khoai mì bị nhiễm các chủng virus ACMV, EACMV và SLCMV trên địa bàn tinh Tây Ninh bằng phương pháp Multiplex PCR và đánh giá hiện trạng, triệu chứng và mức độ nhiễm của các giống nay. Mục tiêu Dùng phương pháp Multiplex PCR để chuẩn đoán và đánh giá hiện trạng nhiễm Virus gây bệnh kham lá trên các giống khoai mì tại Tay Ninh phục vụ cho công tác kiểm soát nguồn giống sạch bệnh Virus đáp ứng cho nhu cầu canh tác của người dân trồng khoai mì. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Thu thập mẫu và mô tả triệu chứng bệnh khảm lá trên các giống khoai mì trên địa bàn tỉnh Tây Ninh Nội dung 2: Sử dụng phương pháp Multiplex PCR chuẩn đoán, phát hiện virus gây bệnh kham lá khoai mì trên các giống.

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU 2.1 Sơ lược về cây Khoai Mì 2.1 Nguồn gốc và phân bố Khoai mì ( Manihot esculenta Crantz ) còn được gọi là Tapioca ở Châu A, Manioc ở Châu Phi, và ở Châu Mỹ Latinh thường là Manioca, Yucca và Mandioca. Có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Là một loại cây bụi thân gỗ lâu năm thuộc họ Euphorbiaceae (họ cây đỉnh lăng) đã được trồng phố biến như một loại cây hàng năm ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới vì củ có nhiều tinh bột ăn được. Chi Manihot có khoảng 100 loài và Khoai mì ( Cassava) là loài duy nhất được trồng thương mai.

Các loài cây hoang đã của phân loài M. esculenta flabellifolia được coi là tổ tiên của khoai mì thuần hóa cách đây hơn 10 000 năm, tập trung ở phía tây trung tâm Brazil. Việc trồng khoai mì có lẽ bắt đầu từ phần Đông Bắc của Brazil, Paraguay đến México từ hơn 4000 năm trước. Sau đó cây Khoai mì được các thương nhân Bồ Dao Nha đem về bờ biển phía tây của châu Phi vào năm 1588 sau khi khám phá ra luc địa châu Mỹ và được trồng ở Vịnh Guinea và Congo đầu tiên.

Vào khoảng năm 1750, trồng khoai mì được phổ biến đến Madagascar và bờ biển phía đông của Châu Phi. Và giữa thé ky XIX, Khoai mì ngày càng trở nên quan trọng như nguồn thực chính và được trồng rộng rãi ở Châu Phi. Vào cuối thé ky XVIIL, sắn đã được phô biến rộng rãi ở châu A và được trồng ở Indonesia, Sri Lanka, Malaysia và các nước khác thuộc khu vực nhiệt đới va cận nhiệt đới châu Á. Diện tích canh tác toàn cầu là khoảng 19 triệu ha, 55% ở Châu Phi, 27% ở Châu Á và 18% ở Châu Mỹ Latinh (FAO 2012).

Cây khoai mì được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVUI (Pham Văn Biên, Hoàng Kim, 1995).2 Tên khoa học và phân loại Tên khoa học: Manihot esculenta Crantz Phân loại khoa học: - Giới (Plantea) - Bộ (Malpighiales) - Họ (Euphorbiaceae) - Phân họ (Crotonoideae) - Tông (Manihoteae) - Chi (Manihot) - Loài (M esculenta). Chi Manihot thuộc ho Euphorbiaceae, có tới hơn 300 chi và 8000 loài hau hết là cây nhiệt đới. Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae. Tất cả các loài trong chi đều có số lượng nhiễm sắc thé 2n= 36.3 Đặc điểm hình thái Hình 2.

1 Các bộ phận chính của cây khoai mi a) Rễ; b) Thân cây; c)Lá; d) Hat 2.1 Rễ củ Gồm có 1 rễ cọc cắm thắng đứng xuống đất và các rễ phụ lúc đầu phát triển theo chiều ngang sau đó cũng phát triển theo phương thắng đứng. Cả 2 loại rễ cọc và rễ phụ đều có thé phát triển thành củ. Rễ củ là do rễ con được tập trung đinh dưỡng hình thành. Khi cây sắn bắt đầu ra rễ, số lượng rễ con rất nhiều.

Khi cây trưởng thành chỉ một số rễ được tích lũy đầy đủ tinh bột mới phát triển thành củ thu hoạch. Củ sắn lớn có dạng hình trụ hoặc hình thoi có kích thước từ 2 — 15 em (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).2 Thân Thuộc loại thân gỗ. Cây cao trung bình từ 1 — 3 m. Chiều cao cây phụ thuộc vao giống và điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng.

Cây khoai mì có khả năng phân cành, có 1 số giống không phân cành. Sự phân cành có liên quan đến khả năng ra hoa. Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám nâu hoặc hơi vàng ( Trần Ngọc Ngoạn, 2007).3 Lá Là loại lá đơn có chia thùy mọc xen kẽ trên thân và xếp theo vòng (cứ 5 lá một vòng). Lá khoai mì gôm 2 phân : cuôn lá và phiên lá.

Cuống lá: cuống lá dai từ 3 đến 30cm và có các màu sắc khác nhau tùy theo giống (màu hồng, vàng, xanh vàng, đỏ tươi). Phiến lá: phiến lá thường có 5-7 thùy, nhưng cũng có khi không chia thùy. Phiến lá mảnh, dạng màng, màu xanh lục, phía dưới có phấn. Ở những cây mọc từ hạt, phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chia không đều.

Các cây mọc từ hom từ chỗ phân cành trở lên số thùy ở phiến lá có thé giảm đi (Trần Ngọc Ngoan, 2007).4 Quả và hạt Quả sắn thuộc loại quả nang mở khi chín, đường kính 1,0-1,5em có 3 6, mỗi 6 thường có 1 hạt. Quả có khi nhẫn nhưng thường có 6 cánh, hình thành từ những cánh của bầu hoa. Màu sắc từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Vỏ quả có 3 lớp: vỏ quả ngoài, vỏ quả giữa, vỏ quả trong.

Hạt hình quả trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác, hạt có vân hoặc những vết nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).4 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng Cây san có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. San là nguồn lương thực cho con người và là thức ăn cho gia súc trong chăn nuôi. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thé sử dụng vào các mục đích kinh tế. Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có ty lệ chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi.

Tuy nhiên sắn có tỷ lệ protein và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực cần chú ý b6 sung thêm thức ăn giàu đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể. Củ khoai mì tươi có tỷ lệ chất khô 38 - 40%, tinh bột 16 - 32%, giau vitamin C, calcium, vitamin B va các chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm. Trong củ khoai mì, hàm lượng các acid amin không được cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu các acid amin chứa lưu huỳnh. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tuỳ giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích.

Lá khoai mì có hàm lượng đạm khá cao, nhiều chất bột, chất khoáng và vitamin. Chất đạm của lá khoai mì có khá đầy đủ các acid amin cần thiết, giàu lysin nhưng thiếu methionin. Trong lá khoai mì ngoài các chất dinh dưỡng, cũng chứa một lượng độc tố axid cyanhydric (HCN) đáng kể. Các giống khoai mì ngọt có 80 - 110 mg HCN/Ikg lá tươi.

Các giống khoai mì đắng chứa 160 - 240 mg HCN/1kg lá tươi (Nguyễn Thị Minh Lệ, 2020).5 Tình hình sản xuất Khoai mì trên thế giới và Việt Nam 2.1 Tình hình sản xuất Khoai mì trên thế giới Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và là nguồn thực phẩm của hơn 500 triệu người. Năm 2006 và 2007, sản lượng sắn thế giới đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với 2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tan. Nước có sản lượng sắn nhiều nhất là Nigeria (45,72 triệu tan), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tan) và Indonesia (19,92 triệu tấn).