Đặt vấn đề Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương”. Đến đời Minh (năm 1590) trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu.
Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với nhũng bệnh về tim mạch, phổi, gan… Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi…Chính vì thế, việc nghiên cứu, phân tích, phát triển và sử dụng nấm linh chi vẫn đang được chú trọng. Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh trong nước và trên thế giới ngày càng tăng. Nhiều trung tâm và các cơ sở đã tiến hành nuôi trồng chế biến, nghiên cứu và phân tích các chất có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, Steroid, Alkaloid, Protein, Polysaccharide….
Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm linh chi phần lớn thuộc nhóm Triterpenoid. Việt Nam với vị trí địa lý tự nhiên nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Điều kiện thiên nhiên rất thuận lợi cho phát triển của các loại nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng. Tại núi Lang Biang – Đà Lạt chúng tôi cũng phát hiện nấm Linh chi mọc hoang (tạm gọi là Linh chi Lang Biang).
Do đó, chúng tôi quyết định phân lập và khảo sát các chỉ tiêu sinh hóa của loại nấm Linh chi Lang Biang. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh học trường Đại học Tôn Đức Thắng và sự hướng dẫn của TS.Trần Thị Dung, 1 chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học của một loại nấm Linh chi thu hái tại Lang Biang – Đà Lạt”. Mục tiêu đề tài ě Phân lập và bảo quản giống nấm Linh chi Lang Biang ở điều kiện phòng thí nghiệm. ě Tiến hành những thử nghiệm hóa sinh để định tính các chất như Alkaloid, acid hữu cơ, Saponin, Triterpenoid, Polysaccharid trong nấm Linh chi Lang Biang.
ě So sánh thành phần hóa học của các nấm Linh chi tự nhiên Lang Biang, Linh chi tự nhiên Đồng Tháp và Linh chi đỏ đang được sử dụng trên thị trường. Yêu cầu đề tài ě Quan sát hình thái hệ sợi và quả thể nấm Linh chi Lang Biang. ě Định tính thành phần các chất như Alkaloid, acid hữu cơ, Saponin, Triterpenoid trong nấm Linh chi tự nhiên Lang Biang. ě Định lượng Polysaccharid trong nấm Linh chi tự nhiên Lang Biang.
2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Khái quát về nấm Theo khái niệm cũ, nấm là thực vật, như các loại cây cỏ khác, nhưng là thực vật không có sắc tố xanh (diệp lục tố). Tuy nhiên những nghiên cứu ngày càng nhiều trên sinh lý và biến dưỡng cho thấy nấm có nhiều điểm khác với thực vật [8]: không có lục lạp, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát triển chung như thực vật. Nấm chỉ có thể hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm.
Chính vì thế, tất cả hệ thống phân loại sinh giới hiện nay đều coi nấm là một giới riêng, tương đương với giới thực vật và động vật. – Giới khởi sinh (Monera): gồm vi khuẩn và tảo lam. – Giới nguyên sinh (Protista): gồm một số tảo đơn bào, nấm đơn bào có khả năng. di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật nguyên sinh.
– Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia). – Giới động vật (Animalia).Takhtadjan (1973) đưa ra hệ thống phân loại như sau: – Giới Mycota: gồm vi khuẩn và vi khuẩn lam. – Giới thực vật. – Giới động vật.
Woese (1980) căn cứ vào trật tự nucleotid trong acid ribonucleid (ARN) của ribosome 16S và 5S để tách vi khuẩn ra làm hai giới. – Giới vi khuẩn thật (Eubacteria). – Giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria). Ông đã gộp nấm, thực vật, động vật thành một giới chung gọi là sinh vật có nhân thật (Eukaryota).
3 Hiện nay, các nghiên cứu về nấm thường dựa vào hệ thống phân loại của R.Whitaker (1969) và hệ thống phân loại của A. – Ngành nấm nhầy (Exomycotina): loài nấm này có cả hai tính chất động vật và thực vật, chúng sinh sản bằng bào tử, nhưng tế bào lại là khối sinh chất không có vách ngăn bao bọc, di chuyển và nuốt thức ăn như động vật (amib). – Ngành nấm thật (Eumycotina): chiếm số lượng lớn, bao gồm các tế bào với nhân tương đối hoàn chỉnh. Tế bào nấm có vách bao bọc như tế bào thực vật, đa số cấu tạo bởi chitin.
Nhiều tế bào nấm còn tích trữ đường ở dạng glycogen, giống như động vật. Một số loài sinh sản theo lối tạo những giao tử có lông roi để di động (động bào tử), nhưng hợp tử lại phát triển theo một kiểu chung của nấm. - Lớp phụ Zygomycetes (Nấm tiếp hợp). Thường gặp ở những nấm lớn có tai nấm (nấm rơm, nấm hương…) – Lớp Deuteromyceter (Lớp nấm bất toàn – Fungi imperfect): không có khả năng sinh sản hữu tính.
Hình thái học của nấm 2. Hình thái học sợi nấm Tuyệt đại đa số nấm được cấu tạo bởi những sợi nấm (hyphae). Sợi nấm có dạng ống, chứa đầy tế bào chất và dịch bào. Sợi nấm có hai loại, một loại không có vách ngăn, nhiều nhân, một loại có vách ngăn, trên màng vách ngăn có lỗ thông để truyền thông tin và trao đổi chất.
Vách tế bào chủ yếu được cấu tạo bởi kitin – 4 glucan. Sợi nấm có thể có thể phát triển từ bào tử hay từ một đoạn sợi nấm và có đặc điểm sinh trưởng về phía ngọn, phân nhánh. Sợi nấm trong nhiều năm có thể tiếp xúc với nhau hình thành một khối gọi là thể sợi nấm. Đối với nấm đảm thì sự hình thành sợi nấm trải qua 3 giai đoạn: ě Sợi nấm sơ sinh: sau khi bào tử nảy mầm, hình thành ống mầm rồi phân nhánh thành sợi nấm.
Những sợi nấm này thường không có vách ngăn hoặc có vách ngăn nhưng đều là một nhân. ě Sợi nấm song nhân: do thể sợi nấm cùng nhân hay khác nhân kết hợp với nhau tạo nên sợi nấm có vách ngăn nhiều tế bào, mỗi tế bào chứa hai nhân còn gọi là sợi nấm song nhân (dicaryolic hyphae). ě Sợi nấm thứ sinh: những sợi nấm này phân hóa và kết thành quả thể gồm tán nấm, cuống nấm, mô nấm.[6,11, 12] Đối với nấm túi: sợi nấm song nhân chỉ sinh ra trước khi hình thành túi. Sự hình thành quả thể ở nấm túi là sự phối hợp giữa sợi nấm cấp một và sợi nấm song nhân.
Một số loại nấm có hình thái liên hợp dạng móc (clamp connection), tế bào đỉnh sợi nấm (2 nhân) mọc ra một mấu nhỏ, một trong hai nhân chui vào mấu này. Mỗi nhân phân cắt thành hai, hai thành bốn nhân, hai nhân giữ lại đỉnh tế bào, một nhân chui vào mấu, một nhân nằm ở gốc tế bào. Tế bào đỉnh ban đầu xuất hiện hai vách ngăn, chia thành ba tế bào. Sau đó vách ngăn giữa mấu và tế bào gốc bị khai thông, tế bào gốc tiếp nhận nhân từ mấu chuyển xuống và trở thành tế bào song nhân.
Như vậy từ một tế bào song nhân trở thành hai tế bào song nhân và giữa hai tế bào còn lưu lại một cái móc. Hình thái thể quả Tản hay cơ thể của nấm là những tế bào đơn hay dạng sợi kéo dài. Phần lớn các sợi phân nhánh. Khi các sợi nấm bện lại với nhau tạo thành thể sinh bào tử, gọi là quả thể hay tai nấm.
Đặc trưng của nấm lớn là có cơ quan sinh sản bào tử kích thước lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, do sự kết bện của sợi nấm khi gặp điều kiện thuận lợi. Thường có hai kiểu quả thể trong nhóm nấm lớn: – Kiểu 1: bào tử thường được sinh ra trong những thể hình cầu, như những nấm thuộc Gasteromycetes. 5 – Kiểu 2: bào tử sinh ra ở một phần của quả thể nấm. Những nấm này thuộc Basidiomycetes.
Có thể bào tử ở phần phiến hay không thuộc phiến (Aphyllophorales). Ở nhóm này ta thường gặp hai kiểu quả thể như sau: Quả thể lật ngược, phiến ở phía trên hay không có phiến, thường không có hình dạng nhất định. Chúng rất mỏng, đôi khi dày nhất đạt 2 mm. Quả thể thẳng đứng, gặp ở nhóm Basibiomyceteses hay Discomycetes.
Các sợi nấm phủ lên nhau ở mặt ngoài hay chỉ một phần bên trên. Những kiểu này quả thể rất khác nhau ở các phần chân nấm, mũ nấm, phiến nấm. Các giai đoạn phát triển của nấm [2] 2. Giai đoạn tăng trưởng Giai đoạn này thường dài, nấm ở giai đoạn này chủ yếu là dạng sợi.
Sợi nấm (hypha) mỏng manh và gồm hai nhân, có nguồn gốc từ hai bào tử khác nhau nẩy mầm và phối hợp lại. Hệ sợi nấm (mycelium), còn gọi là hệ sợi dinh dưỡng (vegetative mycelium), len lỏi trong cơ chất để rút lấy thức ăn thông qua màng tế bào. Khi khối sợi đạt đến mức độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, chúng sẽ bện kết lại tạo thành quả thể nấm. Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành các bào tử tiềm sinh hay hậu bào tử (chlamydospore).
Giai đoạn phát triển Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình thành 1 dạng đặc biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm (fruit body). Quả thể thường có kích thước lớn và là cơ quan sinh sản của nấm. Trên quả thể có 1 cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn sợi nấm, đó là thụ tầng (hymenium). Chính ở đây 2 nhân của tế bào sẽ nhập lại thành 1.
Sau đó sẽ chia thành 4 nhân con hình thành các bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào tử (basidiospore) hoặc nang bào tử (ascospore). Khi tai nấm trưởng thành, bào tử được phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục.