ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ Chức Nghiên Cứu Thế Giới Về Ung Thư (IARC) và Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) khẳng định Human Papilloma Virus (HPV) là nguyên nhân chính gây ung thư cổ tử cung. DNA của HPV được tìm thấy 99,7% trong các ca ung thư cổ tử cung. Năm 2008, thế giới có khoảng 530000 người được xác định mắc ung thư cổ tử cung và có khoảng 275000 người đã tử vong chiếm tỉ lệ 52 %. Trong số bệnh nhân tử vong, khoảng 88 % xảy ra ở các nước đang phát triển: 53000 ở châu Phi, 31700 ở Mỹ Latinh và vùng Caribê, cao nhất là ở châu Á với 159800 trường hợp (Globocan, 2008).
Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ cao trong tất cả các loại ung thư ở phụ nữ và có xu hướng ngày càng tăng, kết quả thống kê của IARC cho thấy rằng có 2472 ca tử vong trong số 5174 trường hợp được chẩn đoán ung thư cổ tử cung mỗi năm [1]. Hiện nay, phương pháp chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phát hiện virus xâm nhiễm và xét nghiệm Pap. Phương pháp phát hiện virus xâm nhiễm có độ nhạy cao lên đến 95% nhưng không xác định được tình trạng mô học hiện tại của cổ tử cung là có bị ung thư không. Xét nghiệm Pap có độ nhạy 55%, tỉ lệ âm tính giả cao.
Việc kết hợp cả hai phương pháp này đang được thực hiện nhằm mang lại hiệu quả cao hơn trong chẩn đoán và điều trị. Tuy nhiên, với điều kiện nước ta hiện nay, việc tầm soát bệnh vẫn còn gặp nhiều khó khăn, phần lớn bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn cuối, chỉ vài năm trước khi qua đời. Vì vậy, việc tìm ra một biomarker - dấu chuẩn sinh học đặc trưng cho ung thư cổ tử cung nhằm chẩn đoán sớm, tiên đoán cũng như theo dõi tiến trình gây bệnh để có phương pháp điều trị thích hợp, tránh tình trạng tử vong cao như hiện nay là việc làm cấp thiết. Thời gian gần đây, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh được mối liên hệ giữa biến đổi Epigenetic với tiến trình bệnh ung thư.
SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 2 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp Epigenetic là hiện tượng thay đổi cấu trúc DNA có thể di truyền được mà không có sự thay đổi trình tự base trên DNA [2]. Methyl hóa là một trong những sự kiện thuộc biến đổi Epigenetic và methyl hóa bất thường thường xuyên được tìm thấy trong hầu hết các loại ung thư. Methyl hóa bất thường xảy ra trên toàn bộ gen, trong đó các gen được xác định bị biến đổi trong tế bào ung thư bao gồm: gen ức chế khối u (tumor suppressor genes), gen gây ung thư (oncogenes), gen điều hòa chu trình tế bào (cell cycle regulation), gen tham gia chu trình chết tế bào (apoptosis).
Các nghiên cứu hiện nay tập trung chủ yếu vào việc tìm ra biomarker dựa vào sự kiện methyl hóa bất thường diễn trên các gen nói trên nhằm nhanh chóng tìm ra dấu hiệu đặc trưng của bệnh và có phương pháp điều trị hợp lí. [2, 3] p16 là gen ức chế khối u có vai trò quan trọng tại điểm kiểm soát G1/S trong chu trình tế bào. Sự methyl hóa bất thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter gen p16 là cơ chế chính dẫn đến sự mất biểu hiện của gen có liên quan tới các trường hợp ung thư ở người đã được báo cáo trong thời gian gần đây. Chúng tôi dùng phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) - một trong những phương pháp đánh giá mức độ methyl hóa DNA phổ biến hiện nay, là kỹ thuật PCR đặc biệt dùng cho việc xác định nhanh chóng tình trạng methyl hóa các vùng đảo CpG trên DNA [4].
Phương pháp này cũng được sử dụng bởi phần lớn các tài liệu nghiên cứu mà chúng tôi thu thập được. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát mức độ methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16 trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung” nằm trong đề tài nghiên cứu lớn của nhóm với các mục tiêu sau: - Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của gen p16 và mối tương quan về sự methyl hóa trên gen này với ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng. SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 3 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp - Thiết kế được các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen p16 trong phản ứng MSP.
Từ đó có thể sử dụng các cặp mồi này để đánh giá mức độ methyl hóa gen p16 trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung thu nhận tại khu vực miền Nam, Việt Nam. - Cung cấp thêm thông tin góp phần cho một đề tài nghiên cứu lớn hơn nhằm xây dựng một hệ thống các gen có sự methyl hóa bất thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự phát sinh và phát triển ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng, từ đó có thể chẩn đoán sớm và hỗ trợ cho quá trình điều trị ung thư. SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 4 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I.1/ Sơ lược về ung thư cổ tử cung: I.1/ Tác nhân gây bệnh: Những nguy cơ có thể gây ung thư cổ tử cung như: quan hệ tình dục sớm hoặc quan hệ với nhiều người, yếu tố nguy cơ tăng thêm nếu bạn tình cũng có quan hệ tình dục với nhiều người khác; sinh đẻ nhiều (từ trên bốn lần); hút thuốc lá; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục; suy giảm hệ thống miễn dịch, rối loạn nội tiết (mắc bệnh HIV/AIDS, viêm gan, tiểu đường…); các yếu tố khác như nghèo nàn, lạc hậu, vệ sinh kém; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục, đặc biệt là viêm sinh dục do nhiễm các vi sinh vật như: Human Papilloma Virus (HPV), Trichomonas, Chlamydiae trachomatis, Herpes simplex virus type 2 (HSV2).
Trong đó, nhiễm HPV là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến. Biểu hiện lâm sàng là hình ảnh u sùi điển hình vùng hậu môn - sinh dục như âm hộ, âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật, vùng hầu họng và ung thư cổ tử cung. Tháng 10/1999, hội thảo do IARC và WHO khẳng định HPV là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành và phát triển ung thư cổ tử cung. HPV có nhân DNA sợi đôi thuộc họ Papillomaviridae, trọng lượng phân tử 8kb, là một trong những tác nhân lây nhiễm qua da, niêm mạc và phổ biến nhất là lây nhiễm qua đường tình dục.
Có trên 100 type HPV khác nhau, trong đó có khoảng 40% tác động lên đường sinh dục và 15% có nguy cơ gây ung thư cổ tử cung. Dựa vào tính gây ung thư, HPV được chia làm hai nhóm: [5] SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 5 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp ✔ Nhóm nguy cơ thấp: hiếm gặp trong các trường hợp ung thư gồm các type: HPV-6, 11, 42, 43, 44 .gây ra các nhiễm trùng nhẹ như mụn cóc ở da, bộ phận sinh dục, niêm mạc miệng. ✔ Nhóm nguy cơ cao: liên quan trực tiếp đến bệnh lý ung thư, bao gồm các type: HPV-16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66, 68.
Trong đó, HPV-16 và HPV-18 là hai type được xác định có nguy cơ cao nhất gây ung thư cổ tử cung (chiếm hơn 70%). Cơ chế phân biệt nhóm nguy cơ thấp và cao vẫn chưa được rõ ràng. Tuy nhiên, ghi nhận nhóm nguy cơ cao thường gây tình trạng nhiễm virus kéo dài hơn nhóm nguy cơ thấp (thời gian hiện diện virus tại mô cổ tử cung dài hơn). Người ta nghĩ rằng có thể trong nhóm nguy cơ cao, các gen gây ung thư có hoạt tính mạnh hơn và khả năng lây lan cao hơn nhóm nguy cơ thấp.1: Hình ảnh tổng thể (a) và cấu trúc (b) của HPV-16 SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 6 GVHD:TS.
LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp I.2/ Cơ chế gây bệnh của HPV: HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp hai loại mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa). Biểu mô lát tầng không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quy định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó bong ra ngoài. Virus sẽ tấn công vào lớp tế bào đáy của biểu mô vốn có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của một rồi tiến tới nhiều lớp tế bào sau đó. Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp tế bào biểu mô lát gây hiện tượng dị sản còn gọi là ung thư tại chỗ, có khả năng phát triển lan rộng đến các lớp tế bào biểu mô lát khác gây dị sản nặng lan ra khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung xâm lấn.
Tuy nhiên, những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra ở tế bào biểu mô lát vốn không tiếp xúc với mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên. [6] HPV hoạt động chủ yếu nhờ các oncogene E6 và E7, sau khi HPV xâm nhập vào tế bào, E6 và E7 xác nhập vào bộ gen tế bào kí chủ và điều khiển tổng hợp protein E6, E7 gây bất lợi cho tế bào kí chủ. E6 gắn lên p53 - protein 53 có vai trò ức chế khối u, có thể đồng thời tham gia vào ba quá trình: (1) thúc đẩy sự phiên mã của các gen đích làm dừng chu trình tế bào ở các điểm kiểm soát G1/S và G2/M , (2) kích hoạt hệ thống sửa chữa DNA hư hỏng, (3) hoạt hóa một số gen đích mà sản phẩm của chúng dẫn tới con đường apoptosis. Việc E6 có thể gắn lên p53 gây mất kiểm soát chu trình tế bào, ngăn chặn con đường apoptosis dẫn tới tế bào được tái tạo liên tục và mang theo những DNA hư hỏng.
Trong khi đó, E7 gắn lên pRb (protein Retinoplastoma - điều hòa tăng trưởng tế bào) gây thoái hóa phức hợp pRb- SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 7 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp E2F dẫn tới E2F được tự do hoạt hóa phiên mã, tế bào với bộ gen đã bị biến đổi tăng sinh một cách liên tục và tiến triển thành ung thư.