Khảo sát mức độ methyl hóa các đảo cpg thuộc vùng promoter của gen p16 trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung

Khảo sát mức độ methyl hóa các đảo CpG trong vùng promoter gen p16 ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung, cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu.

• Tác giả: Lê Thị Đang Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Mức Độ Methyl Hóa Các Đảo CpG Thuộc Vùng Promoter Của Gen p16 Trên Bệnh Nhân Ung Thư Cổ Tử Cung
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 1. PHẦN I
• 1.1. Sơ lược về ung thư cổ tử cung
• 1.1.1. Tác nhân gây bệnh
• 1.1.2. Cơ chế gây bệnh của HPV
• 1.1.3. Các phương pháp phòng ngừa, chẩn đoán, điều trị bệnh hiện nay
• 1.1.3.1. Vaccine phòng ngừa
• 1.1.3.2. Phương pháp chẩn đoán

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khảo Sát Mức Độ Methyl Hóa DNA

Khảo sát mức độ methyl hóa DNA là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong sinh học phân tử, đặc biệt trong việc hiểu rõ cơ chế gây bệnh của ung thư. Nghiên cứu này tập trung vào các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16, một gen ức chế khối u quan trọng. Sự methyl hóa bất thường của gen này có thể dẫn đến mất biểu hiện gen, từ đó góp phần vào sự phát triển của ung thư cổ tử cung. Việc hiểu rõ mức độ methyl hóa có thể giúp phát hiện sớm và điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Mục Đích Nghiên Cứu Mức Độ Methyl Hóa

Mục đích chính của nghiên cứu là xác định mức độ methyl hóa của các đảo CpG trong gen p16 ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Điều này giúp làm rõ mối liên hệ giữa sự methyl hóa và sự phát triển của bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Gen p16 Trong Ung Thư

Gen p16 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào. Sự methyl hóa bất thường của gen này có thể dẫn đến sự mất kiểm soát trong chu trình tế bào, từ đó thúc đẩy sự phát triển của ung thư.

II. Vấn Đề Methyl Hóa DNA Trong Ung Thư Cổ Tử Cung

Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính trong biến đổi epigenetic. Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự DNA. Trong trường hợp của ung thư cổ tử cung, sự methyl hóa bất thường thường xảy ra tại các đảo CpG trong vùng promoter của gen p16, dẫn đến mất biểu hiện gen. Điều này gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

2.1. Nguyên Nhân Gây Methyl Hóa Bất Thường

Nhiều yếu tố có thể dẫn đến methyl hóa bất thường, bao gồm nhiễm virus HPV, chế độ ăn uống không lành mạnh và các yếu tố môi trường. Những yếu tố này có thể làm tăng nguy cơ phát triển ung thư cổ tử cung.

2.2. Hệ Quả Của Methyl Hóa Đối Với Gen p16

Sự methyl hóa gen p16 dẫn đến mất khả năng ức chế khối u, tạo điều kiện cho tế bào ung thư phát triển. Điều này làm tăng nguy cơ mắc bệnh và giảm khả năng điều trị thành công.

III. Phương Pháp Khảo Sát Mức Độ Methyl Hóa DNA

Nghiên cứu sử dụng phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) để xác định mức độ methyl hóa của các đảo CpG trong gen p16. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác tình trạng methyl hóa của DNA. Việc áp dụng MSP trong nghiên cứu này giúp cung cấp dữ liệu quan trọng về mức độ methyl hóa ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung.

3.1. Quy Trình Thực Hiện MSP

Quy trình thực hiện MSP bao gồm các bước chuẩn bị mẫu DNA, xử lý bisulfite và khuếch đại bằng PCR. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Đánh Giá Kết Quả MSP

Kết quả từ MSP sẽ được phân tích để xác định mức độ methyl hóa của các đảo CpG trong gen p16. Việc đánh giá này giúp xác định mối liên hệ giữa methyl hóa và sự phát triển của ung thư cổ tử cung.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Methyl Hóa Gen p16

Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ methyl hóa của gen p16 ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy sự methyl hóa bất thường có thể là một chỉ số quan trọng trong việc chẩn đoán và theo dõi bệnh. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng mức độ methyl hóa có thể liên quan đến giai đoạn bệnh và tiên lượng điều trị.

4.1. So Sánh Mức Độ Methyl Hóa Giữa Các Nhóm

Mức độ methyl hóa được so sánh giữa nhóm bệnh nhân ung thư và nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt, cho thấy methyl hóa có thể là một biomarker tiềm năng cho ung thư cổ tử cung.

4.2. Mối Liên Hệ Giữa Methyl Hóa và Giai Đoạn Bệnh

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng mức độ methyl hóa có thể tăng theo giai đoạn bệnh. Điều này cho thấy methyl hóa không chỉ là một dấu hiệu mà còn có thể ảnh hưởng đến tiến trình phát triển của bệnh.

V. Kết Luận Về Mức Độ Methyl Hóa Gen p16

Nghiên cứu về mức độ methyl hóa của gen p16 trong ung thư cổ tử cung đã chỉ ra rằng methyl hóa có thể là một chỉ số quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc hiểu rõ cơ chế methyl hóa có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới và cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân. Tương lai của nghiên cứu này có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị ung thư.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Methyl Hóa

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các biomarker dựa trên methyl hóa để cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị ung thư cổ tử cung.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong thực tiễn để phát triển các phương pháp tầm soát và điều trị ung thư cổ tử cung hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu và gây tử vong cao ở phụ nữ trên quy mô toàn cầu. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nghiên cứu Thế giới về Ung thư (IARC) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Human Papilloma Virus (HPV) là tác nhân chính dẫn đến sự hình thành và phát triển của căn bệnh này, với DNA của virus được phát hiện trong 99,7% các trường hợp ung thư cổ tử cung. Theo số liệu của Globocan năm 2008, toàn cầu có khoảng 530.000 ca mắc mới và 275.000 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 52%. Đáng chú ý, khoảng 88% số ca tử vong tập trung tại các quốc gia đang phát triển, trong đó châu Á chiếm cao nhất với 159.800 trường hợp, châu Phi 53.000 trường hợp, và khu vực Mỹ Latinh cùng Caribê ghi nhận 31.700 trường hợp. Tại Việt Nam, thống kê của IARC cho thấy căn bệnh này có xu hướng ngày càng gia tăng, gây ra 2.472 ca tử vong trong tổng số 5.174 trường hợp được chẩn đoán mỗi năm.

Về mặt lâm sàng, các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán hiện hành tồn tại những giới hạn kỹ thuật nhất định. Phương pháp phát hiện virus HPV có độ nhạy đạt 95% nhưng không phản ánh được tình trạng mô học thực tế của cổ tử cung. Ngược lại, xét nghiệm tế bào học phết cổ tử cung (Pap smear) có độ nhạy trung bình chỉ đạt khoảng 55% cùng tỷ lệ âm tính giả cao do ảnh hưởng của dịch nhầy, hồng cầu, mủ và kỹ thuật dàn trải tế bào. Thực tế tại Việt Nam cho thấy đa số bệnh nhân chỉ được phát hiện ở giai đoạn muộn, làm giảm đáng kể hiệu quả điều trị. Do đó, việc nghiên cứu các dấu chuẩn sinh học (biomarker) ở mức độ phân tử, cụ thể là các biến đổi biểu sinh (epigenetic) như sự methyl hóa bất thường tại vùng promoter của các gen ức chế khối u, đóng vai trò cấp thiết nhằm phục vụ chẩn đoán sớm và theo dõi tiến trình bệnh.

Khóa luận tốt nghiệp được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:

1. Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của gen p16 và mối tương quan về sự methyl hóa trên gen này với ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng.
2. Thiết kế được các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen p16 trong phản ứng MSP (Methylation Specific PCR). Từ đó có thể sử dụng các cặp mồi này để đánh giá mức độ methyl hóa gen p16 trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung thu nhận tại khu vực miền Nam, Việt Nam.
3. Cung cấp thêm thông tin góp phần cho một đề tài nghiên cứu lớn hơn nhằm xây dựng một hệ thống các gen có sự methyl hóa bất thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự phát sinh và phát triển ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng, từ đó có thể chẩn đoán sớm và hỗ trợ cho quá trình điều trị ung thư.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Tình trạng methyl hóa các đảo CpG tại vùng promoter kéo dài đến exon 1α của gen ức chế khối u p16 (CDKN2A); các cặp mồi đặc hiệu methyl hóa (p16-M) và không methyl hóa (p16-U); các mẫu DNA đối chứng và DNA tách chiết từ bệnh phẩm người nhiễm HPV nguy cơ cao.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh, phối hợp phân tích kiểm tra mồi tại Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á trên các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân tại khu vực miền Nam, Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài hoàn thành và báo cáo vào tháng 08 năm 2011.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

Đề tài dựa trên các nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và y sinh học thực nghiệm:

• Cơ chế bệnh sinh của HPV: Phân loại hơn 100 type HPV thành nhóm nguy cơ thấp (HPV-6, 11, 42, 43, 44) và nhóm nguy cơ cao (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66, 68), trong đó type 16 và 18 chiếm trên 70% trường hợp ung thư cổ tử cung. Quá trình xâm nhiễm của virus tại vùng tiếp giáp biểu mô lát tầng và trụ tuyến, biểu hiện các oncogene E6 và E7. Protein E6 gắn kết và bất hoạt p53 (gây rối loạn điểm kiểm soát G1/S, G2/M và chặn apoptosis); protein E7 liên kết với pRb, giải phóng yếu tố phiên mã E2F thúc đẩy chu trình tế bào tăng sinh mất kiểm soát.
• Cơ chế biểu sinh (Epigenetics): Sự biến đổi cấu trúc DNA có thể di truyền mà không làm biến đổi trình tự nucleotide. Trọng tâm là sự methyl hóa DNA tại vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc dinucleotide CpG tạo thành 5-Methylcytosine dưới xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMT3a, DNMT3b thực hiện de novo; DNMT1 duy trì). Cơ chế ức chế phiên mã do methyl hóa vùng promoter diễn ra trực tiếp qua việc ngăn cản liên kết của yếu tố phiên mã (như AP-2) hoặc gián tiếp qua protein gắn methyl MeCP2 huy động enzyme histone deacetylase (HDAC), biến đổi cấu trúc chromatin từ trạng thái hoạt động sang đóng xoắn bất hoạt.
• Cấu trúc và chức năng gen p16 (CDKN2A): Nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 9 (locus 9p21), mã hóa cho p16INK4a và p14ARF. Protein p16 ức chế các kinase phụ thuộc cyclin CDK4 và CDK6, ngăn cản tạo phức hợp với Cyclin D1, duy trì pRb ở trạng thái khử phosphoryl hóa để giữ E2F, làm ngừng chu trình tế bào tại điểm kiểm soát G1/S để tế bào sửa chữa DNA hư hỏng. Hiện tượng tăng methyl hóa (hypermethylation) promoter gen p16 làm câm lặng phiên mã, là sự kiện sớm trong tiến trình ác tính hóa.
• Nguyên lý kỹ thuật MSP (Methylation Specific PCR): Dựa trên phản ứng biến đổi hóa học bằng natri bisulfite (NaHSO3), chuyển toàn bộ Cytosine không methyl hóa thành Uracil (sau đó thành Thymine qua PCR), trong khi 5-Methylcytosine được giữ nguyên. Phản ứng khuếch đại tiếp theo sử dụng hai cặp mồi chuyên biệt cho trạng thái methyl hóa (M) và không methyl hóa (U), đạt độ nhạy phát hiện đến 0,1% alen methyl hóa.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế kết hợp phân tích tin sinh học (in silico) và khảo nghiệm thực nghiệm:

• Khai thác dữ liệu y văn: Thu thập và tổng hợp 10 bài báo khoa học quốc tế liên quan đến methyl hóa promoter p16 trong ung thư cổ tử cung từ cơ sở dữ liệu PubMed (NCBI) để phân tích tần số methyl hóa, so sánh các kỹ thuật và các dạng mẫu mô.
• Khảo sát in silico: Sử dụng công cụ MethPrimer để xác định các đảo CpG thuộc promoter kéo dài đến exon 1α của gen p16 và mô phỏng biến đổi bisulfite; sử dụng TFSEARCH để định vị các vị trí bám của yếu tố phiên mã; sử dụng phần mềm Annhyb-4, MethBlast và các công cụ từ IDT để kiểm tra độ đặc hiệu, nhiệt độ nóng chảy (Tm), tỷ lệ % GC, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop), tự bắt cặp (self-dimer) và bắt cặp chéo (hetero-dimer) của các cặp mồi.
• Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp hóa học phenol/chloroform. Tế bào được phá hủy màng bằng SDS 10% và tiêu hóa protein bằng Proteinase K (20 mg/ml) ở 48°C trong 2 giờ. Thu dịch nổi qua các lần chiết tách với phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1) và chloroform; tủa DNA bằng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và ethanol 100% lạnh ở -20°C; rửa tủa bằng ethanol 70%.
• Kiểm tra chất lượng DNA: Xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ hấp thụ UV ở bước sóng 260 nm và tỷ số OD260/OD280; kiểm tra độ toàn vẹn qua điện di gel agarose 2% trong đệm 1X TAE ở hiệu điện thế 80V trong 30 phút dưới tia UV với ethidium bromide; kiểm tra khả năng khuếch đại bằng phản ứng PCR gen DcR1 hoang dại (DcR1-W) trong thể tích 25 µl (nhiệt độ bắt cặp 68°C, 40 chu kỳ).
• Biến đổi bisulfite: Sử dụng bộ kit chuyên dụng EpiTect Bisulfite (Qiagen) với chu trình luân nhiệt biến tính 95°C và ủ 60°C qua nhiều giai đoạn (tổng thời gian ủ bisulfite hơn 4 giờ), sau đó tinh sạch qua màng cột thu nhận DNA biến đổi trong 40 µl đệm EB.
• Đánh giá độ đặc hiệu mồi bằng QMSP (Quantitative MSP): Chạy phản ứng Real-time PCR với chất huỳnh quang SYBR Green trên hệ mẫu DNA chuẩn (DNA control) của Qiagen gồm DNA người đã methyl hóa và chưa methyl hóa, chu trình nhiệt 40 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp mồi 55°C, kết hợp phân tích đường cong nóng chảy và điện di kiểm tra kích thước vạch sản phẩm.
• Phản ứng MSP: Khuếch đại DNA biến đổi bisulfite từ mẫu bệnh phẩm bằng PCR master mix 2X (Fermentas) trong thể tích 25 µl với 40 chu kỳ nhiệt; nhiệt độ bắt cặp mồi được tối ưu hóa ở 63°C đối với cặp mồi p16-M và 56°C đối với cặp mồi p16-U.

Nguồn dữ liệu thực nghiệm

• Dữ liệu thứ cấp: Cơ sở dữ liệu PubMed thuộc Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học Hoa Kỳ (NCBI).
• Mẫu kiểm chứng: Mẫu DNA control chuẩn của hãng Qiagen (bao gồm DNA đã methyl hóa và DNA chưa methyl hóa).
• Mẫu lâm sàng: Tổng cộng 32 mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung do Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á cung cấp, toàn bộ đã được xác định dương tính với các type HPV nguy cơ cao (HPV-16, 18). Cấu trúc mẫu gồm 5 mẫu mô tươi và 27 mẫu dịch phết cổ tử cung, bảo quản ở -30°C.

Nội dung chính theo từng phần

Phần I: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện các y văn về sinh học phân tử của ung thư cổ tử cung, cơ chế biểu sinh và gen mục tiêu:

• Tác nhân HPV và cơ chế sinh bệnh: Mô tả đặc điểm cấu trúc bộ gen DNA mạch đôi kích thước 8 kb của họ Papillomaviridae. Quá trình nhiễm virus kéo dài 15-25 năm qua các giai đoạn tiến triển mô bệnh học: tổn thương nội biểu mô vảy mức độ thấp CIN I (khả năng thoái triển và khỏi bệnh trên 90%), tổn thương mức độ cao gồm CIN II và CIN III/carcinoma tại chỗ CIS (khoảng 10% tiến triển thành ác tính sau 2-4 năm), và giai đoạn ung thư xâm lấn (ICC). Tổng quan các phương pháp phòng ngừa bằng vaccine tái tổ hợp protein vỏ L1/L2 (Cervarix phòng type 16/18; Gardasil phòng type 6/11/16/18); các phương pháp chẩn đoán lâm sàng (Pap smear độ đặc hiệu 91-96%; soi cổ tử cung phóng đại 10-30 lần; sinh thiết; khoét chóp; kỹ thuật HPV-PCR đặc hiệu type ts-PCR dựa trên trình tự E6/E7); cùng các giải pháp phẫu thuật triệt để Wertheim-Meigs và xạ trị.
• Cơ chế Epigenetic và methyl hóa DNA: Phân tích chi tiết vai trò của đảo CpG có chiều dài 0,5-4 kb với hàm lượng GC trên 50%, chiếm 40% tại các vùng promoter gen người. Trong tế bào bình thường, các đảo CpG ở promoter không bị methyl hóa để duy trì trạng thái mở cho bộ máy phiên mã. Trong tế bào khối u, enzyme DNMTs biểu hiện quá mức xúc tác methyl hóa de novo khiến khoảng 1,4% đến 10% trong số 45.000 đảo CpG của bộ gen bị biến đổi, dẫn đến bất hoạt phiên mã gen đè nén khối u. Phân tích tác động phối hợp giữa methyl hóa DNA và cải biến histone (sự acetyl hóa/khử acetyl đuôi N qua HATs/HDACs; sự methyl hóa lysine H3K4 kích hoạt phiên mã so với H3K9 gây co cụm dị nhiễm sắc qua protein HP1; sự phosphoryl hóa histone H3).
• Đặc tính gen p16: Phân tích cơ chế kiểm soát chu trình tế bào tại điểm G1/S thông qua con đường p16-CDK4/6-Cyclin D1-pRb-E2F. Luận điểm quan trọng chỉ ra rằng trong ung thư cổ tử cung, dù oncogene E7 của HPV làm phân hủy pRb dẫn đến hiện tượng biểu hiện quá mức mang tính bù trừ của p16, nhưng protein này hoàn toàn mất hoạt tính chức năng. Đồng thời, sự kiện hypermethylation promoter p16 là một biến đổi biểu sinh độc lập xảy ra rất sớm, có thể đóng vai trò như một biomarker đặc hiệu phân biệt giữa mô bệnh lý và mô lành.
• Kỹ thuật MSP: Trình bày chi tiết nguyên lý phản ứng khử amin của bisulfite đối với Cytosine chưa methyl hóa thành Uracil dưới tác dụng của NaHSO3 và hydroquinone. Nêu rõ tiêu chí biện giải kết quả điện di sản phẩm MSP: mẫu xuất hiện vạch ở cả phản ứng mồi M và mồi U là methyl hóa không hoàn toàn; chỉ xuất hiện vạch ở mồi U là không methyl hóa; chỉ xuất hiện vạch ở mồi M là methyl hóa hoàn toàn.

Phần II: Vật liệu và phương pháp

Chương này đặc tả chi tiết toàn bộ hóa chất, thiết bị, phần mềm và quy trình thao tác thực nghiệm:

• Công cụ và hóa chất: Liệt kê các phần mềm chuyên dụng (Annhyb-4, MethPrimer, MethBlast, TFSEARCH) và hóa chất từ các nhà sản xuất chuẩn (Merck, Intronbio, Bio-Rad, Qiagen, Fermentas).
• Thao tác xử lý mẫu và tách chiết DNA: Chuẩn hóa quy trình xử lý ban đầu khác biệt giữa mẫu mô tươi (nghiền cắt cơ học trong đệm ly giải) và mẫu dịch phết (thu hồi tế bào từ tăm bông qua ly tâm và rửa dịch đệm). Chi tiết hóa 9 bước tách chiết phenol/chloroform, loại bỏ protein triệt để nhằm bảo đảm độ tinh sạch của acid nucleic.
• Kiểm tra DNA: Thiết lập điều kiện đo quang phổ UV để xác định nồng độ (1 đơn vị OD260 tương ứng 50 µg/ml DNA sợi đôi) và độ sạch qua tỷ số OD260/OD280 (khoảng 1,8-2,0). Ứng dụng phản ứng PCR gen DcR1-W (thành phần 12,5 µl Premium PCR master mix 2X, chu trình nhiệt 40 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp 68°C) để kiểm chứng DNA khuôn không bị ức chế phản ứng khuếch đại trước khi xử lý hóa học.
• Chu trình biến đổi bisulfite và PCR chuyên biệt: Thiết lập điều kiện biến đổi bisulfite cho từng loại nồng độ và chất lượng DNA (DNA nồng độ cao, nồng độ thấp hoặc DNA bị đứt gãy) theo quy trình EpiTect Bisulfite Kit với các bước ủ nhiệt 60°C kéo dài (25 phút, 85 phút, 175 phút). Chuẩn hóa phản ứng QMSP sử dụng SYBR PCR master mix kiểm tra mồi trên DNA chuẩn Qiagen ở 55°C. Thiết lập thông số phản ứng MSP sử dụng PCR master mix 2X của Fermentas với thể tích khuôn DNA là 5 µl trong tổng thể tích 25 µl, tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ở 63°C cho cặp p16-M và 56°C cho cặp p16-U trong 40 chu kỳ.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện rút ra từ phân tích dữ liệu tổng quan y văn và kết quả thực nghiệm in silico:

• Khai thác dữ liệu PubMed: Thu thập 10 công trình khoa học quốc tế tiêu biểu nghiên cứu về mức độ methyl hóa promoter gen p16 trên ung thư cổ tử cung. Một số công trình sử dụng phối hợp nhiều kỹ thuật trên các nhóm mẫu khác nhau, hình thành dữ liệu tổng hợp từ 22 lượt nghiên cứu độc lập.
• Thống kê so sánh kỹ thuật và nguồn mẫu: Kết quả tổng hợp dữ liệu cho thấy kỹ thuật MSP chiếm ưu thế áp đảo với 54,5% (12/22 lượt), tiếp theo là phương pháp giải trình tự bisulfite (BSP) chiếm 18,2% (4/22 lượt), Real-time MSP định lượng (QMSP) chiếm 9,1% (2/22 lượt) và các phương pháp khác chiếm 13,6% (3/22 lượt). Về nguồn bệnh phẩm, mẫu mô tươi được sử dụng nhiều nhất với 59,1% (13/22 lượt), mẫu mô đúc khối paraffin chiếm 36,4% (8/22 lượt), và mẫu sinh thiết chiếm 4,5% (1/22 lượt).

Nguồn mẫu	MSP	QMSP	BSP	Khác	Tổng số lượt nghiên cứu	Tỷ lệ (%)	Tài liệu tham khảo trích dẫn
Mô tươi	6	1	3	2	13	59,1%	[7, 16, 29, 36-41]
Mô đúc (paraffin)	5	1	1	1	8	36,4%	[16, 29, 36-38, 42]
Sinh thiết	1	-	-	-	1	4,5%	[39]
Tổng cộng	12	2	4	3	22	100%
Tỷ lệ kỹ thuật (%)	54,5%	9,1%	18,2%	13,6%	100%

• Biện luận về phương pháp và mẫu: Tác giả lập luận rằng MSP là phương pháp tối ưu và phổ biến nhất do cho phép khảo sát đồng thời nhiều vị trí CpG trên trình tự quan tâm mà không đòi hỏi trang thiết bị quá phức tạp như giải trình tự bisulfite. Mẫu mô tươi là đối tượng thích hợp nhất để đánh giá biến đổi methyl hóa theo tiến trình bệnh học vì vùng mô phẫu thuật đảm bảo chứa tế bào chuyển dạng ác tính hoặc tiền ung thư, hạn chế sự thoái biến acid nucleic thường gặp ở mẫu mô đúc paraffin xử lý bằng hóa chất cố định formalin lâu ngày.
• Phân tích in silico cấu trúc đảo CpG vùng promoter gen p16: Định vị chính xác các đảo CpG từ vùng promoter kéo dài qua vị trí bắt đầu phiên mã đến exon 1α. Sử dụng TFSEARCH xác định các điểm nóng (hot spots) chứa các vị trí bám của yếu tố phiên mã quan trọng. Lựa chọn vùng đảo CpG số 4 làm đích khuếch đại, đánh giá các chỉ số hóa lý của cặp mồi chuyên biệt (chiều dài, Tm, %GC, không tạo dimer hay cấu trúc bậc hai bền vững) phục vụ phản ứng MSP.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính đạt được

• Hệ thống hóa định lượng dữ liệu y văn quốc tế: Tổng hợp từ 10 công trình khoa học (22 lượt nghiên cứu) trên cơ sở dữ liệu PubMed, xác định rõ xu hướng sử dụng kỹ thuật MSP (chiếm 54,5%) và nguồn mẫu mô tươi (chiếm 59,1%) trong nghiên cứu biểu sinh ung thư cổ tử cung.
• Thiết kế và thẩm định in silico hệ thống mồi MSP: Lựa chọn và đánh giá thành công các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đảo CpG số 4 thuộc vùng promoter gen p16, kiểm tra các thông số nhiệt động học qua IDT và Annhyb-4, bảo đảm độ đặc hiệu cao sau biến đổi bisulfite.
• Xây dựng hoàn chỉnh quy trình thực nghiệm đồng bộ: Thiết lập thành công chuỗi quy trình kỹ thuật gồm tách chiết DNA bằng phenol/chloroform đạt độ tinh sạch cao (OD260/OD280 đạt 1,8-2,0); kiểm tra độ nguyên vẹn qua PCR gen DcR1-W (nhiệt độ bắt cặp 68°C); biến đổi bisulfite bằng EpiTect Bisulfite Kit; kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng QMSP huỳnh quang SYBR Green trên mẫu DNA chuẩn Qiagen ở 55°C; và phản ứng MSP với điều kiện nhiệt độ bắt cặp chuyên biệt (63°C cho p16-M và 56°C cho p16-U).
• Thu thập và chuẩn bị tập mẫu bệnh phẩm thực nghiệm: Tiếp nhận và xử lý 32 mẫu bệnh phẩm lâm sàng (5 mẫu mô tươi, 27 mẫu dịch phết cổ tử cung) từ bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cơ cao (HPV-16, 18) do Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á cung cấp, làm nguồn mẫu khuôn cho các phản ứng khuếch đại sinh học phân tử.

Đóng góp của tác giả

• Tự thiết kế và chuẩn hóa được hệ thống các cặp mồi chuyên biệt cho phản ứng MSP nhằm khuếch đại chính xác vùng đảo CpG số 4 thuộc promoter gen p16 trên nền DNA đã biến đổi bisulfite.
• Đóng góp quy trình kỹ thuật thực nghiệm hoàn chỉnh và các dữ liệu cơ sở cho đề tài nghiên cứu lớn của nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh, hướng đến việc xây dựng hệ thống các biomarker methyl hóa đa gen phục vụ công tác tầm soát sớm ung thư cổ tử cung tại Việt Nam.

Giải pháp và kiến nghị

• Tác giả đề xuất ứng dụng quy trình và bộ mồi MSP đã được tối ưu hóa để triển khai đánh giá thực nghiệm trên quy mô mẫu bệnh phẩm lâm sàng lớn hơn thu nhận từ các cơ sở y tế tại khu vực phía Nam.
• Kiến nghị kết hợp phân tích methyl hóa gen p16 với các gen ức chế khối u khác nhằm xây dựng bộ chỉ dấu phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hỗ trợ đắc lực cho công tác chẩn đoán sớm và theo dõi tiên lượng bệnh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Quy mô mẫu thực nghiệm lâm sàng còn khiêm tốn với tổng số 32 mẫu bệnh phẩm thu nhận được từ một nguồn cung cấp (Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á).
• Cơ cấu mẫu chưa thực sự cân bằng: Tỷ lệ mẫu dịch phết cổ tử cung chiếm đa số (27/32 mẫu, tương đương 84,4%), trong khi mẫu mô tươi chỉ có 5 mẫu (chiếm 15,6%). Mặc dù phân tích y văn chỉ ra mẫu mô tươi phản ánh chính xác nhất tổn thương mô học, nhưng việc thu thập loại mẫu này trên thực tế lâm sàng gặp nhiều khó khăn.
• Nghiên cứu tập trung vào kỹ thuật MSP mang tính chất định tính hoặc bán định lượng dựa trên điện di gel agarose, chưa áp dụng giải trình tự bisulfite trực tiếp (BSP) cho toàn bộ các mẫu bệnh phẩm để xác định mức độ methyl hóa chi tiết tại từng nucleotide cytosine đơn lẻ.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục mở rộng thu thập số lượng lớn mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ các bệnh nhân ung thư cổ tử cung ở các giai đoạn mô bệnh học khác nhau (CIN I, CIN II, CIN III/CIS và ung thư xâm lấn ICC) tại khu vực miền Nam nhằm kiểm chứng độ tin cậy thống kê của bộ mồi.
• Mở rộng phân tích tình trạng methyl hóa bất thường trên một hệ thống đa gen (bao gồm các gen sửa chữa DNA, kiểm soát chu trình tế bào và apoptosis khác) để hoàn thiện tổ hợp biomarker chẩn đoán sớm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị tham khảo thiết thực cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học, Sinh học Phân tử, Y sinh học và Ung thư học thực nghiệm. Các nội dung có giá trị ứng dụng cao bao gồm:

• Cơ sở lý thuyết toàn diện về biến đổi biểu sinh (Epigenetics), cơ chế methyl hóa DNA, biến đổi histone và mối liên hệ phân tử giữa các oncogene của HPV (E6, E7) với các điểm kiểm soát chu trình tế bào.
• Phương pháp luận kết hợp chặt chẽ giữa công cụ tin sinh học (in silico) trong việc phân tích cấu trúc đảo CpG, tìm vị trí gắn nhân tố phiên mã (TFSEARCH) và thiết kế mồi MSP (MethPrimer, Annhyb-4, IDT).
• Quy trình thực nghiệm chi tiết từng bước: từ kỹ thuật tách chiết DNA bằng phenol/chloroform trên cả hai loại bệnh phẩm (mô tươi và dịch phết), quy trình biến đổi bisulfite bằng kit chuyên dụng, đến việc thiết lập các thông số phản ứng MSP và QMSP có giá trị ứng dụng trực tiếp trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng những công cụ tin sinh học nào để khảo sát gen p16 và thiết kế mồi MSP?

Khóa luận đã sử dụng cơ sở dữ liệu PubMed và GenBank của NCBI để thu nhận trình tự gen p16. Sau đó, phần mềm MethPrimer được dùng để phân tích đảo CpG và mô phỏng biến đổi bisulfite in silico; công cụ TFSEARCH dùng để xác định các điểm nóng gắn nhân tố phiên mã; phần mềm Annhyb-4 và MethBlast dùng để kiểm tra độ đặc hiệu; và các công cụ trực tuyến của IDT dùng để tính toán các thông số lý hóa như nhiệt độ nóng chảy (Tm), tỷ lệ % GC, khả năng hình thành kẹp tóc (hairpin loop), tự bắt cặp (self-dimer) và bắt cặp chéo (hetero-dimer).

2. Mẫu bệnh phẩm lâm sàng được sử dụng trong khóa luận có đặc điểm gì?

Nghiên cứu sử dụng tổng cộng 32 mẫu bệnh phẩm người do Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á cung cấp, toàn bộ đã được khẳng định dương tính với các type HPV nguy cơ cao (HPV-16 và HPV-18). Về mặt cấu trúc, tập mẫu gồm 5 mẫu mô tươi và 27 mẫu dịch phết cổ tử cung, tất cả được bảo quản nghiêm ngặt ở nhiệt độ -30°C trước khi tiến hành tách chiết DNA.

3. Mục đích của việc thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi DcR1 hoang dại (DcR1-W) là gì?

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen DcR1 hoang dại (DcR1-W) được thực hiện sau bước đo quang phổ và điện di gel agarose nhằm đánh giá khách quan hiệu quả của quá trình tách chiết DNA. Việc xuất hiện vạch sản phẩm PCR đặc hiệu chứng minh dịch chiết thu được thực sự chứa DNA bộ gen nguyên vẹn, không bị đứt gãy nghiêm trọng và không tồn dư các chất ức chế phản ứng khuếch đại, đảm bảo đủ tiêu chuẩn làm khuôn cho bước biến đổi hóa học bằng bisulfite tiếp theo.

4. Kết quả tổng hợp y văn từ 10 bài báo quốc tế trên PubMed cho thấy phương pháp phân tích và loại mẫu nào được dùng phổ biến nhất?

Phân tích thống kê từ 22 lượt nghiên cứu trong 10 bài báo quốc tế chỉ ra rằng kỹ thuật MSP là phương pháp được sử dụng nhiều nhất, chiếm 54,5% (12/22 lượt), vượt trội so với BSP (18,2%) và QMSP (9,1%). Về nguồn mẫu bệnh phẩm, mẫu mô tươi chiếm ưu thế cao nhất với 59,1% (13/22 lượt), tiếp đến là mẫu mô đúc paraffin chiếm 36,4% (8/22 lượt) và mẫu sinh thiết chiếm 4,5% (1/22 lượt).

5. Thông số nhiệt độ bắt cặp mồi (Ta) trong phản ứng MSP của gen p16 được thiết lập như thế nào?

Trong quy trình phản ứng MSP sử dụng bộ kit master mix 2X của Fermentas với 40 chu kỳ nhiệt, tác giả đã thiết lập nhiệt độ bắt cặp mồi chuyên biệt là 63°C đối với cặp mồi khuếch đại alen methyl hóa (p16-M) và 56°C đối với cặp mồi khuếch đại alen không methyl hóa (p16-U) nhằm đảm bảo tối đa độ đặc hiệu khuếch đại của từng phản ứng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Đang Uyên đã giải quyết một vấn đề khoa học mang tính thời sự trong lĩnh vực y sinh học phân tử bằng cách tiếp cận hiện đại từ góc độ biểu sinh học. Thông qua sự kết hợp chặt chẽ giữa tổng quan dữ liệu y văn quốc tế, công cụ tin sinh học in silico và quy trình thực nghiệm nghiêm ngặt, đề tài đã thiết kế và thẩm định thành công hệ thống mồi chuyên biệt cho kỹ thuật MSP nhằm phát hiện sự methyl hóa promoter gen p16 trên bệnh phẩm ung thư cổ tử cung. Nghiên cứu đã cung cấp quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh và cơ sở dữ liệu quan trọng, đóng góp thiết thực cho mục tiêu phát triển các bộ dấu chuẩn sinh học phân tử phục vụ tầm soát sớm và quản lý bệnh lý ung thư cổ tử cung tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ Chức Nghiên Cứu Thế Giới Về Ung Thư (IARC) và Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) khẳng định Human Papilloma Virus (HPV) là nguyên nhân chính gây ung thư cổ tử cung. DNA của HPV được tìm thấy 99,7% trong các ca ung thư cổ tử cung. Năm 2008, thế giới có khoảng 530000 người được xác định mắc ung thư cổ tử cung và có khoảng 275000 người đã tử vong chiếm tỉ lệ 52 %. Trong số bệnh nhân tử vong, khoảng 88 % xảy ra ở các nước đang phát triển: 53000 ở châu Phi, 31700 ở Mỹ Latinh và vùng Caribê, cao nhất là ở châu Á với 159800 trường hợp (Globocan, 2008).

Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ cao trong tất cả các loại ung thư ở phụ nữ và có xu hướng ngày càng tăng, kết quả thống kê của IARC cho thấy rằng có 2472 ca tử vong trong số 5174 trường hợp được chẩn đoán ung thư cổ tử cung mỗi năm [1]. Hiện nay, phương pháp chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phát hiện virus xâm nhiễm và xét nghiệm Pap. Phương pháp phát hiện virus xâm nhiễm có độ nhạy cao lên đến 95% nhưng không xác định được tình trạng mô học hiện tại của cổ tử cung là có bị ung thư không. Xét nghiệm Pap có độ nhạy 55%, tỉ lệ âm tính giả cao.

Việc kết hợp cả hai phương pháp này đang được thực hiện nhằm mang lại hiệu quả cao hơn trong chẩn đoán và điều trị. Tuy nhiên, với điều kiện nước ta hiện nay, việc tầm soát bệnh vẫn còn gặp nhiều khó khăn, phần lớn bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn cuối, chỉ vài năm trước khi qua đời. Vì vậy, việc tìm ra một biomarker - dấu chuẩn sinh học đặc trưng cho ung thư cổ tử cung nhằm chẩn đoán sớm, tiên đoán cũng như theo dõi tiến trình gây bệnh để có phương pháp điều trị thích hợp, tránh tình trạng tử vong cao như hiện nay là việc làm cấp thiết. Thời gian gần đây, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh được mối liên hệ giữa biến đổi Epigenetic với tiến trình bệnh ung thư.

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 2 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp Epigenetic là hiện tượng thay đổi cấu trúc DNA có thể di truyền được mà không có sự thay đổi trình tự base trên DNA [2]. Methyl hóa là một trong những sự kiện thuộc biến đổi Epigenetic và methyl hóa bất thường thường xuyên được tìm thấy trong hầu hết các loại ung thư. Methyl hóa bất thường xảy ra trên toàn bộ gen, trong đó các gen được xác định bị biến đổi trong tế bào ung thư bao gồm: gen ức chế khối u (tumor suppressor genes), gen gây ung thư (oncogenes), gen điều hòa chu trình tế bào (cell cycle regulation), gen tham gia chu trình chết tế bào (apoptosis).

Các nghiên cứu hiện nay tập trung chủ yếu vào việc tìm ra biomarker dựa vào sự kiện methyl hóa bất thường diễn trên các gen nói trên nhằm nhanh chóng tìm ra dấu hiệu đặc trưng của bệnh và có phương pháp điều trị hợp lí. [2, 3] p16 là gen ức chế khối u có vai trò quan trọng tại điểm kiểm soát G1/S trong chu trình tế bào. Sự methyl hóa bất thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter gen p16 là cơ chế chính dẫn đến sự mất biểu hiện của gen có liên quan tới các trường hợp ung thư ở người đã được báo cáo trong thời gian gần đây. Chúng tôi dùng phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) - một trong những phương pháp đánh giá mức độ methyl hóa DNA phổ biến hiện nay, là kỹ thuật PCR đặc biệt dùng cho việc xác định nhanh chóng tình trạng methyl hóa các vùng đảo CpG trên DNA [4].

Phương pháp này cũng được sử dụng bởi phần lớn các tài liệu nghiên cứu mà chúng tôi thu thập được. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát mức độ methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16 trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung” nằm trong đề tài nghiên cứu lớn của nhóm với các mục tiêu sau: - Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của gen p16 và mối tương quan về sự methyl hóa trên gen này với ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng. SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 3 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp - Thiết kế được các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen p16 trong phản ứng MSP.

Từ đó có thể sử dụng các cặp mồi này để đánh giá mức độ methyl hóa gen p16 trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung thu nhận tại khu vực miền Nam, Việt Nam. - Cung cấp thêm thông tin góp phần cho một đề tài nghiên cứu lớn hơn nhằm xây dựng một hệ thống các gen có sự methyl hóa bất thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự phát sinh và phát triển ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng, từ đó có thể chẩn đoán sớm và hỗ trợ cho quá trình điều trị ung thư. SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 4 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I.1/ Sơ lược về ung thư cổ tử cung: I.1/ Tác nhân gây bệnh: Những nguy cơ có thể gây ung thư cổ tử cung như: quan hệ tình dục sớm hoặc quan hệ với nhiều người, yếu tố nguy cơ tăng thêm nếu bạn tình cũng có quan hệ tình dục với nhiều người khác; sinh đẻ nhiều (từ trên bốn lần); hút thuốc lá; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục; suy giảm hệ thống miễn dịch, rối loạn nội tiết (mắc bệnh HIV/AIDS, viêm gan, tiểu đường…); các yếu tố khác như nghèo nàn, lạc hậu, vệ sinh kém; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục, đặc biệt là viêm sinh dục do nhiễm các vi sinh vật như: Human Papilloma Virus (HPV), Trichomonas, Chlamydiae trachomatis, Herpes simplex virus type 2 (HSV2).

Trong đó, nhiễm HPV là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến. Biểu hiện lâm sàng là hình ảnh u sùi điển hình vùng hậu môn - sinh dục như âm hộ, âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật, vùng hầu họng và ung thư cổ tử cung. Tháng 10/1999, hội thảo do IARC và WHO khẳng định HPV là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành và phát triển ung thư cổ tử cung. HPV có nhân DNA sợi đôi thuộc họ Papillomaviridae, trọng lượng phân tử 8kb, là một trong những tác nhân lây nhiễm qua da, niêm mạc và phổ biến nhất là lây nhiễm qua đường tình dục.

Có trên 100 type HPV khác nhau, trong đó có khoảng 40% tác động lên đường sinh dục và 15% có nguy cơ gây ung thư cổ tử cung. Dựa vào tính gây ung thư, HPV được chia làm hai nhóm: [5] SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 5 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp ✔ Nhóm nguy cơ thấp: hiếm gặp trong các trường hợp ung thư gồm các type: HPV-6, 11, 42, 43, 44 .gây ra các nhiễm trùng nhẹ như mụn cóc ở da, bộ phận sinh dục, niêm mạc miệng. ✔ Nhóm nguy cơ cao: liên quan trực tiếp đến bệnh lý ung thư, bao gồm các type: HPV-16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66, 68.

Trong đó, HPV-16 và HPV-18 là hai type được xác định có nguy cơ cao nhất gây ung thư cổ tử cung (chiếm hơn 70%). Cơ chế phân biệt nhóm nguy cơ thấp và cao vẫn chưa được rõ ràng. Tuy nhiên, ghi nhận nhóm nguy cơ cao thường gây tình trạng nhiễm virus kéo dài hơn nhóm nguy cơ thấp (thời gian hiện diện virus tại mô cổ tử cung dài hơn). Người ta nghĩ rằng có thể trong nhóm nguy cơ cao, các gen gây ung thư có hoạt tính mạnh hơn và khả năng lây lan cao hơn nhóm nguy cơ thấp.1: Hình ảnh tổng thể (a) và cấu trúc (b) của HPV-16 SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 6 GVHD:TS.

LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp I.2/ Cơ chế gây bệnh của HPV: HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp hai loại mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa). Biểu mô lát tầng không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quy định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó bong ra ngoài. Virus sẽ tấn công vào lớp tế bào đáy của biểu mô vốn có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của một rồi tiến tới nhiều lớp tế bào sau đó. Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp tế bào biểu mô lát gây hiện tượng dị sản còn gọi là ung thư tại chỗ, có khả năng phát triển lan rộng đến các lớp tế bào biểu mô lát khác gây dị sản nặng lan ra khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung xâm lấn.

Tuy nhiên, những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra ở tế bào biểu mô lát vốn không tiếp xúc với mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên. [6] HPV hoạt động chủ yếu nhờ các oncogene E6 và E7, sau khi HPV xâm nhập vào tế bào, E6 và E7 xác nhập vào bộ gen tế bào kí chủ và điều khiển tổng hợp protein E6, E7 gây bất lợi cho tế bào kí chủ. E6 gắn lên p53 - protein 53 có vai trò ức chế khối u, có thể đồng thời tham gia vào ba quá trình: (1) thúc đẩy sự phiên mã của các gen đích làm dừng chu trình tế bào ở các điểm kiểm soát G1/S và G2/M , (2) kích hoạt hệ thống sửa chữa DNA hư hỏng, (3) hoạt hóa một số gen đích mà sản phẩm của chúng dẫn tới con đường apoptosis. Việc E6 có thể gắn lên p53 gây mất kiểm soát chu trình tế bào, ngăn chặn con đường apoptosis dẫn tới tế bào được tái tạo liên tục và mang theo những DNA hư hỏng.

Trong khi đó, E7 gắn lên pRb (protein Retinoplastoma - điều hòa tăng trưởng tế bào) gây thoái hóa phức hợp pRb- SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 7 GVHD:TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp E2F dẫn tới E2F được tự do hoạt hóa phiên mã, tế bào với bộ gen đã bị biến đổi tăng sinh một cách liên tục và tiến triển thành ung thư.