Khảo Sát Hoạt Động và Tính Chất Của Protease Trong Quá Trình Tự Phân Của Trùn Quế (Perionyx Excavatus)

• Tác giả: Trương Thị Thùy Liên
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Động và Tính Chất Protease Trong Tự Phân Của Trùn Quế (Perionyx Excavatus)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Trùn quế
• 1.2. Tổng quan về protease
• 1.2.1. Giới thiệu chung
• 1.2.2. Phân loại protease
• 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Khảo sát quá trình tự phân của trùn quế
• 3.1.1. Khảo sát đơn yếu tố hoạt động protease trong quá trình tự phân
• 3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trong quá trình tự phân
• 3.1.3. Khảo sát protease từ trùn quế
• 3.1.4. Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protease
• 3.2. Tối ưu hóa quá trình tách chiết protease
• 3.3. Phân tích chế phẩm protease
• 3.3.1. Phân tích bằng sắc ký lọc gel
• 3.3.2. Điện di SDS-PAGE
• 3.4. Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH đến protease trùn quế
• 3.5. Khảo sát dịch trùn tự phân
• 3.6. Bước đầu ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về hoạt động và tính chất protease trong trùn quế

Nghiên cứu về protease trong trùn quế (Perionyx excavatus) đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Protease là enzyme quan trọng trong quá trình tự phân của trùn quế, giúp phân hủy protein thành các acid amin. Việc hiểu rõ hoạt động và tính chất của enzyme này không chỉ có ý nghĩa trong sinh học mà còn trong nông nghiệp, nơi trùn quế được sử dụng như một nguồn phân bón tự nhiên.

1.1. Khái niệm về protease và vai trò của nó

Protease là enzyme xúc tác quá trình thủy phân protein, cắt mối liên kết peptide. Chúng có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, bao gồm tiêu hóa và tái chế protein trong cơ thể. Trong trùn quế, protease giúp phân hủy các chất hữu cơ, tạo ra nguồn dinh dưỡng cho cây trồng.

1.2. Tính chất của protease trong trùn quế

Tính chất của enzyme protease trong trùn quế bao gồm khả năng hoạt động ở nhiệt độ và pH nhất định. Nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease từ trùn quế là 55°C và pH tối ưu là 6. Những điều kiện này giúp enzyme hoạt động hiệu quả nhất trong quá trình tự phân.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu protease của trùn quế

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hoạt động của protease, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc tối ưu hóa điều kiện thu nhận và ứng dụng enzyme này. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, và thời gian tự phân đều ảnh hưởng đến hiệu suất của protease. Việc tìm ra các điều kiện tối ưu là cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng trong nông nghiệp.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của protease trong trùn quế. Nghiên cứu cho thấy, sự thay đổi trong các yếu tố này có thể làm giảm hoặc tăng hoạt tính của enzyme, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tự phân.

2.2. Thách thức trong việc thu nhận protease

Việc thu nhận protease từ trùn quế gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi của enzyme trong quá trình tách chiết. Cần có các phương pháp tối ưu hóa để đảm bảo thu được enzyme với hoạt tính cao nhất, đồng thời giảm thiểu chi phí sản xuất.

III. Phương pháp tối ưu hóa hoạt động protease trong trùn quế

Để tối ưu hóa hoạt động của protease, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Sử dụng phần mềm Design Expert 8.2 giúp xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình tự phân. Nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ dịch trùn là 13% và thời gian tự phân là 6 ngày cho hoạt tính cao nhất.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện hoạt động của protease

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease là nhiệt độ 55°C và pH 6. Những điều kiện này giúp enzyme hoạt động hiệu quả nhất, từ đó nâng cao hiệu suất tự phân của trùn quế.

3.2. Phương pháp thu nhận protease hiệu quả

Sử dụng dung môi acetone là phương pháp hiệu quả nhất để thu nhận protease từ trùn quế. Tỷ lệ mẫu và dung môi là 1:2, thời gian tủa 90 phút cho thấy hoạt tính enzyme tăng 2.5 lần so với các phương pháp khác.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protease trong nông nghiệp

Việc ứng dụng protease từ trùn quế trong nông nghiệp đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Dịch trùn tự phân không chỉ giúp cải thiện chất lượng đất mà còn tăng trưởng cây trồng. Nghiên cứu cho thấy, lá trà bón dịch trùn có chỉ số tăng trưởng cao hơn 12% so với đối chứng.

4.1. Tác động của dịch trùn đến cây trà

Kết quả nghiên cứu cho thấy, lá trà bón dịch trùn có hàm lượng acid amin cao hơn 12% so với lá không bón. Điều này cho thấy ứng dụng của protease trong nông nghiệp có thể cải thiện chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

4.2. Lợi ích của việc sử dụng trùn quế trong nông nghiệp

Sử dụng trùn quế không chỉ giúp giảm thiểu việc sử dụng phân hóa học mà còn bảo vệ môi trường. Phân trùn giúp cải thiện độ phì nhiêu của đất, tăng khả năng chống sâu bệnh cho cây trồng.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protease trong trùn quế

Nghiên cứu về protease trong trùn quế mở ra nhiều hướng đi mới trong nông nghiệp bền vững. Việc tối ưu hóa hoạt động và thu nhận enzyme sẽ giúp nâng cao hiệu quả sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp.

5.1. Tương lai của protease trong nông nghiệp

Với những lợi ích rõ ràng, protease từ trùn quế sẽ tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình thu nhận và ứng dụng enzyme này.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu cần mở rộng sang các loại cây trồng khác và đánh giá tác động lâu dài của dịch trùn đến chất lượng đất và sản phẩm nông nghiệp. Điều này sẽ giúp khẳng định vai trò của trùn quế trong hệ sinh thái nông nghiệp.

Tổng quan nghiên cứu

Trùn quế (Perionyx excavatus) là một nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme protease có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp sinh học. Theo ước tính, trùn quế có thể sinh sản nhanh chóng, từ một cặp ban đầu có thể tạo ra khoảng 1.500 cá thể trong một năm, với kích thước trưởng thành từ 10 đến 15 cm. Hoạt động protease trong quá trình tự phân của trùn quế đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân protein thành các acid amin, góp phần tạo ra dịch trùn có giá trị dinh dưỡng cao. Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn quế, tối ưu hóa điều kiện hoạt động và thu nhận protease, đồng thời ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón cho cây trà xanh TB14 tại Lâm Đồng.

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2017. Ý nghĩa của nghiên cứu nằm ở việc phát triển quy trình thu nhận protease hiệu quả từ trùn quế, góp phần nâng cao giá trị sản phẩm dịch trùn, đồng thời ứng dụng trong nông nghiệp sạch, cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng, đặc biệt là cây trà xanh TB14 – giống chè có năng suất bình quân 18-20 tấn/ha/năm và được thị trường ưa chuộng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về enzyme protease, đặc biệt là nhóm serine protease – loại enzyme có nhóm hydroxyl (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động, có khả năng thủy phân liên kết peptide trong protein. Protease được phân loại theo vị trí cắt (endopeptidase, exopeptidase), theo cơ chế xúc tác (serine, cysteine, metallo protease), theo pH hoạt động (acid, trung tính, kiềm) và theo vị trí hiện diện (nội bào, ngoại bào). Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme như pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và cơ chất cũng được xem xét kỹ lưỡng.

Mô hình nghiên cứu tập trung vào quá trình tự phân trùn quế, khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như hàm lượng trùn, thời gian tự phân, nhiệt độ, pH và các chất ức chế vi sinh vật đến hoạt động protease. Ngoài ra, nghiên cứu áp dụng phần mềm tối ưu hóa Design Expert 8.2 để xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động protease và quá trình tách chiết enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là dịch trùn tự phân thu được từ trùn quế nuôi tại trang trại An Phú, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm các mẫu dịch trùn với hàm lượng trùn từ 7% đến 15%, thời gian tự phân từ 1 đến 12 ngày, được khảo sát trong điều kiện nhiệt độ từ 30°C đến 55°C. Phương pháp chọn mẫu là lấy mẫu ngẫu nhiên từ các lô trùn quế nuôi theo quy trình chuẩn.

Phân tích hoạt tính protease được thực hiện bằng phương pháp Anson, hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret, hàm lượng acid amin bằng phương pháp Ninh drin, và thành phần EGCG bằng HPLC. Quá trình tách chiết protease khảo sát bằng các dung môi hữu cơ như acetone, ethanol, isopropanol với các tỷ lệ khác nhau và thời gian tủa từ 30 đến 150 phút. Phân tích hệ protease sử dụng sắc ký lọc gel Bio Gel P-30 và điện di SDS-PAGE để xác định kích thước protein.

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 16, kết hợp với phần mềm Design Expert 8.2 để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động protease. Timeline nghiên cứu kéo dài 6 tháng, từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa hoạt động protease trong quá trình tự phân: Hoạt tính protease đạt giá trị cao nhất tại hàm lượng trùn 13% và thời gian tự phân 6 ngày, với hoạt tính protease đạt 0,589 U/ml, tăng khoảng 10 lần so với ngày đầu tiên. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động protease là 35°C, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam.

2. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tách chiết protease: Acetone được xác định là dung môi hiệu quả nhất với tỷ lệ dịch trùn:acetone là 1:3, thời gian tủa 90 phút, đạt hiệu suất thu enzyme 51,1% và hoạt tính riêng tăng 2,5 lần so với dịch trùn ban đầu. Ethanol và isopropanol cũng cho hiệu suất thu enzyme cao nhưng thấp hơn acetone.

3. Phân tích hệ protease: Qua sắc ký lọc gel và điện di SDS-PAGE, phát hiện 3 loại protein, trong đó có 2 loại protease với kích thước dự đoán lần lượt là 35 KDa và 40 KDa.

4. Ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón cho cây trà: Lá trà bón dịch trùn tăng chiều dài lá và số lượng đọt lên 12%, hàm lượng acid amin tăng 11%, EGCG tăng 20%, và GABA tăng 9 lần so với đối chứng không bón. Điều này chứng tỏ dịch trùn có tác dụng kích thích sinh trưởng và nâng cao chất lượng lá trà.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính protease tăng cao ở hàm lượng trùn 13% và thời gian 6 ngày cho thấy sự cân bằng giữa lượng enzyme nội sinh và điều kiện tự phân tối ưu. Nhiệt độ 35°C được lựa chọn thay vì 40°C nhằm tiết kiệm năng lượng và phù hợp với điều kiện thực tế sản xuất. Việc sử dụng acetone làm dung môi tách chiết protease không chỉ nâng cao hiệu suất thu enzyme mà còn giảm chi phí và đơn giản hóa quy trình, phù hợp với sản xuất quy mô công nghiệp.

Kết quả phân tích protein bằng SDS-PAGE tương đồng với các nghiên cứu trước đây về protease trùn quế, khẳng định tính đặc hiệu và chất lượng enzyme thu nhận. Ứng dụng dịch trùn làm phân bón cho cây trà TB14 đã chứng minh hiệu quả rõ rệt về tăng trưởng và hàm lượng các hợp chất sinh học quan trọng như EGCG và GABA, góp phần nâng cao giá trị thương phẩm và sức khỏe người tiêu dùng.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính protease theo thời gian và hàm lượng trùn, biểu đồ hiệu suất thu enzyme với các dung môi khác nhau, cũng như bảng so sánh các chỉ tiêu sinh trưởng và thành phần hóa học của lá trà giữa các nghiệm thức bón phân.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình tự phân trùn quế với hàm lượng trùn 13% và thời gian 6 ngày ở nhiệt độ 35°C để thu nhận protease có hoạt tính cao, giúp nâng cao hiệu quả sản xuất dịch trùn chất lượng.

2. Sử dụng acetone với tỷ lệ dịch trùn:acetone 1:3 và thời gian tủa 90 phút trong quá trình tách chiết protease nhằm tối ưu hóa hiệu suất thu enzyme và giảm chi phí sản xuất. Chủ thể thực hiện là các cơ sở sản xuất enzyme và phân bón sinh học, thời gian áp dụng trong vòng 3-6 tháng.

3. Phát triển sản phẩm dịch trùn tự phân làm phân bón sinh học cho cây chè TB14 tại các vùng trồng chè trọng điểm như Lâm Đồng, Bảo Lộc, với mục tiêu tăng trưởng lá trà và hàm lượng các hợp chất sinh học có lợi. Thời gian triển khai từ 1-2 vụ mùa.

4. Tăng cường nghiên cứu mở rộng ứng dụng protease trùn quế trong các lĩnh vực khác như chăn nuôi, thủy sản và công nghiệp thực phẩm, nhằm khai thác tối đa tiềm năng enzyme này. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học, kế hoạch dài hạn 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về hoạt tính và tính chất protease trùn quế, phương pháp tối ưu hóa và ứng dụng enzyme trong nông nghiệp.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và phân bón sinh học: Tham khảo quy trình thu nhận protease hiệu quả, lựa chọn dung môi tách chiết phù hợp, và ứng dụng dịch trùn làm phân bón nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Nông dân và các cơ sở trồng chè, đặc biệt giống chè TB14: Áp dụng dịch trùn tự phân để cải thiện năng suất và chất lượng chè, tăng hàm lượng acid amin, EGCG và GABA trong lá trà, từ đó nâng cao giá trị kinh tế.

4. Cơ quan quản lý và phát triển nông nghiệp sạch: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng phân bón hữu cơ từ trùn quế, giảm thiểu phân hóa học, bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Protease trùn quế có đặc điểm gì nổi bật so với các nguồn protease khác?
   Protease trùn quế chủ yếu thuộc nhóm serine protease, có khả năng hoạt động ở pH trung tính đến kiềm và nhiệt độ tối ưu khoảng 55°C, thích hợp cho nhiều ứng dụng công nghiệp và nông nghiệp.

2. Tại sao acetone được chọn làm dung môi tách chiết protease hiệu quả nhất?
   Acetone cho hiệu suất thu enzyme cao nhất (51,1%) và hoạt tính riêng tăng 2,5 lần so với dịch trùn ban đầu, đồng thời chi phí thấp và quy trình đơn giản, dễ tái sử dụng.

3. Thời gian và hàm lượng trùn nào tối ưu cho quá trình tự phân để thu nhận protease?
   Hàm lượng trùn 13% và thời gian tự phân 6 ngày là điều kiện tối ưu, đạt hoạt tính protease cao nhất 0,589 U/ml, phù hợp với điều kiện sản xuất thực tế.

4. Dịch trùn tự phân có tác dụng gì khi bón cho cây chè?
   Dịch trùn giúp tăng chiều dài lá, số lượng đọt lên 12%, hàm lượng acid amin tăng 11%, EGCG tăng 20%, và GABA tăng 9 lần, cải thiện chất lượng và năng suất chè.

5. Có thể áp dụng quy trình này cho các loại cây trồng khác không?
   Có thể, tuy nhiên cần nghiên cứu thêm để điều chỉnh liều lượng và thời gian bón phù hợp với từng loại cây nhằm tối ưu hiệu quả sinh trưởng và chất lượng sản phẩm.

Kết luận

• Nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công điều kiện hoạt động protease trong quá trình tự phân trùn quế với hàm lượng trùn 13% và thời gian 6 ngày ở nhiệt độ 35°C.
• Acetone được xác định là dung môi tách chiết protease hiệu quả nhất, nâng cao hoạt tính enzyme và hiệu suất thu nhận.
• Phân tích protein cho thấy sự hiện diện của hai loại protease chính có kích thước 35 KDa và 40 KDa.
• Ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón cho cây chè TB14 giúp tăng trưởng lá, hàm lượng acid amin, EGCG và GABA, nâng cao chất lượng sản phẩm.
• Đề xuất triển khai quy trình sản xuất dịch trùn và ứng dụng phân bón sinh học trong nông nghiệp sạch, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng protease trùn quế trong các lĩnh vực khác.

Next steps: Triển khai thử nghiệm quy mô lớn tại các vùng trồng chè trọng điểm, đồng thời nghiên cứu mở rộng ứng dụng protease trong chăn nuôi và công nghiệp thực phẩm. Đề nghị các doanh nghiệp và viện nghiên cứu phối hợp phát triển sản phẩm thương mại từ kết quả nghiên cứu này.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và nông nghiệp sạch nên tiếp cận và ứng dụng quy trình tối ưu hóa protease trùn quế để nâng cao giá trị sản phẩm và phát triển bền vững.