CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN 1. Giới thiệu về cây thanh hao hoa vàng và artemisinin 1. Vài nét về cây thanh hao hoa vàng Cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.), Họ cúc (Asteraceae) là loài thảo dược, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng đồi ven suối, ven sông, ở những nước ôn đới và nhiệt đới như Trung Quốc, Mông Cổ, Iran, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ, một số nước Đông Nam Á. Cây thanh hao hoa vàng là cây thân thảo, sống trong vòng 1 năm, cao từ 1-3m; lá mọc so le, phiến lá nhẵn, dọc gân chính và thân non có lông thưa, ngắn; cụm hoa là những đầu nhỏ, tụ lại ở ngọn thân và cành; quả hình trứng, lá và hoa có mùi thơm đặc trưng, vị hơi đắng [1].
Hình 1: Cây thanh hao hoa vàng Cây thanh hao hoa vàng được người Trung Quốc phát hiện một cách tình cờ từ rất lâu. Trong cuộc khai quật khảo cổ ở miền Nam Trung Quốc, khi đào một ngôi mộ cổ, đã phát hiện bản ghi đã mờ có tên “Ngũ thập nhị bệnh phương” về một công thức trà thảo dược từ năm 168 trước Công Nguyên. Kể từ đó, người Trung Quốc đã dùng dịch chiết từ lá cây này để chữa bệnh sốt nóng. Tuy nhiên, mãi đến năm 1972, Tu Youyou, nhà khoa học Trung Quốc mới chiết được một loại tinh thể không màu 2 luan an được xem là hoạt chất chính có tác dụng trị bệnh sốt rét từ lá khô của cây thanh hao hoa vàng bằng dung môi n-hexan và gọi là qinghaosu (QHS) tên sau này là artemisinin.
Sau đó, Qinghaosu đã được phân lập từ các chồi của Artemisia annua L. ở dạng tinh khiết và cấu trúc của nó được xác định vào năm 1979 [2, 3]. Vì vậy bà đã được trao giải thưởng Nobel năm 2015 về sinh lý học và y học. Năm 1992, ở Việt Nam nhiều cơ sở cũng chiết được artemisinin từ loài cây này.
Hiện nay, cây Thanh hao hoa vàng được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc và một số tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Lâm Đồng, Long An. để nhằm đáp ứng cho nhu cầu chiết xuất artemisinin. Vài nét về artemisinin 1. Cấu trúc và tính chất vật lý của artemisinin Artemisinin (1) có tên IUPAC: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-Octahydro-3,6,9 trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-one.
Khối lượng phân tử: 282,33g/mol. ART là một lactone sesquiterpene chứa vòng lactone và cầu endoperoxide. Trong phân tử ART có năm nguyên tử oxi, trong đó hai oxi tạo thành cầu peroxide; hai oxi khác tham gia vào cấu trúc vòng lactone. ART có 7 trung tâm bất đối.
Artemisinin ở trạng thái tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị hơi đắng, tan được trong CHCl3, EtOH, ete dầu hỏa và axeton; tan ít trong n-hexane, benzene, toluene và hầu như không tan trong nước. ART bị thủy phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ cao; dễ phân hủy trong môi trường axit, bazơ [2, 3]. Dược động học Artemisinin có thể dùng uống hoặc đặt hậu môn. Sau khi uống, artemisinin hấp thu nhanh, nồng độ đỉnh đạt được trong huyết tương trong vòng 1 giờ.
Sự hấp 3 luan an thu qua trực tràng của hỗn dịch trong nước kém và thay đổi so với dùng uống hoặc tiêm bắp dung dịch dầu. Sau khi đặt hậu môn, liều 10 mg/kg ở người, nồng độ trong máu của artemisinin là 8,6 nanogam/ml sau 30 phút và đạt tới nồng độ tối đa trong máu khoảng 110 nanogam/ml 6 giờ sau khi dùng thuốc. Sau khi tiêm bắp, artemisinin hấp thu chậm hơn chút ít so với khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải là 3,85 – 5,38 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được khoảng 2 giờ sau khi dùng.
Sau khi tiêm tĩnh mạch artemisinin cho chuột, một lượng đáng kể chất này được phát hiện trong não, chứng tỏ thuốc đi qua được hàng rào máu não. Ðiều này có thể có liên quan đến tác dụng của artemisinin đối với sốt rét thể não. Artemisinin liên kết mạnh với protein huyết tương và với hồng cầu (hemoglobin). Sự liên kết với protein huyết tương ở người là 64%.
Thuốc phân bố rất rộng vào cơ thể với thể tích phân bố ở chuột cống trắng là 1,1 lít/kg. Thực nghiệm cho thấy gan là nơi chuyển hóa chính của artemisinin. Artemisinin bị thủy phân nhanh trong cơ thể thành chất chuyển hóa còn hoạt tính là dihydroartemisinin. Bốn chất chuyển hóa chính khi uống artemisinin là deoxyartemisinin, deoxydihydroartemisinin, dihydroxydihydroartemisinin và một chất được gọi là crystal-7 có thể phân lập được ở nước tiểu.
Các chất này đều không có nhóm peroxid và đều không còn hoạt tính trên ký sinh trùng sốt rét. 80% liều dùng được thải qua phân và nước tiểu trong vòng 24 giờ. Sau khi tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng và thỏ, thời gian bán thải trong huyết tương của artemisinin khoảng 30 phút, còn của dihydroartemisinin là 5-21 giờ. Chỉ một lượng rất nhỏ artemisinin được thải nguyên dạng qua nước tiểu [4].
Phương pháp sản xuất artemisinin Cho đến nay có nhiều phương pháp đã được phát triển và ứng vào việc chiết xuất artemisinin từ nguyên liệu lá thanh hao hoa vàng. Có thể tóm tắt một số phương pháp như sau. Chiết bằng n-hexan Phương pháp chiết xuất artemisinin bằng dung môi n-hexan là phương pháp truyền thống được áp dụng tại Việt Nam cũng như các nước trên thế giới ngay từ khi phát hiện ra khả năng chữa bệnh của artemisinin. Ở phương pháp này, lá thanh hao hoa vàng được phơi khô, xay thô và cho vào nồi chiết.
Dung môi chiết n-hexan 4 luan an với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, chiết ở nhiệt độ 30 -50°C, thời gian chiết trong 3 giờ, thời gian chiết khoảng 3 giờ, dịch chiết lần 3 được sử dụng làm dung môi chiết lần 1 của mẻ khác. Các dịch chiết được gộp lại, cô thu hồi dung môi rồi rút ra để kết tinh ít nhất trong 24 giờ, artemisinin sẽ kết tinh lẫn với sáp. Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng nhiệt độ và xăng công nghiệp nóng thu được artemisinin thô. Artemisinin thô đã loại hết sáp được hòa tan trong etanol sôi, thêm than hoạt tính và đun sôi trong 20 phút với sinh hàn hồi lưu.
Lọc nóng loại than hoạt tính và để kết tinh ở nhiệt độ thường tối thiểu trong 24 giờ. Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C. Phương pháp chiết siêu âm Năm 2017, Zhang và cộng sự đã dùng phương pháp chiết xuất bằng siêu âm sử dụng dụng môi propylene glycol methyl ether (PGME). Đây là dung môi không gây ô nhiễm môi trường, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp dược phẩm và mỹ phẩm.
1g bột khô cho bình 40ml chứa 20ml dung môi PGME và được tác động siêu âm dưới một công suất nhất định trong một thời gian nhất định. Cặn không hòa tan tách ra khỏi dung dịch bằng cách lọc bằng giấy lọc. Nồng độ artemisinin trong dịch lọc được xác định định lượng bằng HPLC. PGME trong dung dịch được loại bỏ trong chân không ở 60°C để thu được hỗn hợp giống như gel có chứa artemisinin, sáp,.
Sau đó metanol được thêm vào để hòa tan hỗn hợp gel đem kết tinh rồi lọc thu được artemisinin thô. Phương pháp chiết xuất siêu âm mang lại hiệu suất cao trong thời gian ngắn với chi phí năng lượng thấp, điều này khiến nó trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn có thể được sử dụng trong công nghiệp [5]. Phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn Carbon dioxide là dung môi rẻ tiền, thân thiện với môi trường. Độ hòa tan của CO2 siêu tới hạn cao hơn một đến hai bậc so với các dung môi khác, cho phép chuyển khối nhanh chóng, dẫn đến tốc độ chiết xuất lớn hơn.
Vì vậy, từ những năm 1997, Marcel Kohler và cộng sự đã thử nghiệm sử dụng CO2 siêu tới hạn để chiết artemisinin và axit artemisinic từ sáu mẫu thanh hao hoa vàng và so sánh với phương pháp thông thường. Kết quả cho thấy chiết bằng CO2 siêu tới hạn cho hiệu suất cao hơn cả các phương pháp khác [6]. Ở Việt Nam, khoảng gần mười năm sau, Phạm Thị Hiền và cộng sự cũng đã nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết CO2 siêu 5 luan an tới hạn để chiết xuất artemisinin. Kết quả cho thấy rằng, nếu phương pháp chiết Soxhlet khoảng hơn 20 giờ thì chỉ cần thời gian 2 giờ, áp suất 200bar, nhiệt độ 50˚C, sử dụng đồng dung môi n-hexan thu được hiệu suất chiết artemisinin đạt trên 80%.
Mặc dù vậy phương pháp trên lại tồn tại một số nhược điểm như dòng CO2 siêu tới hạn không có tính chọn lọc nên artemisinin sẽ bị lẫn nhiều tạp. Thêm vào đó, quy trình vận hành khó khăn, về mặt kinh tế tốn kém nhiều chi phí là một trong nhưng trở ngại của phương pháp này [7]. Phương pháp tổng hợp toàn phần Kể từ khi artemisinin được phát hiện, rất nhiều công trình tổng hợp toàn phần artemisinin đã được báo cáo. Dưới đây là công trình có tính minh họa cho tổng hợp toàn phần artemisinin (Sơ đồ 1).
Sơ đồ 1: Tổng hợp (+)-artemisinin.0 equiv), n-Bu4NOH (40% aq), Et2O: THF: 2O (3:1:3), hồi lưu, 8 giờ, 84%; c) CH3MgI, Et2O, 2 giờ, nhiệt độ phòng, 92%; d) SnCl4, benzene: Et2O (4:1), 0 oC, 65%; e) 9-BBN, 3 N NaOH, H2O2, 85%. (g) NaClO2, NaH2PO4, 0oC, 80%. (h) CH3I, K2CO3, acetone, nhiệt độ 6 luan an phòng 89%; (i) (i) O2, 30oC, 6 giờ, CH3CN, (ii) O2, Cu(OTf)2, CH3CN, 2 oC, (iii) TsOH, CH2Cl2, 4 giờ, nhiệt độ phòng, 25%. Quá trình tổng bắt đầu từ (R)-(+)-citronellal phản ứng với methyl vinyl keton (MVK) có mặt xúc tác proline và ethyl-3,4- dihydroxybenzoate làm đồng xúc tác thu được hợp chất 2.
Thực hiện phản ứng Aldol nội phân tử của 2 trong môi trường KOH trong điều kiện hồi lưu cho 3. Sau đó 3 được cho tác dụng với methyl magnesium iodide thu được đồng phân 4 và 4a. Hỗn hợp đồng phân thu được đem phản ứng với SnCl4 trong benzene-diethyl ether (4:1) cho 5. Tiếp theo, hydro hóa olefin 5 sử dụng 9-BBN tạo thành 6.
Hợp chất này thực hiện phản ứng oxi hóa Swern cho aldehyde 7 và sau đó thành axit 8 bằng cách sử dụng NaClO2 và NaH2PO4. Este hóa chất 8 với methyl iodua với sự có mặt của K2CO3 sau đó là phản ứng đóng vòng cho (+)-artemisinin (1) [8]. Sinh tổng hợp artemisinin Hình 2. Sinh tổng hợp artemisinin trong cây.
Quá trình sinh sinh tổng hợp artemisinin trong cây Artemisia annua L được tạo ra bởi quá trình quang hợp trong lục lạp thực vật được chuyển hóa acetyl-CoA 7 luan an trong dịch bào. Trước hết nhờ quá trình quang hóa, CO2 chuyển thành đường. Dưới tác dụng của coenzym acetyl-CoA và enzym farnesyl diphosphate (FPP). Chất trung gian quan trọng được hình thành: artemisininic acid và dihydro artemisininic.
Cuối cùng dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, xúc tác cho sự chuyển hóa dihydro artemisininic thành artemisinin (Hình 2) [9]. Ung thư và hoạt tính kháng ung thư của artemisinin 1.