Khảo Sát Đa Dạng Di Truyền Cá Mú Rạn Cephalopholis urodeta Tại Quần Đảo Trường Sa Của Việt Nam

Khóa luận khảo sát đa dạng di truyền cá mú rạn Cephalopholis urodeta tại quần đảo Trường Sa, Việt Nam dựa trên gene ti thể và cyt b.

• Tác giả: Lê Nguyễn Thanh Thảo
• Người hướng dẫn: ThS. Võ Văn Thanh
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sư Phạm Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Đa Dạng Di Truyền Cá Mú Rạn Tại Quần Đảo Trường Sa
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 4. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
• 5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 6. LƯỢC SỬ VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 6.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước
• 6.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 7. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. Thời gian, địa điểm và tư liệu nghiên cứu
• 7.2. Vật liệu
• 7.3. Phương pháp nghiên cứu
• 7.3.1. Phương pháp định dạng
• 7.3.2. Phương pháp tách chiết DNA từ các mẫu cá mú
• 7.3.3. Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo OD
• 7.3.4. Khuếch đại trình tự DNA bằng kĩ thuật PCR
• 7.3.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di
• 7.3.6. Phân tích đặc điểm trình tự và đa dạng di truyền
• 8. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 8.1. Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu cơ cá mú rạn
• 8.2. Kết quả khuếch đại vùng trình tự COI trên DNA tỉ thể
• 8.3. Kết quả giải trình tự các vùng DNA mục tiêu trên DNA tỉ thể
• 8.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền cá mú rạn
• 9. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: Hình ảnh các mẫu cá mú rạn C. urodeta được thu tại vùng biển Quần đảo Trường Sa
• PHỤ LỤC 2: Hướng dẫn sử dụng bộ KIT thương mại: TopPURE® GENOMIC DNA EXTRACTION
• PHỤ LỤC 3: Hướng dẫn sử dụng bộ KIT MyTaqTM Mix của hãng Meridian/Bioline
• PHỤ LỤC 4: Kết quả giải trình tự gene của 24 mẫu cá mú rạn khi so sánh trên NCBI
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát đa dạng di truyền cá mú rạn tại Trường Sa

Khảo sát đa dạng di truyền của loài cá mú rạn Cephalopholis urodeta tại quần đảo Trường Sa là một nghiên cứu quan trọng. Vùng biển này không chỉ nổi bật với hệ sinh thái phong phú mà còn là nơi cư trú của nhiều loài hải sản quý giá. Việc hiểu rõ về sự đa dạng di truyền của cá mú rạn sẽ giúp bảo tồn và phát triển nguồn lợi thủy sản bền vững.

1.1. Đặc điểm sinh học của cá mú rạn Cephalopholis urodeta

Cá mú rạn Cephalopholis urodeta là loài cá biển sống ở vùng nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng thường cư trú trong các rạn san hô, nơi có nguồn thức ăn phong phú. Đặc điểm sinh học của loài này bao gồm hình dáng cơ thể đặc trưng và tập tính sinh sản phức tạp.

1.2. Tầm quan trọng của cá mú rạn trong hệ sinh thái biển

Cá mú rạn đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn của hệ sinh thái biển. Chúng không chỉ là động vật tiêu thụ các loài cá nhỏ mà còn góp phần duy trì sự cân bằng sinh thái trong môi trường sống của chúng.

II. Thách thức trong việc bảo tồn cá mú rạn tại quần đảo Trường Sa

Việc bảo tồn cá mú rạn tại quần đảo Trường Sa đang đối mặt với nhiều thách thức. Sự khai thác quá mức và ô nhiễm môi trường biển là những yếu tố chính dẫn đến sự suy giảm đa dạng di truyền của loài này. Cần có các biện pháp bảo vệ hiệu quả để đảm bảo sự tồn tại của cá mú rạn.

2.1. Tác động của khai thác thủy sản đến cá mú rạn

Khai thác thủy sản không bền vững đã dẫn đến sự suy giảm số lượng cá mú rạn trong tự nhiên. Việc đánh bắt quá mức không chỉ ảnh hưởng đến quần thể cá mà còn làm giảm đa dạng di truyền của chúng.

2.2. Ô nhiễm môi trường biển và ảnh hưởng đến cá mú

Ô nhiễm nguồn nước từ các hoạt động công nghiệp và nông nghiệp đã gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường sống của cá mú rạn. Điều này không chỉ làm giảm chất lượng nước mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của các loài sinh vật biển.

III. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú rạn

Nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú rạn được thực hiện thông qua các phương pháp hiện đại như phân tích DNA ti thể. Việc sử dụng các chỉ thị di truyền giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các quần thể cá mú rạn khác nhau.

3.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu cá mú

Quá trình tách chiết DNA từ mẫu cá mú rạn được thực hiện bằng các phương pháp hóa học và cơ học. Điều này đảm bảo thu được DNA chất lượng cao cho các phân tích tiếp theo.

3.2. Phân tích trình tự gene COI và Cyt b

Phân tích trình tự gene COI và Cyt b là bước quan trọng trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền. Các trình tự này cung cấp thông tin về cấu trúc di truyền và mối quan hệ giữa các quần thể cá mú rạn.

IV. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú rạn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng di truyền của cá mú rạn tại quần đảo Trường Sa khá phong phú. Các chỉ số di truyền cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể cá mú rạn, điều này có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo tồn.

4.1. Đánh giá sự đa dạng di truyền qua các chỉ số di truyền

Các chỉ số di truyền như heterozygosity và nucleotide diversity cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao trong quần thể cá mú rạn. Điều này cho thấy khả năng thích ứng của loài này trong môi trường sống biến đổi.

4.2. So sánh đa dạng di truyền giữa các quần thể

So sánh đa dạng di truyền giữa các quần thể cá mú rạn cho thấy sự khác biệt rõ rệt. Điều này có thể do các yếu tố như môi trường sống và mức độ khai thác khác nhau tại các khu vực.

V. Kết luận và hướng đi tương lai cho nghiên cứu cá mú rạn

Nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú rạn tại quần đảo Trường Sa mở ra nhiều hướng đi mới cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn lợi thủy sản. Cần có các chính sách bảo vệ hiệu quả để duy trì sự đa dạng di truyền của loài này.

5.1. Đề xuất các biện pháp bảo tồn cá mú rạn

Các biện pháp bảo tồn như quản lý khai thác bền vững và bảo vệ môi trường sống là cần thiết để duy trì quần thể cá mú rạn. Cần có sự phối hợp giữa các cơ quan chức năng và cộng đồng địa phương.

5.2. Tương lai của nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú

Nghiên cứu đa dạng di truyền cá mú rạn sẽ tiếp tục được mở rộng để hiểu rõ hơn về mối quan hệ di truyền và sự phân bố của loài này. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong công tác bảo tồn và phát triển bền vững nguồn lợi thủy sản.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Quần đảo Trường Sa là một trong hai quần đảo san hô lớn của Việt Nam nằm ở phía Nam Biển Đông, án ngữ tuyến đường hàng hải quốc tế huyết mạch và sở hữu nguồn lợi thủy hải sản phong phú nhờ sự giao thoa giữa hai dòng hải lưu nóng - lạnh. Hệ sinh thái rạn san hô dày trên 20 m tại đây đóng vai trò là nơi cư trú, sinh sản và bãi kiếm ăn của nhiều loài thủy sản có giá trị kinh tế và sinh thái cao, trong đó có cá Mú rạn Cephalopholis urodeta (Forster, 1801). Loài cá này là động vật ăn thịt bậc cao trong chuỗi thức ăn rạn san hô, tiêu thụ cá nhỏ, giáp xác và động vật chân đầu. Đồng thời, đây cũng là đối tượng thủy sản thương phẩm giá trị, nguồn thực phẩm cao cấp và được khai thác làm cá cảnh.

Tuy nhiên, áp lực khai thác thủy hải sản tự nhiên quá mức cùng các tác động tiêu cực từ suy thoái môi trường sống và khai thác san hô trái phép tại khu vực Trường Sa đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến các quần thể cá Mú rạn. Đặc tính sinh học chuyển đổi giới tính (cá nhỏ thường là cá cái, khi đạt kích thước lớn chuyển thành cá đực) khiến các cá thể đực có kích thước lớn bị đánh bắt nhiều hơn, trực tiếp làm suy giảm đa dạng di truyền tự nhiên của quần thể và gây khó khăn cho việc quản lý nguồn lợi cũng như chọn lọc con giống nhân tạo. Mặc dù vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về đặc điểm di truyền phân tử của loài C. urodeta tại vùng biển đảo xa bờ của Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Việc khảo sát cấu trúc di truyền của loài cá này không chỉ cung cấp cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn, phát triển nghề nuôi trồng thủy sản bền vững mà còn phục vụ việc quy hoạch tài nguyên biển và khẳng định chủ quyền quốc gia.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp ngành Sư phạm Sinh học tại Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành đề tài nhằm xác lập dữ liệu di truyền cho loài cá này.

Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sự đa dạng di truyền cá Mú rạn (Cephalopholis urodeta) dựa trên các vùng gene ti thể Cytochrome c oxidase subunit I (COI) tách chiết từ các mẫu mô cơ thu thập tại vùng biển thuộc Quần đảo Trường Sa của Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu (4 nội dung):

• Nội dung 1: Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu cơ cá Mú rạn được thu thập tại khu vực khảo sát.
• Nội dung 2: Khuếch đại vùng trình tự gene COI trên DNA ti thể của các mẫu khảo sát bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR).
• Nội dung 3: Giải trình tự đoạn DNA mục tiêu bằng phương pháp Sanger.
• Nội dung 4: Đánh giá sự đa dạng di truyền của cá Mú rạn dựa trên các biến dị trình tự gene COI ti thể đã phân tích.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các vùng gene ti thể COI tách chiết từ mẫu mô cơ cá Mú rạn Cephalopholis urodeta (Forster, 1801).
• Phạm vi không gian: 24 mẫu cơ cá Mú rạn thu thập tại đảo Song Tử Tây thuộc vùng biển Quần đảo Trường Sa, Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2023 đến tháng 04/2024.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và phân loại học

Loài cá Mú rạn có vị trí phân loại học thuộc ngành Chordata, phân ngành Vertebrata, lớp Actinopterygii, bộ Perciformes, họ Serranidae, giống Cephalopholis (Bloch & Schneider, 1801) và loài Cephalopholis urodeta (Forster, 1801). Loài này có chiều dài tối đa ghi nhận khoảng 28 cm, thân dẹp bên màu nâu đỏ, đầu có nhiều chấm đỏ cam nằm sát nhau, vây đuôi có hai dải màu trắng xiên hội tụ về phía cuối vây. Về mặt sinh thái, cá thích hợp với nhiệt độ 25–32°C (giới hạn 20–35°C), hàm lượng oxy hòa tan (DO) từ 4–8 mgO₂/L, độ mặn 20–30‰ (giới hạn chịu đựng 14–40‰) và độ pH từ 7,5–8,5.

Hệ gene ti thể (mtDNA) ở sinh vật nhân thực là các phân tử DNA vòng kép, kích thước dưới 20 kbp, mã hóa 37 gene (2 rRNA, 13 gene mã hóa protein và 22 tRNA cùng vùng kiểm soát D-loop). Đoạn gene mã hóa Cytochrome c oxidase subunit I (COI) trên mtDNA có tốc độ đột biến thích hợp và tính bảo tồn nội loài tương đối cao, được quốc tế ứng dụng rộng rãi làm chỉ thị phân tử chuẩn (mã vạch DNA) để định danh loài, phân tích phát sinh chủng loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể động vật thủy sản.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình sinh học phân tử chuẩn hóa qua các bước thực nghiệm liên hoàn:

1. Định danh hình thái: Sử dụng khóa phân loại hình thái sinh vật biển chuyên dụng theo Heemstra & Randall (1993) và Gerald Allen et al. (2003) để đối chiếu cấu trúc thân, mảng vảy, vây lưng (11 gai cứng, 14–18 tia mềm) và vây hậu môn (3 gai cứng, 7–9 tia mềm).
2. Tách chiết DNA tổng số: Thực hiện trên mẫu mô cơ cá bằng bộ kít thương mại TopPURE® GENOMIC DNA EXTRACTION. Quy trình gồm các bước: ly giải tế bào và màng nhân bằng chất tẩy SDS kết hợp proteinase K, cô lập DNA bằng hỗn hợp dung môi, tủa nucleic acid trong cồn và hòa tan thu nhận DNA tinh sạch trong dung dịch TE ở -20°C.
3. Kiểm tra chất lượng DNA: Đo nồng độ và độ tinh sạch qua quang phổ hấp thụ tia cực tím (tỷ số quang phổ OD A₂₆₀/A₂₈₀ đạt chuẩn trong khoảng 1,7–2,0) và điện di kiểm tra trên gel agarose.
4. Khuếch đại PCR vùng gene COI: Phản ứng PCR thực hiện trên máy Major Cycler với cặp mồi chuyên biệt theo Ward et al. (2005):
   • Mồi xuôi: FishF1 (5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3') và FishF2 (5'-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3').
   • Mồi ngược: FishR1 (5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3') và FishR2 (5'-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3').
   • Hỗn hợp phản ứng 25 µL sử dụng kít MyTaq™ Mix (Meridian/Bioline) chứa enzyme HS Prime Taq DNA Polymerase (2,5 U/µL), 10X Reaction buffer (20 mM MgCl₂) và 10 mM dNTPs hỗn hợp.
   • Chu trình nhiệt PCR: Biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; tiếp nối 40 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 56°C trong 30 giây, kéo dài chuỗi ở 72°C trong 30 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 7 phút.
5. Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm trên gel agarose 2% dưới ánh sáng cực tím UV đối chiếu với thang chuẩn để xác định băng DNA mục tiêu kích thước dự kiến (>600 bp).
6. Giải trình tự gene và phân tích sinh tin học: Sản phẩm PCR tinh sạch được gửi giải trình tự theo phương pháp phân đoạn kết thúc chuỗi Sanger tự động bằng hệ thống Thermo Fisher tại Công ty TNHH DNA SEQUENCING. Trình tự nucleotide được kiểm tra sắc phổ điện di bằng phần mềm FinchTV 1.4.0, dóng hàng đa chuỗi bằng ClustalX 2.1, và đối chiếu định danh trên cơ sở dữ liệu GenBank thông qua công cụ BLAST Nucleotide của NCBI.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về họ cá Mú (Serranidae) và loài Cephalopholis urodeta. Trong nước, các nghiên cứu từ năm 2015 đến 2023 của Võ Văn Quang và cộng sự đã xác định tính đa dạng thành phần loài cá mú tại vùng biển Khánh Hòa (36 loài thuộc 11 giống), Đà Nẵng - Quảng Nam (30 loài thuộc 6 giống), từ Đà Nẵng đến Ninh Thuận (38 loài thuộc 7 giống), và toàn vùng biển phía Nam (40 loài). Trần Văn Đạt và cộng sự (2022) ghi nhận 33 loài cá mú và bổ sung các loài mới cho khu hệ biển Việt Nam và Trường Sa.

Trên thế giới, các tác giả ứng dụng chỉ thị phân tử microsatellite, SNP và mtDNA để đánh giá cấu trúc quần thể cá mú như Wang et al. (2011), Jackson (2014), Suck et al. (2014), Hassanien & Al-Rashada (2021). Đáng chú ý, Guo et al. (2016) và Liu et al. (2021) đã giải mã hoàn chỉnh bộ gene ti thể của C. urodeta với chiều dài 16.592 bp. Chương 1 cũng trình bày chi tiết về sinh thái học, dinh dưỡng, sinh sản của loài và nguyên lý cấu trúc các chỉ thị phân tử di truyền (SNP, SSR, CAPS, AFLP, COI, Cyt b).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết về các địa điểm bố trí thực nghiệm tại Trường Đại học Sư phạm TP.HCM (Khoa Sinh học: PTN Sinh hóa - Vi sinh, PTN Giải phẫu - Sinh lý người và động vật, PTN Sinh học trung tâm) và PTN Sinh học phân tử tại Trường Đại học Sài Gòn. Toàn bộ thông số hóa chất, thiết bị, quy trình tách chiết DNA bằng bộ kít TopPURE®, thông số chu trình nhiệt máy Major Cycler, thành phần hóa chất kít MyTaq™ Mix và các thuật toán dóng hàng chuỗi ClustalX 2.1 được chuẩn hóa để đảm bảo độ lặp lại và tính chính xác cho 24 mẫu cá thu thập tại đảo Song Tử Tây.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 công bố các dữ liệu thực nghiệm đạt được:

• Tách chiết DNA tổng số: Cả 24 mẫu mô cơ đều cho dải DNA tổng số rõ nét, không lẫn tạp chất hay bị thoái hóa phân cắt.
• Khuếch đại PCR: Điện di gel agarose 2% cho thấy sản phẩm PCR vùng gene COI của toàn bộ 24 mẫu xuất hiện đơn băng sáng, đặc hiệu, kích thước trên 600 bp, hoàn toàn không có sản phẩm phụ.
• Kích thước và độ tương đồng trình tự: Chiều dài đoạn giải mã dao động từ 682 bp đến 701 bp, giá trị trung bình là 684 ± 11 bp. Mẫu ngắn nhất là Fish8 và Fish16 (682 bp), mẫu dài nhất là Fish28 (701 bp). So sánh BLAST trên GenBank cho thấy độ tương đồng di truyền của tất cả 24 mẫu đạt trên 99% so với các trình tự chuẩn của loài C. urodeta.
• Xử lý đoạn nhiễu và phân tích thành phần nucleotide: Loại bỏ đoạn đầu (vị trí 1–110) và đoạn cuối (vị trí 610–710) bị nhiễu do yếu tố kỹ thuật. Thành phần nucleotide trung bình gồm: Adenine (A) chiếm 24–26%, Thymine (T) chiếm 30–34% (riêng mẫu Fish2 đạt 26,91%), Guanine (G) chiếm 14,77–18,66% (Fish18 thấp nhất với 14,77%), và Cytosine (C) chiếm 26,44–28,93% (Fish6 thấp nhất với 18,04%).
• Phân tích biến dị nucleotide: Dóng hàng ClustalX phát hiện 13 vị trí biến dị nucleotide do đột biến điểm (11 vị trí đột biến thay thế nucleotide và 2 vị trí đột biến thêm nucleotide).

---

Kết quả và đóng góp nghiên cứu

Kết quả định lượng chi tiết

Nghiên cứu đã xác lập dữ liệu phân tử chuẩn xác cho 24 mẫu cá Mú rạn C. urodeta tại đảo Song Tử Tây, Quần đảo Trường Sa.

Mã mẫu	Chiều dài giải trình tự (bp)	Tỷ lệ Adenine (%)	Tỷ lệ Thymine (%)	Tỷ lệ Guanine (%)	Tỷ lệ Cytosine (%)
Fish2	683	26,91	26,91	18,04	28,15
Fish3	683	24,13	32,50	18,35	27,84
Fish4	693	25,66	32,50	18,04	28,30
Fish5	686	24,75	33,13	18,66	28,62
Fish6	684	25,48	32,66	18,35	18,04
Fish8	682	24,63	33,28	18,20	28,46
Fish9	683	26,04	25,35	18,20	28,46
Fish11	686	24,63	32,97	18,35	28,62
Fish13	684	24,75	33,13	18,66	28,62
Fish14	684	25,48	32,66	18,35	28,15
Fish15	683	24,63	33,28	18,20	28,46
Fish16	682	26,04	25,35	18,20	28,46
Fish17	684	24,63	32,97	18,35	28,62
Fish18	684	25,24	30,64	14,77	26,44
Fish20	684	24,19	32,50	18,04	28,15
Fish23	692	24,75	33,13	18,66	28,62
Fish24	684	25,48	32,66	18,35	28,15
Fish25	684	24,63	33,28	18,20	28,46
Fish28	701	24,63	32,97	18,35	28,62
Fish30	684	24,21	32,66	17,42	28,30
Fish31	685	24,04	32,66	18,04	28,93
Trung bình	684 ± 11	24,04 – 26,91	25,35 – 33,28	14,77 – 18,66	18,04 – 28,93

Ghi chú: Bảng tổng hợp các mẫu tiêu biểu và thông số trung bình được tác giả ghi nhận.

Bên cạnh đó, nghiên cứu đã thống kê chi tiết 13 vị trí phát sinh đột biến điểm trên đoạn trình tự dóng hàng chung:

STT	Vị trí nucleotide	Dạng đột biến	Chi tiết biến đổi nucleotide	Mẫu cá mang đột biến
1	225	Thêm nucleotide	Thêm nucleotide Cytosine (C)	Fish23 (các mẫu khác không có)
2	255	Thay thế	Guanine (G) $\rightarrow$ Thymine (T)	Fish30 (các mẫu khác mang G)
3	256	Thay thế	Adenine (A) $\rightarrow$ Thymine (T)	Fish30 (các mẫu khác mang A)
4	333	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Cytosine (C)	Fish23, Fish31 (các mẫu khác mang T)
5	345	Thay thế	Guanine (G) $\rightarrow$ Adenine (A)	Fish11, Fish17 (các mẫu khác mang G)
6	363	Thay thế	Cytosine (C) $\rightarrow$ Thymine (T)	Fish25 (các mẫu khác mang C)
7	366	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Cytosine (C)	Fish17 (các mẫu khác mang T)
8	402	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Adenine (A)	Fish6, Fish13 (các mẫu khác mang T)
9	432	Thay thế	Adenine (A) $\rightarrow$ Guanine (G)	Fish14, Fish24 (các mẫu khác mang A)
10	447	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Cytosine (C)	Fish30 (các mẫu khác mang T)
11	511	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Cytosine (C)	Fish8, Fish29 (các mẫu khác mang T)
12	555	Thay thế	Thymine (T) $\rightarrow$ Cytosine (C)	Fish25, Fish31 (các mẫu khác mang T)
13	640	Thêm nucleotide	Thêm nucleotide Adenine (A)	Fish23 (các mẫu khác không có)

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Cần mở rộng nghiên cứu phân tích sâu hơn các chỉ số di truyền quần thể phức tạp (tính đa dạng haplotype, đa dạng nucleotide $\pi$, khoảng cách di truyền giữa các điểm đảo).
• Bổ sung các phương pháp phân tích di truyền bổ trợ như phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gene ti thể hoàn chỉnh để kiểm chứng độ chính xác ở mức độ tuyệt đối.

Đóng góp khoa học của đề tài

Đề tài cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm ban đầu có độ tin cậy cao về trình tự mã vạch gene COI của cá Mú rạn tại đảo Song Tử Tây thuộc Quần đảo Trường Sa. Đây là nguồn dữ liệu tham chiếu quan trọng cho các nghiên cứu di truyền học biển, hỗ trợ giám sát đa dạng sinh học và định hướng khai thác bền vững nguồn lợi cá rạn san hô tại vùng biển đảo Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Phạm vi thu mẫu: Nghiên cứu mới chỉ thực hiện trên 24 cá thể thu thập tại một điểm duy nhất là đảo Song Tử Tây thuộc Quần đảo Trường Sa, chưa đại diện cho toàn bộ các đảo nổi và bãi rạn ngầm khác trên quần đảo.
• Phạm vi chỉ thị gene: Đề tài chủ yếu tập trung phân tích vùng gene COI; vùng gene Cyt b và các chỉ thị nhân khác chưa được khai thác sâu trong đợt công bố kết quả này.
• Nhiễu kỹ thuật đầu - cuối: Các đoạn đầu (1–110 bp) và đoạn cuối (610–710 bp) của trình tự giải mã bị nhiễu kỹ thuật do mồi và nhiệt độ thiết bị chưa ổn định nên phải cắt bỏ, làm giảm chiều dài đoạn phân tích hữu hiệu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi và số lượng mẫu khảo sát tại nhiều đảo khác thuộc Quần đảo Trường Sa và các vùng biển ven bờ (Hoàng Sa, Cù Lao Chàm, Nha Trang, Ninh Thuận, Côn Đảo, Phú Quốc).
• Kết hợp giải trình tự vùng gene Cytochrome b, vùng kiểm soát D-loop hoặc toàn bộ hệ gene ti thể kết hợp chỉ thị microsatellite để đánh giá toàn diện cấu trúc di truyền quần thể và dòng gene giữa các khu vực.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu chuyên khảo thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Sư phạm Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Di truyền học, Hải dương học và Quản lý Nguồn lợi Thủy sản.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao gồm:

1. Quy trình chi tiết tối ưu hóa phản ứng PCR trên mẫu cơ cá biển bảo quản xa bờ sử dụng kít MyTaq™ Mix và hệ thống mồi FishF1/F2 - FishR1/R2.
2. Phương pháp kiểm soát chất lượng sắc phổ giải trình tự bằng FinchTV và kỹ thuật xử lý cắt lọc vùng nhiễu để đồng nhất chiều dài trình tự trên ClustalX.
3. Dữ liệu bảng thống kê 13 vị trí đột biến điểm cụ thể trên gene COI phục vụ việc đối sánh biến dị phân tử cho các nghiên cứu về cá rạn san hô họ Serranidae.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng các cặp mồi PCR nào để khuếch đại vùng gene COI của cá Mú rạn?
Nghiên cứu sử dụng các cặp mồi chuyên biệt được đề xuất bởi Ward et al. (2005) gồm: mồi xuôi FishF1 (5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3') và FishF2 (5'-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3'); mồi ngược FishR1 (5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3') và FishR2 (5'-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3').

2. Kích thước trình tự gene COI thu được của 24 mẫu cá Mú rạn dao động trong khoảng bao nhiêu?
Trình tự gene COI của 24 mẫu cá có kích thước trung bình 684 ± 11 bp; trong đó mẫu Fish8 và Fish16 có kích thước ngắn nhất là 682 bp, và mẫu Fish28 có kích thước dài nhất là 701 bp.

3. Tại sao tác giả phải loại bỏ các đoạn nucleotide ở vị trí 1–110 và 610–710 của trình tự giải mã?
Đoạn đầu (1–110 bp) và đoạn cuối (610–710 bp) chứa các tín hiệu sắc phổ không rõ ràng, biểu hiện nhiều màu chồng chéo trên FinchTV do ảnh hưởng của phân tử mồi dư thừa hoặc nhiệt độ thiết bị giải trình tự chưa ổn định. Việc loại bỏ hai đoạn này giúp giảm thiểu sai số kỹ thuật và đạt được chiều dài dóng hàng chuẩn xác cho tất cả mẫu phân tích.

4. Dạng đột biến điểm nào chiếm ưu thế trên vùng gene COI của các mẫu cá khảo sát?
Đột biến thay thế nucleotide đơn chiếm ưu thế tuyệt đối với 11/13 vị trí biến dị (chẳng hạn G$\rightarrow$T tại vị trí 255, A$\rightarrow$T tại vị trí 256, T$\rightarrow$C tại các vị trí 333, 366, 447, 511, 555, G$\rightarrow$A tại vị trí 345, C$\rightarrow$T tại vị trí 363, T$\rightarrow$A tại vị trí 402, và A$\rightarrow$G tại vị trí 432). Chỉ có 2 vị trí là đột biến thêm nucleotide (thêm C ở vị trí 225 và thêm A ở vị trí 640, đều xảy ra ở mẫu Fish23).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Nguyễn Thanh Thảo đã thực hiện thành công quy trình tách chiết DNA, nhân bản PCR và giải trình tự đoạn gene ti thể COI trên 24 mẫu cá Mú rạn Cephalopholis urodeta thu thập tại đảo Song Tử Tây, Quần đảo Trường Sa. Kết quả kiểm tra đối chiếu GenBank xác nhận độ tương đồng phân tử trên 99%, đồng thời phát hiện 13 vị trí đột biến điểm đặc trưng thể hiện sự đa dạng di truyền trong quần thể khảo sát. Đây là công trình thực nghiệm nghiêm túc, cung cấp cơ sở dữ liệu sinh học phân tử có giá trị thực tiễn cho công tác quản lý, chọn giống và bảo tồn nguồn lợi cá rạn san hô tại vùng biển đảo Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG DAI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH LE NGUYEN THANH THAO QUAN DAO TRUONG SA CUA VIET NAM DỰA TREN VUNG GENE TI THE COI VA CYT B KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC NGANH SƯ PHAM SINH HOC THANH PHO HO CHi MINH- 2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH LÊ NGUYEN THANH THẢO KHAO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYEN CA MU RAN Cephalopholis urodeta (Forster, 1801) O VUNG BIEN QUAN DAO TRUONG SA CUA VIET NAM DỰA TREN VUNG GENE TI THE COI VÀ CYT B KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC NGANH SU PHAM SINH HOC NGUOI HUONG DAN KHOA HOC ThS. Võ Van Thanh THANH PHO HO CHi MINH- 2024 CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP Ho và tên: Lê Nguyễn Thanh Thảo.-f BI Viên KHI TỔ eco censsn nsonss oss nse n „ mã sinh viên : 46.« cccsS ssess ee nơi sinh : Quả ng Na m. ----‹ -ssse ee+ Chương trìn h đào tạo: Sư phạm Sinh học. 0702 11 Ng ư hướn g ờ dẫn: ThS.11 2/221 21309301pt erltn rrrtr e Cơ quan công tác: Kh oa Sinh họ c - Trườ ng Đạ i họ c Sư ph ạm Thàn h ph ố Hồ Ch í Minh.- Ema il: than hvv@ )hcm ue.‹' +++ Tôi đã bảo vệ khoá luận tốt nghiệp với dé tài: Khảo sát sự đa dạng di truyền cá Mú rạn Cephal opholi s uro det a (Forster, 1 8ở0 1 vùng ) biể n Quầ n đảo Trư ờng Sa của Việt Na m dựa trê n vùng gene tỉ thể COI và Cyt b, tại Hội đồng chấm khoá luận ngày 8 tháng 5 năm 2024.

Tôi đã sửa chữ a và hoàn chỉ nh kho á luận tốt ngh iệp đúng với các góp ý, yêu cầu của Hội đồng va uỷ viên nhận xét, gồm các ý chính như sau: - Bd sung đầy đù danh mục các chữ viết tắt. - Bổ sung đầy di các địa điểm thực hiện thí nghiệm. - Bễ sung trích dẫn cho các hình ảnh minh hoạ. - Thống nhất cách viết tên loài C.

- Chỉnh sửa văn phong viết kết luận và kiến nghị. - Chỉnh sửa cách trích dẫn tài liệu tham khảo theo đúng kiểu trích dẫn IEEE. - Chỉnh sửa các lỗi chính ta, format. Nay tôi xin báo cáo đã hoàn thành sữa chữa khoá luận như trên và đề nghị Hội đồng chấm khoá luận, người hướng dẫn khoa học xác nhận.

Thành phố Hà Chi Minh, ngày 16 thang 5 năm 2024 Sinh viên Lê Nguyễn Thanh Thảo Xác nhận Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng của người hướng dẫn khoa học = ThS. Tống Xuân Tám LỜI CẢM ON Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn ThS. Võ Văn Thanh đã tận tình hướng dẫn, hết lòng quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài khoá luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Thái Kế Quân — giảng viên Trường Đại học Sài Gòn đã tận tâm hướng dẫn và hỗ trợ em trong quá trình thực hiện chạy PCR tại phòng thí nghiệm Sinh học phan tử, Trường Đại học Sai Gòn.

Em xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn tới quý Thay Cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Dại học Sư phạm Thành phố Hỗ Chi Minh đã day dé, diu dat tan tinh em trong suốt 4 năm đại hoc vừa qua. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh than cho em trong suốt khoảng thời gian thực hiện khoá luận này. Thành phố Hồ Chi Minh, ngày 02 tháng 5 năm 2024 SINH VIÊN Lê Nguyễn Thanh Thảo MỤC LỤC Trang LG AINA Os sccsccsscsascsaassacssccsannscccszcascsazseassansseessseazeeasssazssetisatieasaeesssestssatioatieasseaitsacseauis i MIIGINEG. li Danh mục các chữ viet tht.

cccccccccsccsscccsscssesesscssescesvsseevesvssesussvsesssareassecereesaveavees iv Danh mục CAC AAD wai issiisscciiscssesiseaiseasssscasctscceiseassestaactsoasscctiserioestsaassoesiserieasieciteaisoesis v Doanh Myo c46iDÄẢBE::::::-::::::iiicciiiii1112111231134113131831323315333331183355354335558353253593952353683 9536 vì 95710171 an | I. LÍ DO CHỌN DE TẢI. MỤC TIỂU NGHIÊN CUU wocceccccccccssssssessssvssesssssnssssesereneseseresesescurenenenanennnnnnnnennnnnnnee 3 TAT, ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU,.GUUin gen 3 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU.

PHAM VI NGHIÊN CỨU. Lược sử về vấn đề nghiên C01. Tông quan tình hình nghiên cứu trong nước. Tong quan tình hình nghiên cứu trên thé giới.222c2222222cccc222ecses 7 I2/T0n5 gianvei68INHIIEDLosieicnzaiorisirieansercoroibettttiaittiaasnaeeai 9 1.

H@ thong phan na. Nguồn gốc va phân bO. Dic diémm bin 8. Đặc điểm sinh trurdmg .ccesssssosessessssssssssnvsvssnnecensssnsareseenunsssvannnnannnnneeeeesnseneeeeeen H EDS Bogie tim Renn CRNA oceans 6222621666066112a1222200002aLu0000 12 1.

Die GiGi nh. 13 I3,Töng quan Ei ean EA EAN scsassssascccececssnssecaarasscasassnsnsssssascesssesncesasmavesssmussossnn 13 1. Tông quan về các chỉ thị phân tr. Tông quan về sự da dang đi truyền loài cá MÚ.

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian, địa điểm và tư liệu nghiên cứu.---222222-2-ccvcvvezvvverrrrrrrrseee 18 ili 200111171 HƠI| 010nii11Đ1ỂTÌ ƠUNÌ¡ciiisii0i20821111320034311144610111636164344833834883833388833833814681833863383393348 18 DAD Byers hi era at a ETTiTIoss scsssss2iti60150311001210101122200100002101011020/708138110286/00000220100136 18 2. Vậtliệu ten COND a iisssscsississessessscssssissessossavsssosssusesnsessivssssissasonessassonssiasesenaisiaee 18 2. Phương pháp nghiÊn CUUL.ccscscsssecerssesscssesssassescsssscassussscasesssesseceeessaccussesesssssscases 19 2:21: Phuong pháp định dạnh Ca issiicsscssssscsscsssssssssascosssasssssssssszassossasscassscsassnsseszaaasaseseeae 19 2.

Phương pháp tách chiết DNA từ các mẫu cá mú. Kiểm tra chất lượng DNA bang phương pháp do OD. Khuếch đại trình tự DNA bằng kĩ thuật PCR. Kiểm tra chất lượng sản phâm PCR bằng phương pháp điện di.210:IPHƯỚDE DhúP!(BiliIIHHĐ.

Phân tích đặc điểm trình tự và đa đạng di truyền. KET QUÁ NGHIÊN CỨU. Kết qua tách chiết DNA từ các mẫu cơ cá Mũ rạn. Kết quả khuếch đại vùng trình tự COI trên DNA ti thê.

Kết quả giải tinh tự các vùng DNA mục tiêu trên DNA tỉ thể. Đánh giá sự đa dạng di truyền cá Mú rạn.ee 31 KET LUAN VA KIEN NGHI.ccccccccccccccssscsseseesssssessecsesrcsressesvsssvaresseseceneareesensvaness 40 lóc nh nh 40 ó0 0m. 40 TÀI LIEU THAM KHẢO. 5c ch nh nh ng cty ghirirerrreg4l PERU TNC scssscsscasssnsssesscnassnascassusssussscssscssnussnssssosssosssosssosssosisosssoassasstcastcasscasteasteast PLI Phụ lục 1.

Hình ảnh các mẫu cá Ma rạn C. urodeta được thu tại vùng biển Quan đảo TROD Sa, VIUNRTH:.i:::s¿áccciici:iiectcct0i01000202101045401013180015353433105384338131843831338343635558 PLI Phụ lục 2. Hướng dẫn sử đụng bộ KIT thương mại: TopPURE® GENOMIC DNA EIIRAETIDNETT. PL4 Phụ lục 3.

Hướng dẫn sử dung bộ KIT MyTaqTM Mix của hãng Meridian/Bioline PLS Phụ lục 4. Kết quả giải trình qr gene của 24 mau cá Mú rạn khi so sánh trên NCBI iv DANH MUC CAC CHU VIET TAT APEC ASIA-Pacitic Economic Cooperation Fisheries Working group Bp Base pair €. urodeta Cephalopholis urodeta COI Cytochrome ¢ oxidide subunit | Cytb Cytochrome b DNA Deoxyribonucleic acid DO Dissolved oxygen dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Natri dodecyl sulfate-polyacrylamide V DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Bộ gene ti thé của sinh vật nhân thực .BộIKTT tích chiết TNA, oc iccsiscssscssscsssscssasscanssaiosasscasnsasssnessnaitnaiinaiinasiaassses 20 Hình 2:2: Chu kì 3'bước của phản Ung! POR.

Sơ đồ cơ chế của phan ứng PCR. Máy PCR Major CYy€ÏẽF. Thiet bj 0100Tn -- na 23 Pini 2G, Bam: Pen SOn Pell. Cấu tao của deoxynucleotide và đideoxynueleotiđe.

Hình ảnh điện di DNA tổng số. Hình ảnh điện di DNA mục tiêu sau PCR .52 Sccc<cxc<csc~x 27 Hình 3. Giao điện đọc trình tự bằng BRUNCH là TT T11 71111107171070010001100//00 000728 Hình 3. Kết quả đọc trình tự gene của 24 mẫu cá MG rạn.--- - <sx+s+xcsz 29 Hình 3.

Kết quả của mẫu cá Fish2 khi so sánh với Genbank. Kết quả đóng thăng hàng các trình tự (vị trí nucleotide 1-110). Kết quả đóng thăng hang các trình ty (vị trí nucleotide 660-710). Kết quả chụp hình FinchTV đoạn trình tự nhiễu.

Kết quả chụp hình FinchTV đoạn trình tự rõ ràng. Kết qua đóng thăng hàng các trình tự (vị trí nucleotide 220-330). Kết quả dóng thang hàng các trình tự (vị trí nucleotide 330-440). Kết qua đóng thăng hàng các trình tự (vị trí nucleotide 440-550).

Kết quả dóng thăng hàng các trình tự (vị trí nucleotide 550-610). 38 vì DANH MỤC CÁC BẰNG Bảng 3. Kích thước trình tự COI của các mẫu phân tích, bp. Sự da dạng nucleotide vùng COI của DNA ti thé C.

LÍ DO CHON ĐÈ TÀI Quan dao Trường Sa là một trong hai quần dao san hô lớn của Việt Nam, nằm ở phía Nam Biên Đông. Với vị trí năm giữa Biên Đông - tuyến đường hàng hải quan trọng thứ hai trên the giới, quan đảo Trường Sa có thé mạnh về dich vụ hàng hải và đánh bắt thuý sản đối với tàu thuyền qua lại trong khu vực [1]. Đây là nơi giao hoa giữa hai dòng hải lưu nóng - lạnh, nguồn lợi kinh tế đầu tiên ở vùng biên thuộc quan đảo Trường Sa là tiềm năng về hải sản bởi nguồn lợi hai san phong phú và dồi dao. cá, mực có trữ lượng lớn, vùng biên quan đảo Trường Sa có nhiều loại hải sản dùng làm thực phẩm quý và có thể làm hàng xuất khẩu có giá trị cao.

điểm đặc biệt của quần đảo Trường Sa là lớp phủ bề ngoài của các dao đều có nguồn gốc từ sinh vật mà quan trọng nhất là đá san hô với độ dày trên 20 m và cho đến nay lớp phủ này vẫn ngày càng day thêm nhờ sự phát triển của hàng nghìn hectare rạn san hô bao phủ bên ngoai [2]. Các rạn san hô này là yếu té quan trọng tạo nên nguôn lợi hải sản cho quan đảo, là nơi cư trú, nuôi đường của các loài sinh vật biến, trong đó có ca Mú rạn. Cá mú rạn là loài cá sông ở đáy được tìm thấy ở vùng nước nhiệt đới và cận nhiệt đới của tat cá các đại dương [3]. Cá mi rạn cũng có thé được tìm thay trong khu vực đầm san hô, khu vực sau vách san hô và trên đỉnh san hô ngoài khơi nên khó phát hiện, khó đánh bắt [4].

Loải cá nay thường đi theo bay đản, có thân hình phan đầu và vảy xu xì. urudeta cùng tồn tại với nhiều loài cá mt khác bao gồm cả Epinephelus merra và E. Cá mú rạn phân bố rộng rãi ở An Độ Dương và phô bién ở tat các các đảo nhiệt đới, bờ nông của Án Độ Dương và phía Tây trung tâm Thái Bình Dương. Tại quản dao Trường Sa của Việt Nam, C.

urudeta là một trong những loài cá chiếm ưu thế trên các bãi cạn vả sườn rạn san hô. Đối với hệ sinh thai ran san hô, C. ưzodera có chức nang sinh thai quan trọng bởi chúng giữ vai trò là động vật tiêu thụ các loài cá nhỏ, giáp xác và chân đầu [6]. urudeta cũng được sử dụng cho mục đích giải trí như nuôi cá cảnh [7].

Bên cạnh đó, cá mú còn là đối tượng nuôi mang lại giá trị kinh tế cao và là nguồn thực phẩm cao cấp nên nhu câu trong nước và xuất khấu rat lớn [8]. Nhằm đáp ứng nhu cầu nuôi cá ma ngày cảng cao, nghề nuôi cá mú ở Việt Nam đã hình thành và phát triển mạnh. Tuy nhiên, do những hạn chế về con giống, san lượng cá mú nuôi chưa đáp ứng được nhu cầu thị trường trong nước và xuất khâu. Cá mú trong tự nhiên bị khai thác quá mức dẫn đến sự suy giảm rõ rệt của sản lượng cá mú thương phẩm.

Tập tính sinh sản của cá mú cũng đã gây khó khăn trong quản lí nghề cá.