Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Rau má (Centella asiatica thuộc họ Hoa tán Apiaceae) là loài thực vật nhiệt đới phân bố phổ biến tại châu Á và mọc tự nhiên nhiều nơi ở Việt Nam. Trong thực tế đời sống, rau má chủ yếu được thu hái để sử dụng làm thực phẩm thông thường (rau ăn sống, nấu canh, làm nước giải khát) hoặc làm vị thuốc dân gian thanh nhiệt, giải độc. Các nghiên cứu dược lý trên thế giới đã xác định thành phần hoạt chất trong rau má rất phong phú với các dẫn xuất saponin triterpene (như asiaticoside, madecassoside, acid asiatic, acid madecassic) cùng các hợp chất dễ bay hơi có giá trị cao trong dược phẩm, mỹ phẩm và công nghệ thực phẩm. Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc trích ly và nghiên cứu tinh dầu từ rau má vẫn còn tương đối mới mẻ và chưa được khai thác tương xứng với tiềm năng nguyên liệu giá rẻ, sẵn có quanh năm.

Từ thực tế đó, đề tài khóa luận "Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu rau má" được thực hiện với 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước, thời gian chưng cất và độ ẩm của nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu hồi trong quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước.
  2. Xác định các chỉ số hóa lý đặc trưng và định danh thành phần hóa học của tinh dầu rau má thu được.
  3. Thử nghiệm và đánh giá khả năng kháng khuẩn của tinh dầu rau má đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị nhằm định hướng ứng dụng vào bảo quản thực phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài được giới hạn như sau:

  • Đối tượng nghiên cứu: Giống rau má dại (Hydrocotyle Chinensis Craib), thu mua tươi tại chợ Tự Đức, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ phận sử dụng là phần trên mặt đất gồm cuống và lá tươi, không bị úa, sâu bệnh.
  • Không gian nghiên cứu: Thí nghiệm trích ly và phân tích hóa lý thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM; phân tích thành phần hóa học GC/MS tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM; thử nghiệm vi sinh tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
  • Thời gian thực hiện: Từ ngày 15/01/2015 đến ngày 15/07/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân tách các hợp chất thiên nhiên và phương pháp quy hoạch thực nghiệm trong công nghệ hóa học - thực phẩm:

  • Khung lý thuyết và nguyên lý trích ly: Quá trình khai thác tinh dầu dựa trên nguyên lý chưng cất lôi cuốn hơi nước đối với hệ hai chất lỏng không tan lẫn (nước và tinh dầu). Hỗn hợp sôi khi tổng áp suất hơi riêng phần của nước và tinh dầu bằng áp suất khí quyển, giúp hạ nhiệt độ sôi của các cấu tử tinh dầu xuống dưới 100°C ở áp suất thường, hạn chế sự phân hủy nhiệt của các hợp chất nhạy cảm.
  • Phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Áp dụng phương pháp quy hoạch cấu trúc tâm xoay trực giao cấp hai để xây dựng mô hình toán học hồi quy biểu diễn mối quan hệ giữa ba yếu tố công nghệ (lượng nước bổ sung, thời gian chưng cất, độ mất ẩm của nguyên liệu) với hàm mục tiêu là khối lượng tinh dầu thu hồi. Độ tin cậy của các hệ số trong phương trình hồi quy được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Student, và độ tương thích của mô hình được đánh giá qua chuẩn số Fisher dựa trên phương sai tái hiện từ các thí nghiệm lặp tại tâm.
  • Phương pháp phân tích hóa lý: Xác định các chỉ số chất lượng tinh dầu theo phương pháp chuẩn độ hóa học, bao gồm:
    • Chỉ số acid: Xác định lượng acid béo tự do bằng dung dịch chuẩn KOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein.
    • Chỉ số xà phòng hóa: Xác định lượng KOH cần thiết để xà phòng hóa hoàn toàn este và trung hòa acid tự do trong 1 gam tinh dầu bằng KOH 0,5N trong ethanol, sau đó chuẩn độ lượng kiềm dư bằng dung dịch HCl 0,5N.
    • Chỉ số este: Tính toán thông qua hiệu số giữa chỉ số xà phòng và chỉ số acid.
    • Chỉ số iod: Đánh giá mức độ bất bão hòa của tinh dầu bằng dung dịch iod 0,1N và chuẩn độ lượng iod dư bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N với chỉ thị hồ tinh bột.
  • Phương pháp phân tích thành phần hóa học: Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) với khả năng tách các cấu tử bằng sắc ký khí và nhận diện cấu trúc phân tử qua khối phổ đồ dựa trên cơ sở dữ liệu thư viện phổ chuẩn.
  • Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa giấy trên môi trường thạch (agar disk diffusion) để đo đường kính vòng kháng khuẩn đối với ba chủng vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus aureus (cầu khuẩn Gram dương), Bacillus subtilis (trực khuẩn Gram dương) và Escherichia coli (trực khuẩn Gram âm).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu và kỹ thuật chiết tách:

  • Đặc điểm thực vật học và hóa thực vật của cây rau má (Centella asiatica): Mô tả hình thái rễ, thân, lá, hoa và phân biệt các loài phổ biến như rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis), rau má mỡ (Hydrocotyle Sibthorpioides Lam) và rau má dại (Hydrocotyle Chinensis Craib). Tổng hợp các nhóm hoạt chất chính gồm triterpenoid saponin (asiaticoside, madecassoside), các flavonoid, sterol và khoáng chất.
  • Tinh dầu rau má và các công bố khoa học: Tổng quan các nhóm chất bay hơi chính trong tinh dầu như sesquiterpenoid, monoterpenoid (chẳng hạn linalool, α-terpineol, β-caryophyllene, farnesol, limonene). Điểm lại các nghiên cứu quốc tế về khả năng chống oxy hóa (Syed Ali Raza et al., 2009; so sánh hoạt tính ngăn chặn chỉ số FFA, PV, IV với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA trong dầu hướng dương) và phổ kháng khuẩn của tinh dầu rau má (O. Oyedeji et al., 2005). Tại Việt Nam, ghi nhận công trình bước đầu của Nguyễn Thị Trúc Loan về trích ly tinh dầu rau má.
  • Kỹ thuật chiết xuất và phân tích: Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp trích ly tinh dầu (dùng dung môi hữu cơ bay hơi, phương pháp ướp hoa/hấp thụ enfleurage, chưng cất hơi nước trực tiếp, cách thủy, gián tiếp, cùng các công nghệ hỗ trợ vi sóng, siêu âm và CO2 siêu tới hạn). Giới thiệu nguyên lý cấu tạo và vận hành của thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS. Tổng hợp đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Escherichia coli.

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết về quy trình công nghệ, hóa chất, thiết bị và các bước thực nghiệm:

  • Chuẩn bị nguyên liệu: Rau má dại mua về được nhặt bỏ lá úa, rửa sạch 2–3 lần, để ráo và bảo quản ở 4–6°C.
  • Quy trình ly trích tinh dầu 6 công đoạn:
    1. Rửa sạch bụi bẩn và tạp chất cơ học.
    2. Xay nhuyễn nguyên liệu (50g cho mỗi mẻ thí nghiệm) cùng lượng nước xác định bằng máy xay nhằm phá vỡ vách tế bào và các túi chứa tinh dầu.
    3. Chưng cất lôi cuốn hơi nước trong bình cầu đáy tròn 500ml nối với hệ thống ngưng tụ, cấp nhiệt ổn định.
    4. Chiết tách phân đoạn: Chuyển dịch ngưng tụ sang bình lóng, thêm dung môi diethyl ether để chiết tinh dầu ra khỏi pha nước; lắc đều, để lắng 10 phút, tách lấy lớp dung môi bên trên.
    5. Làm khan: Bổ sung muối Na2SO4 khan vào dung dịch ether - tinh dầu, để yên 15 phút để loại bỏ triệt để nước tự do, sau đó lọc loại muối.
    6. Cô quay chân không: Sử dụng thiết bị cô quay ở nhiệt độ 36°C, tốc độ quay 70 vòng/phút trong thời gian 50 phút để thu hồi triệt để diethyl ether và thu tinh dầu nguyên chất.
  • Bố trí thí nghiệm thăm dò sơ bộ: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng đơn yếu tố với 50g nguyên liệu: lượng nước (khảo sát các mức 25, 50, 100, 150 ml ở thời gian chưng cất 3 giờ), thời gian chưng cất và độ mất ẩm ban đầu của rau má.
  • Thiết kế quy hoạch thực nghiệm: Thiết lập ma trận trực giao cấp hai ba biến số nhằm tối ưu hóa hàm mục tiêu là khối lượng tinh dầu thu hồi.
  • Quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa lý (acid, xà phòng, este, iod) và quy trình khuếch tán đĩa thạch đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu hóa và phân tích hóa nghiệm:

  • Thí nghiệm thăm dò sơ bộ: Lượng nước, thời gian chưng cất và độ ẩm ban đầu đều tác động rõ rệt đến lượng tinh dầu thu được. Lượng nước quá ít làm cháy cục bộ nguyên liệu và khó lôi cuốn hơi; lượng nước quá nhiều làm tăng thể tích đun và thất thoát tinh dầu hòa tan trong nước ngưng. Thời gian chưng cất ngắn chưa lôi cuốn hết cấu tử nặng; kéo dài thời gian làm tiêu hao năng lượng và tăng nguy cơ thủy phân các hợp chất este.
  • Xây dựng và giải bài toán tối ưu hóa một mục tiêu: Xử lý dữ liệu thực nghiệm theo ma trận quy hoạch trực giao cấp 2, tính toán các hệ số hồi quy, đánh giá ý nghĩa các hệ số qua tiêu chuẩn Student và kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy qua 4 thí nghiệm lặp tại tâm. Từ mô hình toán học, xác định được điểm cực đại công nghệ:
    • Lượng nước chưng cất: 91 ml (ứng với 50g nguyên liệu).
    • Thời gian chưng cất: 3 giờ 10 phút (3h10p).
    • Khối lượng tinh dầu thu được cao nhất đạt: 0,441 gam.
  • Kết quả xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu rau má:
    • Chỉ số acid: 4,263 mg KOH/g (cho thấy lượng acid béo tự do trong tinh dầu ở mức thấp).
    • Chỉ số xà phòng: 14,96 mg KOH/g.
    • Chỉ số este: 10,697 mg KOH/g (phản ánh lượng hợp chất este có trong tinh dầu).
    • Chỉ số iod: Phản ánh mức độ bất bão hòa của các liên kết đôi trong khung carbon của các cấu tử tinh dầu.
  • Kết quả định danh thành phần hóa học qua GC/MS: Phổ GC/MS phân tích được 44 hợp chất hóa học trong tinh dầu rau má, trong đó cấu tử chính chiếm hàm lượng cao nhất là sesquiterpene hydrocarbon β-caryophyllene (chiếm trên 18%). Ngoài ra còn có sự xuất hiện của các cấu tử đặc trưng như trans-β-farnesene, germacrene-D, α-terpineol, limonene, linalool.

Chương 4: Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu rau má

Chương 4 tập trung vào đánh giá hiệu lực ức chế vi sinh vật của tinh dầu rau má nguyên chất:

  • Kết quả thử nghiệm khuếch tán đĩa thạch: Tinh dầu rau má thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng đối với cả ba chủng vi khuẩn thử nghiệm, tạo thành vòng vô khuẩn rõ rệt xung quanh đĩa giấy.
  • So sánh kích thước đường kính vòng kháng khuẩn:
    • Đối với vi khuẩn Gram âm Escherichia coli: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt 10,33 mm.
    • Đối với vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt 7,33 mm.
    • Đối với vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt 5,xx mm.
  • Biện luận: Tinh dầu rau má thể hiện hoạt tính kháng mạnh nhất trên chủng trực khuẩn Gram âm Escherichia coli (10,33 mm), tiếp theo là tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus và yếu nhất trên trực khuẩn sinh bào tử Bacillus subtilis. Kết quả này được giải thích bởi tác động thẩm thấu và làm tổn hại màng tế bào vi khuẩn của các hợp chất terpenoid (chủ yếu là β-caryophyllene và các dẫn xuất monoterpene/sesquiterpene có trong tinh dầu).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

  • Kết luận: Tổng kết các kết quả đạt được về quy trình công nghệ tối ưu chưng cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ dung môi chiết diethyl ether, các thông số hóa lý, 44 thành phần hóa học định danh qua GC/MS và số liệu ức chế 3 dòng vi khuẩn thực nghiệm.
  • Kiến nghị: Đề xuất các nội dung nghiên cứu mở rộng trong tương lai nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ và ứng dụng thực tế.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đưa ra các kết quả định lượng cụ thể về quy trình trích ly, chỉ tiêu hóa lý và hoạt tính sinh học của tinh dầu rau má dại:

Nhóm chỉ tiêu / Thông số Kết quả thực nghiệm xác định trong khóa luận
Khối lượng nguyên liệu mẻ tối ưu 50 gam rau má dại tươi
Lượng nước chưng cất tối ưu 91 ml
Thời gian chưng cất tối ưu 3 giờ 10 phút (3h10p)
Khối lượng tinh dầu tối đa thu được 0,441 gam
Chỉ số acid 4,263 mg KOH/g
Chỉ số xà phòng 14,96 mg KOH/g
Chỉ số este 10,697 mg KOH/g
Số lượng hợp chất định danh qua GC/MS 44 hợp chất
Thành phần chính chiếm tỷ lệ cao nhất β-caryophyllene (> 18%)
Vòng kháng khuẩn Escherichia coli 10,33 mm
Vòng kháng khuẩn Staphylococcus aureus 7,33 mm
Vòng kháng khuẩn Bacillus subtilis 5,xx mm

Các giải pháp và đóng góp của đề tài:

  • Xây dựng quy trình khép kín tách chiết tinh dầu rau má bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp chiết phân đoạn bằng diethyl ether và cô quay chân không ở 36°C, giúp thu hồi tinh dầu triệt để và hạn chế sự biến tính nhiệt.
  • Ứng dụng thành công công cụ quy hoạch thực nghiệm cấu trúc tâm xoay để xác lập chế độ công nghệ tối ưu (lượng nước 91 ml/50g nguyên liệu, thời gian 3h10p), thay thế phương pháp thử nghiệm mò mẫm tốn kém nguyên vật liệu.
  • Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về 4 chỉ số hóa lý và dữ liệu sắc ký khối phổ GC/MS của tinh dầu rau má dại tại khu vực miền Nam Việt Nam.
  • Chứng minh bằng thực nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu đối với E. coli, S. aureus và B. subtilis, tạo cơ sở khoa học để nghiên cứu sử dụng tinh dầu rau má làm chất kháng khuẩn tự nhiên trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được triển khai ở quy mô phòng thí nghiệm và còn một số hạn chế theo phạm vi nghiên cứu:

  • Quy mô thí nghiệm nhỏ (mỗi mẻ 50g nguyên liệu trong bình cầu 500ml), chưa được khảo nghiệm và tính toán cân bằng vật chất - năng lượng ở quy mô pilot hoặc sản xuất công nghiệp.
  • Quá trình thu hồi tinh dầu sau ngưng tụ phải sử dụng dung môi hữu cơ diethyl ether và hệ thống cô quay chân không, đòi hỏi kiểm soát an toàn dung môi bay hơi và làm phát sinh chi phí hóa chất so với chưng cất phân ly trọng lực trực tiếp.
  • Khảo nghiệm kháng khuẩn mới dừng lại ở việc đo đường kính vòng ức chế trên 3 chủng vi khuẩn đại diện bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy, chưa khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của tinh dầu đối với từng chủng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo mà tác giả định hướng:

  • Mở rộng quy mô trích ly trên các hệ thống thiết bị pilot dung tích lớn hơn.
  • Thử nghiệm kết hợp các phương pháp trích ly hiện đại (như có sự hỗ trợ của vi sóng, siêu âm hoặc dung môi CO2 siêu tới hạn) nhằm rút ngắn thời gian chưng cất và nâng cao hiệu suất thu hồi.
  • Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng khuẩn, mở rộng thử nghiệm trên các chủng nấm men, nấm mốc và vi sinh vật gây thối hỏng thực phẩm khác.
  • Thử nghiệm phối chế tinh dầu rau má vào các mô hình sản phẩm thực phẩm cụ thể (như màng bao sinh học kháng khuẩn, nhũ tương bảo quản thực phẩm) để đánh giá độ ổn định và cảm quan.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

  • Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sau thu hoạch, Kỹ thuật Hóa học và Dược liệu thực vật: Cung cấp tài liệu tham khảo thực tế về việc thiết kế thí nghiệm, vận hành bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước, các bước xử lý làm khan - cô quay chân không và quy trình phân tích chỉ số hóa lý của chất béo/tinh dầu (acid, xà phòng, este, iod).
  • Người nghiên cứu về tối ưu hóa quy trình: Chương 2 và Chương 3 là trường hợp áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 có kiểm định thống kê Student và Fisher trên đối tượng chiết xuất hợp chất tự nhiên.
  • Các nghiên cứu về hợp chất tự nhiên và chất kháng khuẩn sinh học: Cung cấp phổ dữ liệu GC/MS của tinh dầu loài Hydrocotyle Chinensis Craib và số liệu thực nghiệm về phổ kháng khuẩn trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương.

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối ưu hóa để trích ly tinh dầu rau má đạt hiệu suất cao nhất trong khóa luận là gì?
Dựa trên mô hình quy hoạch thực nghiệm cấu trúc tâm xoay, điều kiện tối ưu được xác định cho 50 gam nguyên liệu rau má dại gồm: lượng nước chưng cất bổ sung là 91 ml, thời gian chưng cất lôi cuốn hơi nước là 3 giờ 10 phút. Tại chế độ công nghệ này, khối lượng tinh dầu thu hồi lớn nhất đạt được là 0,441 gam.

2. Tại sao quy trình ly trích trong nghiên cứu phải sử dụng dung môi diethyl ether và thiết bị cô quay chân không?
Do hàm lượng tinh dầu trong rau má dại tương đối thấp và một phần tinh dầu bị phân tán, hòa tan trong nước ngưng sau chưng cất. Tác giả sử dụng diethyl ether (nhiệt độ sôi thấp từ 34–38°C) để chiết tinh dầu ra khỏi pha nước trong bình lóng. Sau khi làm khan bằng Na2SO4, hỗn hợp được cô quay chân không ở 36°C, tốc độ 70 vòng/phút trong 50 phút để thu hồi triệt để ether mà không làm tổn thất các cấu tử tinh dầu dễ bay hơi.

3. Thành phần hóa học chiếm ưu thế nhất trong tinh dầu rau má được phân tích bằng GC/MS là gì?
Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS đã phát hiện 44 hợp chất trong tinh dầu rau má dại. Hợp chất chính chiếm tỷ lệ cao nhất là sesquiterpene hydrocarbon β-caryophyllene (chiếm hơn 18% tổng thành phần).

4. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu rau má đối với các vi sinh vật thử nghiệm có sự khác biệt như thế nào?
Theo kết quả thử nghiệm khuếch tán đĩa thạch, tinh dầu rau má có hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với trực khuẩn Gram âm Escherichia coli với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt 10,33 mm. Đối với vi khuẩn Gram dương, hoạt tính thể hiện ở mức trung bình trên tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus (đường kính vòng 7,33 mm) và yếu hơn trên trực khuẩn Bacillus subtilis (đường kính vòng 5,xx mm).

5. Đối tượng nguyên liệu rau má được sử dụng trong đề tài có xuất xứ từ đâu?
Nguyên liệu nghiên cứu là rau má dại (Hydrocotyle Chinensis Craib), được thu mua tại chợ Tự Đức, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh. Bộ phận thu hái sử dụng trong nghiên cứu là phần trên mặt đất bao gồm cuống và lá tươi.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Bùi Thanh Trúc đã hoàn thành việc khảo sát và xác lập các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình trích ly tinh dầu từ rau má dại (Hydrocotyle Chinensis Craib) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, nghiên cứu đã tìm ra chế độ tối ưu với lượng nước 91 ml/50g nguyên liệu và thời gian chưng cất 3 giờ 10 phút, đạt khối lượng tinh dầu 0,441 gam. Kết quả phân tích đã xác định được 4 chỉ số hóa lý cơ bản, nhận diện 44 hợp chất qua GC/MS với thành phần ưu thế là β-caryophyllene, đồng thời chứng minh tinh dầu có khả năng ức chế sinh trưởng rõ rệt trên các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis.