Isolation and Characterisation of Plant Growth Promoting Bacteria Against Fusarium pseudograminearum

Luận văn thạc sĩ về sinh học ứng dụng, nghiên cứu vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển cây trồng chống lại Fusarium pseudograminearum trên đậu chickpea và lúa mì.

• Tác giả: Naresh Talari
• Người hướng dẫn: Dr Nitin Mantri
• Trường học: RMIT University
• Chuyên ngành: Applied Biology & Biotechnology
• Đề tài: Khám Phá Vi Khuẩn Kích Thích Tăng Trưởng Cây Trồng Chống Lại Fusarium pseudograminearum
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Melbourne

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ABSTRACT
• DEDICATED TO MY MOTHER
• ACKNOWLEDGEMENTS
• 1. BACKGROUND AND AIMS
• 2. RESEARCH FOCUS AND HYPOTHESES OF THE THESIS
• 3. RESEARCH HYPOTHESES
• 4. THESIS OUTLINE
• 2. CHAPTER 2: REVIEW OF LITERATURE
• 2.1. INTRODUCTION

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vi Khuẩn Kích Thích Tăng Trưởng Cây Trồng Chống Lại Fusarium pseudograminearum

Vi khuẩn kích thích tăng trưởng cây trồng (PGPB) đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe và năng suất cây trồng. Đặc biệt, các vi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh do Fusarium pseudograminearum gây ra, một trong những tác nhân chính gây hại cho cây trồng. Nghiên cứu này sẽ khám phá các cơ chế mà PGPB sử dụng để tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng.

1.1. Định Nghĩa và Vai Trò Của Vi Khuẩn Kích Thích Tăng Trưởng

Vi khuẩn kích thích tăng trưởng cây trồng là những vi sinh vật có khả năng cải thiện sự phát triển của cây thông qua nhiều cơ chế khác nhau như sản xuất hormone thực vật và cạnh tranh với các mầm bệnh.

1.2. Tác Động Của Fusarium pseudograminearum Đến Cây Trồng

Fusarium pseudograminearum là một loại nấm gây bệnh nghiêm trọng cho cây trồng, đặc biệt là lúa mì và đậu chickpea. Bệnh này có thể dẫn đến thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng sản phẩm.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Quản Lý Fusarium pseudograminearum

Quản lý Fusarium pseudograminearum là một thách thức lớn trong nông nghiệp hiện đại. Các phương pháp truyền thống như sử dụng thuốc trừ sâu hóa học không còn hiệu quả và có thể gây hại cho môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp bền vững hơn.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Quản Lý Truyền Thống

Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học có thể dẫn đến sự phát triển của các chủng nấm kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các biện pháp kiểm soát bệnh.

2.2. Tác Động Môi Trường Của Việc Sử Dụng Hóa Chất

Việc lạm dụng hóa chất trong nông nghiệp không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cây trồng mà còn gây hại cho hệ sinh thái và sức khỏe con người.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Vi Khuẩn Kích Thích Tăng Trưởng

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và xác định các vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng. Các phương pháp này bao gồm phân lập vi khuẩn từ đất và thử nghiệm khả năng ức chế Fusarium pseudograminearum.

3.1. Phân Lập Vi Khuẩn Từ Đất

Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất khác nhau để tìm kiếm các chủng có khả năng kích thích tăng trưởng và chống lại bệnh do nấm gây ra.

3.2. Thử Nghiệm Khả Năng Ức Chế Nấm

Các thử nghiệm in vitro được thực hiện để đánh giá khả năng ức chế của các vi khuẩn đối với Fusarium pseudograminearum thông qua các phương pháp như thử nghiệm nuôi cấy kép.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Stenotrophomonas rhizophila có khả năng kích thích tăng trưởng và cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng đối với Fusarium pseudograminearum. Những phát hiện này có thể được áp dụng trong nông nghiệp bền vững.

4.1. Hiệu Quả Của Bacillus subtilis Trong Việc Chống Lại Nấm

Bacillus subtilis đã cho thấy khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của Fusarium pseudograminearum, giúp cây trồng phát triển khỏe mạnh hơn.

4.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Bền Vững

Các vi khuẩn kích thích tăng trưởng có thể được sử dụng như một giải pháp thay thế cho hóa chất trong nông nghiệp, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Vi Khuẩn Kích Thích Tăng Trưởng

Nghiên cứu về vi khuẩn kích thích tăng trưởng cây trồng chống lại Fusarium pseudograminearum mở ra hướng đi mới cho nông nghiệp bền vững. Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các ứng dụng thực tiễn hơn trong tương lai.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện năng suất cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục khám phá các chủng vi khuẩn khác và các cơ chế hoạt động của chúng để tối ưu hóa hiệu quả trong việc chống lại các bệnh do nấm gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh thối cổ rễ (Fusarium Crown Rot - FCR) do nấm hoại sinh Fusarium pseudograminearum gây ra là một trong những hiểm họa kinh niên đối với ngành sản xuất ngũ cốc và cây họ đậu trên toàn cầu. Tại Úc, dịch bệnh này gây thiệt hại tài chính nặng nề với tổn thất hàng năm ước tính khoảng 80 triệu AUD đối với lúa mì và từ 30 đến 60 triệu AUD đối với đậu gà. Trên quy mô thế giới, bệnh làm sụt giảm từ 10% đến 70% sản lượng mùa vụ; điển hình tại vùng Tây Bắc nước Mỹ, mức tổn thất năng suất lúa mì dao động từ 35% đến 61%, tương đương giá trị thiệt hại kinh tế hơn 2 tỷ USD.

Bên cạnh tổn thất về sinh khối, nấm Fusarium còn sản sinh các độc tố mycotoxin nguy hiểm trong hạt ngũ cốc. Theo các báo cáo ngành nông nghiệp, mycotoxin làm ô nhiễm khoảng 25% tổng sản lượng lương thực toàn cầu, gây thiệt hại hơn 1 tỷ USD mỗi năm cho chuỗi cung ứng thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Các biện pháp truyền thống như dùng thuốc bảo vệ thực vật hóa học hay luân canh mùa vụ đang bộc lộ nhiều hạn chế do làm suy giảm đa dạng sinh học đất và thúc đẩy sự xuất hiện của các chủng nấm kháng thuốc.

Trước thực trạng đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học Ứng dụng và Công nghệ Sinh học của tác giả Naresh Talari tại Đại học RMIT đã nghiên cứu giải pháp kiểm soát sinh học bền vững. Mục tiêu trọng tâm của đề tài là phân lập, sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy sinh trưởng thực vật (PGPB) bản địa tại bang Victoria, Úc nhằm ức chế nấm Fusarium pseudograminearum. Nghiên cứu mang ý nghĩa then chốt trong việc bảo vệ sản lượng xuất khẩu hơn 28 triệu tấn lúa mì và 1 triệu tấn đậu gà của Úc thông qua các hoạt chất sinh học an toàn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Đề tài vận dụng lý thuyết kiểm soát sinh học (Biocontrol Theory) và lý thuyết tương tác vùng rễ (Rhizosphere Dynamics). Cơ chế tác động của vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy sinh trưởng thực vật (PGPB) được chia thành hai nhóm chính: trực tiếp và gián tiếp.

Ở nhóm cơ chế trực tiếp, vi khuẩn PGPB hỗ trợ cây trồng hấp thu dinh dưỡng thông qua quá trình hòa tan phosphate vô cơ nhờ tiết acid hữu cơ, cố định đạm sinh học và điều hòa nồng độ phytohormone. Đặc biệt, auxin Indole-3-acetic acid (IAA) đóng vai trò kích thích sự phân chia tế bào, kéo dài hệ rễ và gia tăng khả năng hấp thụ khoáng chất từ đất.

Ở nhóm cơ chế gián tiếp, vi khuẩn ức chế nấm hại thông qua việc tổng hợp siderophore để cô lập ion sắt Fe3+, tước đoạt dưỡng chất thiết yếu của mầm bệnh trong vùng rễ. Đồng thời, vi khuẩn tiết enzyme ly giải vách tế bào nấm (beta-1,3-glucanase), hợp chất bay hơi kháng khuẩn, hydro xyanua (HCN) và enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase giúp làm giảm nồng độ hormone ethylene gây stress ở thực vật. Các khái niệm trung tâm bao gồm kiểm soát sinh học, vi khuẩn vùng rễ, enzyme ly giải và phản ứng kích kháng hệ thống.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu đất tại tầng rễ sâu từ 5 đến 10 cm ở 3 địa điểm nông nghiệp thuộc bang Victoria gồm Perry Bridge, Lardner và Rosedale, với khối lượng xấp xỉ 100 g đất mỗi vị trí. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào lớp đất rễ giàu dinh dưỡng, nơi mật độ vi sinh vật hoạt động tự nhiên đạt mức 10^8 CFU/g đất.

Quy trình sàng lọc nhanh cải tiến được thiết lập bằng cách cấy đồng thời 50 µL hỗn dịch bào tử nấm Fusarium pseudograminearum (10^4 CFU/mL) và 50 µL vi khuẩn đất trên 3 hệ môi trường: thạch dịch chiết đất (SEA), thạch Tryptone Soy Agar (TSA) và thạch Nutrient Agar (NA). Cỡ mẫu ban đầu thu được 45 chủng vi khuẩn tạo vòng vô khuẩn. Sau khi sàng lọc loại bỏ 13 chủng trùng lặp hình thái, 32 chủng vi khuẩn độc lập được đánh giá đối kháng bằng thử nghiệm nuôi cấy kép (dual culture assay) trên môi trường PDA ở 28 độ C trong 48 giờ.

Lý do lựa chọn chuỗi phân tích kết hợp giữa thử nghiệm đối kháng in vitro, đo sinh khối nấm khô sau khi sấy ở 90 độ C, đếm tế bào bằng buồng đếm haemocytometer và giải trình tự gen 16S rRNA (cặp mồi 63F và 1389R) là nhằm xác định chính xác năng lực ức chế sinh học từ cấp độ tế bào đến mức độ di truyền học phân tử.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 45 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu, đề tài đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng vượt trội là NM-12 và NM-33, đều có nguồn gốc từ vùng đất Perry Bridge. Phân tích giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu BLAST trên GenBank khẳng định chủng NM-12 là Bacillus subtilis và chủng NM-33 là Stenotrophomonas rhizophila.

Trong thử nghiệm dịch lọc tế bào 20% (v/v) trên thạch PDA, cả hai chủng vi khuẩn ức chế rõ rệt sự phát triển của khuẩn ty nấm sau 7 ngày nuôi cấy ở 28 độ C. Khi đồng nuôi cấy trong môi trường lỏng Glucose Yeast suốt 24 giờ, mật độ bào tử nấm sụt giảm nghiêm trọng và khối lượng sinh khối nấm khô giảm từ 40% đến hơn 65% so với mẫu đối chứng không có vi khuẩn.

Đánh giá các hợp chất chuyển hóa thứ cấp cho thấy chủng NM-12 có khả năng sản sinh hormone IAA vượt trội ngay cả trong điều kiện chịu mặn 6% NaCl, trong khi chủng NM-33 không tổng hợp IAA. Đáng chú ý, cả hai chủng NM-12 và NM-33 đều duy trì hoạt tính enzyme beta-glucanase và gia tăng tổng hợp siderophore khi đối mặt với stress mặn 6%. Phân tích PCR xác nhận chủng Bacillus subtilis NM-12 sở hữu đầy đủ các gen mã hóa sản sinh HCN và enzyme ACC deaminase.

Thảo luận kết quả

Khả năng ức chế nấm mạnh mẽ của chủng Bacillus subtilis NM-12 xuất phát từ cơ chế tác động hiệp đồng: phá hủy vách tế bào nấm bằng enzyme beta-glucanase, cạnh tranh ion sắt Fe3+ thông qua siderophore và kích hoạt các hợp chất hữu cơ bay hơi ức chế khuẩn ty. Sự hiện diện của gen sinh ACC deaminase giúp rễ cây hạn chế tình trạng tích tụ ethylene gây ức chế sinh trưởng khi bị mầm bệnh tấn công.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ phần trăm ức chế bán kính nấm (%) sau 7 ngày và biểu đồ đường thể hiện động học tăng trưởng tế bào vi khuẩn đối lập với sự suy giảm số lượng bào tử nấm theo từng chu kỳ 4 giờ trong 24 giờ đầu. Ngoài ra, bảng tổng hợp các chỉ số quang phổ OD 530 nm của dịch chiết IAA, hoạt độ enzyme beta-glucanase và độ giảm sinh khối nấm khô giúp làm nổi bật ưu thế sinh học của NM-12 so với NM-33. Việc duy trì hoạt tính ở độ mặn 6% chứng minh tiềm năng thích ứng sinh thái rất cao của các chủng PGPB này tại các vùng canh tác khô hạn và nhiễm mặn.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình lên men lỏng quy mô pilot: Triển khai thử nghiệm công nghệ lên men cho hai chủng Bacillus subtilis NM-12 và Stenotrophomonas rhizophila NM-33 nhằm đạt mật độ vi sinh vật hữu hiệu từ 10^9 CFU/mL trở lên, thực hiện trong thời gian từ 6 đến 12 tháng bởi các trung tâm công nghệ sinh học nông nghiệp.

Thứ hai, phát triển công thức chế phẩm sinh học đa chủng dạng bột: Nghiên cứu phối trộn tổ hợp vi khuẩn NM-12 và NM-33 với các chất mang hữu cơ trơ như bột than bùn hoặc cám gạo để duy trì thời hạn bảo quản chế phẩm trên 18 tháng ở nhiệt độ phòng, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh chủ trì trong giai đoạn 2026 - 2027.

Thứ ba, tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng: Đánh giá hiệu lực phòng ngừa bệnh thối cổ rễ thực tế của chế phẩm sinh học trên cây lúa mì và đậu gà tại ít nhất 5 vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau trong 2 vụ mùa liên tiếp, hướng tới mục tiêu hạ tỷ lệ nhiễm bệnh FCR xuống dưới 20% và gia tăng năng suất cây trồng thêm 15% đến 25%.

Thứ tư, ban hành quy trình chuẩn về xử lý hạt giống và bổ sung vùng rễ: Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật ngâm ủ hạt giống với dịch vi khuẩn mật độ 10^7 CFU/g hạt trước khi gieo xạ và kết hợp tưới rễ định kỳ 30 ngày một lần, giao cho hệ thống khuyến nông địa phương triển khai nhằm cắt giảm tối thiểu 40% lượng thuốc diệt nấm hóa học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học và Nông nghiệp: Nắm bắt phương pháp sàng lọc vi khuẩn đối kháng cải tiến, quy trình phân tích gen chức năng ACC deaminase, HCN và định danh phân tử bằng cặp mồi 63F/1389R phục vụ nghiên cứu và giảng dạy.

Nhóm doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học: Khai thác bản quyền và tiềm năng thương mại hóa từ hai chủng vi khuẩn quý Bacillus subtilis NM-12 và Stenotrophomonas rhizophila NM-33 để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học đạt tiêu chuẩn chất lượng.

Nhóm kỹ sư nông nghiệp và chuyên gia quản lý dịch hại cây trồng: Ứng dụng quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh thối cổ rễ FCR vào các mô hình cánh đồng mẫu lớn, đặc biệt tại các vùng đất nông nghiệp chịu áp lực nhiễm mặn từ 1% đến 6%.

Nhóm học viên cao học và sinh viên ngành Khoa học cây trồng: Tham khảo mô hình thiết kế nghiên cứu thực nghiệm chuẩn mực từ khâu thu thập mẫu đất, thử nghiệm in vitro, nuôi cấy lỏng đến phân tích thống kê sinh khối nấm hại.

Câu hỏi thường gặp

Bệnh thối cổ rễ (FCR) gây ra những tổn hại thực tế nào đối với cây trồng? Bệnh do nấm Fusarium pseudograminearum tấn công làm thối nâu gốc thân và phá hủy hệ rễ. Khi bệnh chuyển nặng, sự tắc nghẽn mạch dẫn làm cây héo rũ, xuất hiện hiện tượng bông bạc (whitehead), hạt lúa mì bị lép lửng và làm sụt giảm năng suất từ 25% đến hơn 50% trong điều kiện thời tiết khô hạn.

Tại sao chủng vi khuẩn Bacillus subtilis NM-12 lại có khả năng kháng nấm vượt bậc? Chủng NM-12 sở hữu cơ chế kháng nấm đa tầng nhờ tiết enzyme ly giải beta-glucanase, sản sinh siderophore thu giữ sắt Fe3+, đồng thời mang gen mã hóa HCN và enzyme ACC deaminase giúp triệt tiêu khuẩn ty nấm Fusarium và tăng cường khả năng chống chịu stress của rễ cây.

Ý nghĩa thực tiễn của khả năng chịu mặn ở mức 6% của các chủng PGPB là gì? Nồng độ muối 6% là ngưỡng ức chế sinh trưởng đối với phần lớn vi khuẩn đất. Việc các chủng PGPB duy trì khả năng sinh IAA, enzyme beta-glucanase và siderophore trong điều kiện mặn 6% đảm bảo hiệu quả kích thích tăng trưởng cây trồng tại các vùng đất khô hạn và xâm nhập mặn.

Phương pháp nuôi cấy kép (dual culture assay) được triển khai như thế nào trong nghiên cứu? Thử nghiệm sử dụng đĩa thạch PDA với một đĩa thạch nấm đường kính 1 cm đặt ở trung tâm và cấy vệt vi khuẩn cách mép nấm 3 cm. Sau 48 giờ đến 7 ngày ủ ở 28 độ C, hiệu quả đối kháng được tính toán dựa trên mức độ suy giảm bán kính sợi nấm so với đĩa đối chứng.

Kỹ thuật sinh học phân tử nào đã được sử dụng để định danh các chủng vi khuẩn? Tác giả đã tách chiết DNA bộ gen vi khuẩn bằng kit chuyên dụng, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 63F và 1389R, sau đó giải trình tự tại viện AGRF Melbourne và đối soát cơ sở dữ liệu GenBank thông qua công cụ BLAST để xác định chính xác loài.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công 45 chủng vi khuẩn từ đất nông nghiệp bang Victoria và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn đối kháng ưu tú gồm Bacillus subtilis NM-12 và Stenotrophomonas rhizophila NM-33.
• Chủng NM-12 thể hiện khả năng ức chế nấm Fusarium pseudograminearum mạnh mẽ, giúp giảm từ 40% đến hơn 65% sinh khối nấm khô và duy trì hoạt tính sinh IAA ở độ mặn 6%.
• Đề tài làm sáng tỏ cơ chế phòng trừ sinh học đa tác động nhờ enzyme beta-glucanase, siderophore cô lập sắt, các hợp chất bay hơi cùng hệ gen chức năng ACC deaminase và HCN.
• Công trình mang lại luận cứ khoa học vững chắc giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế hơn 100 triệu AUD mỗi năm cho ngành sản xuất lúa mì và đậu gà mà không cần lạm dụng hóa chất độc hại.
• Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp cần tiếp tục thúc đẩy thử nghiệm nhà kính và đồng ruộng trong vòng 12 đến 24 tháng tới nhằm hoàn thiện quy trình thương mại hóa chế phẩm vi sinh phục vụ nền nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Isolation, Characterisation and Identification of Plant Growth Promoting Bacteria exhibiting activity against Fusarium pseudograminearum A thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science (Applied Biology & Biotechnology) by NARESH TALARI School of Science College of Science, Engineering and Health RMIT University DECLARATION I certify that except where due acknowledgement has been made, the work is that of the author alone; the work has not been submitted previously, in whole or in part, to qualify for any other academic award; the content of the thesis is the result of work which has been carried out since the official commencement date of the approved research program; any editorial work, paid or unpaid, carried out by a third party is acknowledged; and, ethics procedures and guidelines have been followed. Naresh Talari June 2017 2 ABSTRACT The main constraints to Australian chickpea and wheat production include several factors such as drought, biotic and abiotic stresses such as crown rot, salinity and cold; which totally contribute to losses of 10-70%. It has been found that there are practices that are helpful in controlling these stresses, such as the tolerant varieties, pesticides and crop rotation, transgenic crops and conventional breeding techniques, but these methods are not completely successful. It can be thus said that new methods need to be developed in order to minimise the biotic as well as abiotic stresses in chickpea.

Plant growth promoting bacteria (PGPB) potentially represent one such novel approach and are the focus of this research. The generally perceived mechanisms of PGPB which result in reduced plant stress include competition (with a plant pathogen) for an ecological niche, secretion of inhibitory bioactive compounds, and secondary metabolic induction of systemic resistance in the plant host to a range of soil born-pathogens and abiotic stresses. The current study focuses on the potential use of PGPB to enhance the tolerance of chickpea and wheat to crown rot caused by Fusarium pseudograminearum. Two strains, NM-12 and NM-33, identified as Bacillus subtilis and Stenotrophomonas rhizophila were isolated from the rhizosphere soils in Victoria, Australia (Perry Bridge).

The beneficial bacterium, Bacillus subtilis and Stenotrophomonas rhizophila were analysed for their direct plant growth promoting effects. Direct antagonistic effect on Fusarium pseudograminearum was demonstrated by a dual culture assay and culture filtrate assays together with estimation of spores and fungal biomass dry weight in vitro. 3 To identify the mechanisms underlying the inhibition of the fungus by the two isolates, the bacterial exudates were assessed for the presence of a range of potential antifungal products, including lytic enzymes, hormones, antibiotics and other secondary metabolites. Strain NM-12 was shown to produce indole acetic acid (IAA) at different concentrations even at 6% salt concentration.

In comparison, no IAA production was observed by strain NM-33. Further, siderophore production was moderate under control conditions but significantly increased at high salt concerntration (6%). In contrast, β- glucanase production was observed under normal as well as high salt concentrations. Interestingly, NM- 12 which exhibited enhanced ability to suppress the fungal pathogen was found to possess genes encoding cyanide production and 1-Aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC) deaminase both of which are indirectly responsible for plant growth promotion.

In conclusion, the two bacterial isolates, Bacillus and Stenotrophomonas were found to be capable of promoting growth and improving the survivability of chickpea and wheat plants exposed to crown rot. These findings could be potentially extended to other crops to improve crop productivity under biotic stress. 4 Dedicated to my Mother 5 ACKNOWLEDGEMENTS I would like to express sincere gratitude and appreciation to my supervisors Dr Nitin Mantri and Prof Andy Ball. Their patience, motivation and immense knowledge guided me to successful completion of this project.

They helped improve my experimental design, analysis, scientific thinking and academic writing to a great extent. I would like to thank the financial support from Royal Melbourne Institute of Technology (RMIT University) that covered my tuition fees and funding for the project. I would like to express my gratitude to the staff and students working with me in the laboratory. Dr Lisa Dias provided generous help on all aspects of my research.

I would like to express my thanks to Dr Esmaeil Shahsavari for helping with the operations of laboratory equipment and in demonstrating basic laboratory techniques. Also, I would like to express my gratitude to Dipesh Parekh for his generous help in terms of research advice, thesis editing and submission. Finally, I would like to thank all my family members for their concern and support.1 Background and Aims .2 Research Focus and hypotheses of the thesis. 17 2 Chapter 2: Review of Literature .2 Importance of Wheat and Chickpea in Australia .3 Crown Rot Disease and its Pathogen .4 Current Management of Crown Rot .5 Economic Loss across the Globe and to Australia .6 Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB) .3 Modulating the levels of phytohormones .1 Production of Antibiotics and Lytic Enzymes .2 Production of Siderophores.

34 3 Chapter 3: Isolation, screening, selection and identification of plant growth promoting bacteria .2 Materials and Methods .1 Chemicals and Raw materials .4 Preparation of different media to obtain maximum recovery of PGPB during isolation .5 Rapid isolation and in vitro screening of effective bacteria .6 Selection of antagonistic bacteria by dual culture assay .7 Identification of selected bacteria .8 Culture filtrate assay .9 Antifungal activity in broth.10 Antagonistic activity by fungal biomass dry weight .3 Results and Discussion .2 Dual culture assay for identification of antagonistic bacteria .3 16S rRNA sequencing to identify the two antagonistic bacterial strains 53 Strains .4 Culture filtrate assay on agar plates .5 Antifungal activity assessed using by cell count in broth using a haemocytometer .6 Antagonistic activity by fungal biomass dry weight. 63 4 Chapter 4: Characterization of plant growth promoting bacteria in terms of secondary metabolite production .2 Materials and methods .1 Indole acetic acid (IAA) assay .4 Volatile components assay.5 Identification of ACC deaminase and HCN producing genes .3 Results and Discussion .4 Production of volatile compounds. 86 5 Chapter 5: General Discussion and Conclusions. 98 9 Table of Figures Figure 2.1: Symptoms of Fusarium Crown rot in Chickpea and Wheat (Boucher et al.2: Overview of the mechanisms of biocontrol (Beauregard et al.1: Rapid isolation of plant growth promoting bacteria plates (A) and B) Bacterial and fungal colonies.

Red circle shows the small zones of clearance within the plate, C) Isolation plate without fungal spores, D) Established pure bacterial strains, E) Agar slants for culture maintenance) .2: Dual culture assay of bacterial isolates and Fusarium pseudograminearum on potato dextrose agar plates .3: Suppression of fungal growth by bacterial isolates NM-12 and NM-33. radial growth of fungus in presence and absence of the bacterial isolates, B. Percent inhibition of fungus after 7 days incubation at 28oC) .4: PCR gel image of 16s rRNA amplification .5: Phylogenetic tree obtained from Clustal W.6: Effect of bacterial cell culture filtrates on the growth of Fusarium pseudograminearum in PDA (A. NM-12 cell filtrate with fungus & control (fungus only), B.

NM-33 cell filtrate with fungus & control (fungus only).7: Influence of the culture filtrate from bacterial isolates NM-12 and NM- 33 on fungal growth (A. Radial growth of fungus after seven days in presence and absence of cell filtrates, B. Percent inhibition of fungus after 7 days incubation at 28oC) .8: The antifungal activity of the two bacterial isolates NM-12 and NM-33 and a mixture of both strains during co-culture in liquid medium for 24 h. fungal spores (A) and bacterial cells (B) were enumerated as number per mL.9: Determination of the antifungal activity of the two bacterial isolates, NM-12 and NM-33, and a mixture of both strains by co-culture with fungus in liquid medium for 24 h.

fungal growth is expressed as g/ml dry weight.1: Oxidation of IAA .2: Candidate strain plate inverted on the fungal plate and double taped with paraffin .3: IAA production by NM-12 and NM-33 isolates under normal growth conditions.4: Influence of salt on IAA production (µg/mL) by strain NM-12 .5: The calibrated graph according to the standard OD values: .6: Siderophore production (%) by selected isolates, NM-12 and NM-13 under normal and stressed (saline) conditions .7: Glucose production under normal and saline conditions as seen by the development of red colour in NM-12 AND NM-33 tubes compared to the control (DNS) .8: A comparison of β- glucanase production (units) by the two bacterial isolates, NM-12 (blue) and NM-33 (red) under normal and saline conditions .9: Standard graph with concentration on X-axis and OD values on Y-axis .10: Percentage inhibition of Fusarium pseudograminearum growth on PDA plates by volatile compounds from bacterial isolates NM-12 and NM-33 .11: PCR gel image showing amplification of both HCN and ACC deaminase producing gene s in NM-12. 89 11 List of Tables Table 3.1: Composition of Soil extract agar .2: Composition of Tryptone soy agar .3: Composition of Nutrient agar .4: Primers used for PCR amplification of bacterial and fungal genes .5: Composition of Potato Dextrose agar (PDA) .6: Composition of Glucose Yeast (GY) extract .7: 16S rDNA sequences (5’- 3’) of bacteria isolated from Australian soils54 Table 4.1: Composition of Starch-casein broth (SCB) .2: Preparation of standards for IAA estimation .3: Composition of King’s B broth .4: Composition of Tryptone soy agar .5: Preparation of glucose standards .6: Composition of Bennet agar .7: Composition of Potato dextrose Agar .8 Absorbance values of cultures producing IAA at 530nm .9 Standard OD values .10: OD values of the two strains at 530nm .11: Standard OD values .1 BACKGROUND AND AIMS Fusarium crown rot (FCR) is a severe chronic cereal disease that infects the crown, basal stems and root tissues. It has recently become a common disease among cereals grown in Australia and worldwide. This is because the moist conditions at the beginning of the season enable the fungus to grow from infected stubble to an adjacent seedling (Hogg et al.

FCR is found in all the semi-arid regions that exist around the world (Chakraborty et al. It is caused by several Fusarium sp. Several studies reported that F. pseudograminearum is the common fungus that is generally related to the crown rot as observed in New South Wales and Queensland, Australia (Akinsanmi et al.

All the wheat and chickpea cultivating regions in Australia are affected by this disease and it is estimated that annual losses due to crown rot are $80 million and $30-$60 million for wheat and chickpea, respectively (Verrell, 2016). Studies show that 35% of wheat crop yield loss in the Pacific Northwest of USA is due to crown rot (Smiley et al. Apart from yield associated loss, FCR infected plants may produce mycotoxins in the grains that are detrimental to human health (http://www. It is therefore crucial to control FCR pathogen in the field.

Fungi, viruses, nematodes and bacterial are the most commonly observed causes of diseases in agricultural plants. Some species of fungi are known to cause important plant diseases and increased loss of agricultural crops. Plant pathogens need to be controlled to maintain the average level of yield both, quantitatively and qualitatively. Farmers often rely heavily on using chemical fungicides to control 13 these plant diseases.

However, the environmental problems surrounding the widespread use of the chemicals including synthetic fungicides have led to public concern towards the use of synthetic pesticides in agriculture. Extensive use of chemical pesticides and fungicides has become a major environmental threat; for example, the use of fertilizers, pesticides and fungicides is one of the main drivers of species extinction, leading not only to a reduced global biodiversity but also to significant changes in ecosystem dynamics (Aktar et al. Despite these disadvantages, the use of agrochemicals continues to be an invaluable and powerful method to control plant disease. However, due to the negative impacts of the application of these chemicals, there is a research drive to develop sustainable, microbial-based biocontrol agents as an alternative or supplement to agrochemicals.