Hướng dẫn chi tiết xây dựng vector CRISPR-Cas9 để bất hoạt gen CIF1 trong cà chua

Khóa luận tốt nghiệp hướng dẫn xây dựng vector CRISPR-Cas9 để bất hoạt gen CIF1 ở cà chua, ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen trong nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyen Thi Bich Ngoc
• Người hướng dẫn: Huynh Thi Thu Hue, PhD
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Construction of CRISPR/Cas9 Vector for Silencing CIF1 Gene of Tomato
• Loại tài liệu: undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGMENTS
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• ABSTRACT
• 1. GENERAL INTRODUCTION OF TOMATO
• 1.1. Overview
• 1.2. Taxonomy
• 1.3. Plant characteristics
• 1.4. Tiny-Tim Tomato
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Time and place of study
• 2.2. Leaf samples of Tiny-Tom tomato varieties
• 2.3. Vector and primer
• 2.4. Strains of bacteria: E.
• 2.5. Chemicals and reagents
• 2.6. Genome DNA extraction
• 2.7. Specific gRNA designing for CIF1 gene
• 2.8. Ligation gRNA into pRGEB31 vectors
• 2.9. Plasmid transformation into E.coli by heat shock
• 2.10. PCR technique check
• 2.11. Plasmid transformation into A. tumefaciens cells by electrical impulses
• 2.12. Sanger DNA sequencing
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Total DNA extraction of Tiny-Tom tomato
• 3.2. Exon 1 region amplifying and sequencing
• 3.3. gRNA specific designing to CIF1 gene
• 3.4. E.coli strain with gRNA-CRISPR/Cas9 vector
• 3.5. Colonies selection containing recombinant plasmids by PCR
• 3.6. Sequencing result of CRISPR/CAS9-CIF1
• 3.7. A. tumefaciens strains with gRNA-CRISPR/Cas9 vector
• 4. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Giới thiệu về CRISPR Cas9 và ứng dụng trong bất hoạt gen CIF1 ở cà chua

CRISPR-Cas9 là một công cụ chỉnh sửa gen tiên tiến, được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học. Nghiên cứu này tập trung vào việc bất hoạt gen CIF1 ở cây cà chua, một gen mã hóa protein ức chế enzyme invertase, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp đường trong quả. Việc sử dụng vector CRISPR để chỉnh sửa gen CIF1 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về chức năng của gen này mà còn mở ra tiềm năng trong việc tạo giống cây trồng có chất lượng quả tốt hơn.

1.1. Cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR Cas9

Hệ thống CRISPR-Cas9 hoạt động dựa trên việc sử dụng gRNA để định vị chính xác vị trí gen cần chỉnh sửa. Cas9 là enzyme cắt DNA, tạo ra các đột biến gen tại vị trí mong muốn. Trong nghiên cứu này, gRNA được thiết kế đặc hiệu cho gen CIF1, sau đó được gắn vào vector pRGEB31. Vector này được chuyển vào tế bào E. coli và A. tumefaciens để tạo ra các chủng vi khuẩn mang hệ thống CRISPR-Cas9 nhằm bất hoạt gen CIF1.

1.2. Ứng dụng của CRISPR Cas9 trong nông nghiệp

Việc ứng dụng CRISPR-Cas9 trong nông nghiệp đang ngày càng phổ biến, đặc biệt trong việc biến đổi gen cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện chất lượng quả cà chua mà còn có thể áp dụng cho các loại cây trồng khác. Hệ thống CRISPR mang lại hiệu quả cao về thời gian và chi phí, mở ra nhiều cơ hội trong việc phát triển các giống cây trồng có năng suất và chất lượng tốt hơn.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu được thực hiện trên giống cà chua Tiny-Tim, với mục tiêu thiết kế gRNA đặc hiệu cho gen CIF1 và tạo ra vector CRISPR-Cas9 để bất hoạt gen này. Các bước thực hiện bao gồm: trích xuất DNA, thiết kế gRNA, chuyển vector vào E. coli và A. tumefaciens, và kiểm tra kết quả bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự DNA.

2.1. Thiết kế gRNA và chuyển vector vào tế bào

gRNA được thiết kế đặc hiệu cho vùng exon 1 của gen CIF1, sau đó được gắn vào vector pRGEB31. Vector này được chuyển vào tế bào E. coli DH10B bằng phương pháp sốc nhiệt, và vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Kết quả cho thấy sự thành công trong việc tạo ra các chủng vi khuẩn mang vector CRISPR-Cas9 nhằm bất hoạt gen CIF1.

2.2. Kiểm tra kết quả bằng PCR và giải trình tự DNA

Các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, và kết quả giải trình tự DNA xác nhận sự hiện diện của gRNA trong vector. Điều này chứng minh rằng vector CRISPR-Cas9 đã được tạo thành công và sẵn sàng để chuyển vào cây cà chua nhằm bất hoạt gen CIF1.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về vai trò của gen CIF1 trong quá trình tổng hợp đường ở cà chua. Việc bất hoạt gen này có thể giúp cải thiện chất lượng quả, tăng hàm lượng đường và hương vị. Hơn nữa, phương pháp sử dụng CRISPR-Cas9 có thể được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu gen và tạo giống cây trồng, mang lại lợi ích lớn cho nông nghiệp.

3.1. Tiềm năng trong cải thiện chất lượng cây trồng

Việc bất hoạt gen CIF1 không chỉ giúp cải thiện chất lượng quả cà chua mà còn mở ra tiềm năng ứng dụng cho các loại cây trồng khác. Công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền đang ngày càng trở thành công cụ quan trọng trong việc phát triển các giống cây trồng có năng suất và chất lượng cao.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Nghiên cứu này là bước đầu tiên trong việc ứng dụng CRISPR-Cas9 để chỉnh sửa gen ở cà chua. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về các gen khác liên quan đến chất lượng quả và khả năng kháng bệnh sẽ tiếp tục được thực hiện, góp phần vào sự phát triển bền vững của nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Solanum lycopersicum) là một trong những loại cây rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao và chiếm vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp toàn cầu, với sản lượng đạt trên 171 triệu tấn trên diện tích 5 triệu hecta vào năm 2014 (theo thống kê của FAOSTAT). Chất lượng quả cà chua, đặc biệt là độ ngọt, đóng vai trò then chốt quyết định giá trị thương phẩm và thị hiếu tiêu dùng. Hàm lượng đường trong quả chín chiếm khoảng 50% trọng lượng chất khô, chủ yếu tồn tại ở dạng đường đơn hexose gồm glucose và fructose với tỷ lệ tương đương, trong khi hàm lượng đường đôi sucrose vận chuyển từ lá về quả chỉ chiếm tỷ lệ không đáng kể (dưới 0,1%).

Quá trình tích lũy đường trong quả cà chua chịu sự chi phối trực tiếp của enzyme invertase vách tế bào (Cell Wall Invertase - CWI/CWIN). Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành các phân tử monosaccharide để vận chuyển vào tế bào chất. Tuy nhiên, hoạt tính xúc tác của CWI lại bị kiểm soát và ức chế bởi protein do gen CIF1 (Cell wall inhibitor of β-fructosidase 1) mã hóa thông qua cơ chế điều hòa sau dịch mã. Yếu tố phiên mã điều hòa chín quả RIN (Ripening Inhibitor) cũng tham gia kích hoạt biểu hiện của gen CIF1. Việc bất hoạt gen CIF1 được xác định là hướng tiếp cận tiềm năng nhằm giải phóng hoạt tính enzyme CWI, từ đó tăng cường quá trình thủy phân sucrose và nâng cao hàm lượng đường đơn trong quả.

Trước đây, kỹ thuật can thiệp RNA (RNAi) đã được thử nghiệm để ức chế chất ức chế invertase, làm tăng 70% lượng đường ở quả cà chua 10 ngày tuổi và tăng hoạt tính invertase từ 40% đến 65% ở lá. Tuy nhiên, phương pháp RNAi truyền thống gặp nhược điểm là các locus chuyển gen bắt buộc phải duy trì qua quá trình chọn giống, tiềm ẩn nhiều nguy cơ phân ly di truyền không mong muốn. Trong khi đó, các kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen thế hệ mới như ZFNs (Zinc-finger nucleases) hay TALENs (Transcription activator-like effector nucleases) đòi hỏi thiết kế protein phức tạp, chi phí cao và kích thước vector lớn. Sự ra đời của hệ thống CRISPR/Cas9 đã mang lại giải pháp đột phá với độ chính xác cao, quy trình thao tác dựa trên RNA đơn giản và chi phí hợp lý. Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả thực hiện khóa luận tốt nghiệp: "Construction of CRISPR/Cas9 vector for silencing CIF1 gene of tomato" (Xây dựng vector CRISPR/Cas9 nhằm bất hoạt gen CIF1 ở cà chua).

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài gồm:

1. Tách chiết DNA tổng số đạt tiêu chuẩn chất lượng cao từ mô lá của giống cà chua Tiny-Tim.
2. Nhân bản và giải trình tự đoạn exon 1 của gen SlCIF1 trên giống Tiny-Tim.
3. Thiết kế các đoạn RNA dẫn đường (gRNA) đặc hiệu định hướng đến vùng exon 1 của gen SlCIF1.
4. Ghép nối đoạn gRNA vào vector biểu hiện pRGEB31 để tạo cấu trúc vector CRISPR/Cas9 tái tổ hợp.
5. Biến nạp cấu trúc tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Escherichia coli DH10B và tuyển chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
6. Xác nhận trình tự cấu trúc vector tái tổ hợp thông qua phương pháp giải trình tự Sanger.
7. Biến nạp vector tái tổ hợp hoàn chỉnh vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật tiếp theo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gen SlCIF1 (mã số định danh Solyc12g099200 trên cơ sở dữ liệu Sol Genomics Network, mã số NC_015449.3 trên NCBI) trên hệ gen của giống cà chua lùn Tiny-Tim (Solanum lycopersicum).
• Phạm vi không gian và thời gian: Toàn bộ nội dung thực nghiệm được triển khai từ tháng 09/2020 đến tháng 01/2021 tại Phòng thí nghiệm Đa dạng Di truyền Genome, Viện Nghiên cứu Hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết về sinh học phân tử thực vật, cơ chế sinh hóa chuyển hóa carbohydrate và nguyên lý hoạt động của các công cụ chỉnh sửa hệ gen:

1. Cơ chế điều hòa trao đổi chất đường ở thực vật: Sucrose tạo ra từ quang hợp được vận chuyển từ cơ quan nguồn đến cơ quan chứa. Tại đây, nhóm enzyme acid invertase bao gồm CWI (tại vách tế bào) và VI (tại không bào) giữ vai trò chủ chốt trong việc phân giải sucrose thành hexose. Protein ức chế invertase (INVINH) gồm 2 phân nhóm: VIF (ức chế VI) và CIF1, CIF2 (ức chế CWI). Sự tương tác giữa protein CIF1 và CWI tạo thành phức hệ bất hoạt, làm giảm khả năng tích lũy đường đơn. Bất hoạt SlCIF1 là cơ chế trực tiếp để duy trì hoạt tính CWI ở mức cao.
2. Nguyên lý của hệ thống CRISPR/Cas9: Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 loại II có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptococcus pyogenes sử dụng endonuclease Cas9 kết hợp với một phân tử gRNA chimeric (dung hợp giữa crRNA và tracrRNA). Phân tử gRNA chứa đoạn 17–20 nucleotide ở đầu 5' dẫn đường Cas9 nhận diện vị trí đích bổ sung nằm liền kề với motif PAM (Protospacer Adjacent Motif: 5'-NGG-3'), kích hoạt hai domain nuclease cắt đứt hai mạch DNA tạo vết đứt gãy mạch đôi (DSB), từ đó gây đột biến lệch khung đọc mã thông qua cơ chế sửa chữa nối đầu không tương đồng (NHEJ).

Hệ thống phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ gồm các kỹ thuật:

• Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Sử dụng phương pháp CTAB cải tiến từ mô lá non nghiền trong nitơ lỏng, ủ với đệm chiết (0,05M EDTA pH 8,0; 1% β-mercaptoethanol; 2% CTAB), xử lý loại bỏ RNA bằng dung dịch RNase (0,01 mg/ml), tinh sạch protein bằng hỗn hợp dung môi Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), kết tủa DNA bằng Natri axetat (0,3M) và Ethanol 100%, sau đó rửa kết tủa bằng Ethanol 70%. Đánh giá chất lượng DNA bằng điện di gel agarose 1% và đo độ hấp thụ quang phổ bằng máy NanoDrop ở bước sóng $A_{260}/A_{280}$.
• Phương pháp thiết kế gRNA in silico: Khai thác trình tự tham chiếu trên NCBI (NC_015449.3) và Solgenomics (Solyc12g099200). Ứng dụng công cụ tin sinh học CRISPR-P 2.0 để sàng lọc các đoạn gRNA có tỷ lệ GC từ 40% đến 60%, nhiệt độ bắt mồi $T_m$ từ 50°C đến 65°C, điểm on-target cao và không có vị trí bắt cặp sai lệch (mismatch) với các vùng mã hóa (CDS) khác trong hệ gen.
• Phương pháp tạo duplex oligo và phản ứng cắt - nối (Cut-ligation): Tạo mạch đôi gRNA từ hai sợi đơn bằng chu trình biến tính - hồi tính (95°C trong 5 phút, hạ dần xuống 25°C trong 30 phút). Lắp ghép duplex gRNA vào plasmid pRGEB31 (kích thước 15.037 bp) bằng phản ứng Golden Gate một bước kết hợp enzyme cắt giới hạn BsaI và enzyme nối T4 DNA Ligase với chu trình nhiệt luân chuyển (37°C trong 5 phút, 20°C trong 5 phút, lặp lại 40 chu kỳ; xử lý 50°C trong 10 phút, 80°C trong 10 phút và giữ ở 16°C).
• Phương pháp biến nạp vi khuẩn:
  • Biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli chủng DH10B bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây, ủ phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C (lắc 200 rpm trong 1 giờ), sau đó cấy gạt lên đĩa thạch LB chứa kháng sinh Kanamycin (nồng độ 50 µg/ml).
  • Biến nạp vào chủng A. tumefaciens EHA105 bằng phương pháp xung điện (Electroporation) với thông số điện áp 2.500 V, điện trở 200 $\Omega$, điện dung 25 $\mu$F trên cuvet 0,1 cm; phục hồi ở 28°C và sàng lọc trên môi trường LB chứa Kanamycin (50 µg/ml).
• Phương pháp tách chiết plasmid: Áp dụng phương pháp dung dịch kiềm cổ điển (dung dịch I: Tris-HCl, Glucose, EDTA; dung dịch II: SDS; dung dịch III: Potassium acetate và Glacial acetic acid), tinh sạch bằng phenol/chloroform và kết tủa bằng ethanol.
• Phương pháp giải trình tự gen Sanger: Thực hiện trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI 3500 sử dụng bộ hóa chất BigDye Terminator, phân tích và căn chỉnh trình tự bằng phần mềm BioEdit.

---

Nội dung chính theo từng chương

General introduction & Researches of tomatoes (Chương 1 & Chương 2: Giới thiệu và Tổng quan tài liệu)

Chương tổng quan hệ thống hóa các tư liệu khoa học về nguồn gốc, phân loại học của cây cà chua theo hệ thống IAPT (thuộc chi Solanum, họ Solanaceae), đặc điểm sinh học và hình thái học của giống cà chua lùn Tiny-Tim (được Đại học New Hampshire giới thiệu năm 1945, cây cao 20–40 cm, quả dạng cherry đường kính khoảng 2 cm). Tác giả tổng thuật chi tiết các hướng nghiên cứu tạo giống cà chua chuyển gen kháng sâu bệnh (như gen Cry2Ab, gen NPR1) và cải thiện năng suất.

Trọng tâm của chương phân tích sâu về cơ chế chuyển hóa đường ở quả cà chua, vai trò của hệ enzyme invertase và sự ức chế của protein CIF1 đối với CWI. Đồng thời, chương 2 so sánh toàn diện ưu nhược điểm của ba thế hệ công nghệ chỉnh sửa gen: ZFNs (kích thước cDNA 1 kb, khó thiết kế chuỗi zinc-finger), TALENs (kích thước cDNA 3 kb, cồng kềnh và đắt đỏ) và CRISPR/Cas9 (sử dụng RNA dẫn đường linh hoạt, dễ thiết kế và hiệu quả cao trong công nghệ tế bào thực vật).

Materials and Methods (Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Trình bày chi tiết toàn bộ danh mục trang thiết bị, hóa chất, chủng vi sinh vật và các bước thực nghiệm. Tác giả đã thiết kế và tổng hợp hệ thống mồi PCR phục vụ cho việc nhân bản exon 1 và sàng lọc cấu trúc tái tổ hợp:

Tên mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Chiều dài (bp)	Mục đích sử dụng
Sol200E1-F	CCCACCGAAAACACAAAGCA	20	Nhân bản phân đoạn exon 1 gen SlCIF1
Sol200E1-R	GCAACCAGTAAGATAGGGTCGAA	23	Nhân bản phân đoạn exon 1 gen SlCIF1
OsU3-F	GAACACTGGGTACGTTGGAAAC	22	Giải trình tự kiểm tra vùng gRNA
OsU3-R	CTGGAGATTATTGCTCGGGTAGA	22	Kiểm tra PCR khuẩn lạc mang gRNA

Chương này cũng thiết lập công thức và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại exon 1 (sử dụng DreamTaq Master Mix 2X, chu trình 38 chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi tối ưu $53^\circ\text{C} - 55^\circ\text{C}$), phản ứng tạo oligo-duplex của gRNA1 và gRNA2, cùng quy trình biến nạp tế bào vi khuẩn.

Results and Discussion (Chương 4: Kết quả và thảo luận)

Chương 4 ghi nhận các kết quả thực nghiệm đạt được theo trình tự nghiên cứu:

1. Tách chiết DNA tổng số: Điện di gel agarose 1% cho thấy băng DNA tổng số từ mô lá non Tiny-Tim sáng, rõ nét, có trọng lượng phân tử lớn, không có vệt mờ của RNA thoái hóa. Chỉ số đo quang phổ đạt giá trị $A_{260}/A_{280} \approx 1{,}875$, khẳng định độ tinh sạch cao của mẫu DNA.
2. Nhân bản và giải trình tự exon 1 gen SlCIF1: Phản ứng PCR với cặp mồi Sol200E1-F/R cho sản phẩm có kích thước khoảng 600 bp ở cả hai mức nhiệt độ gắn mồi 53°C và 55°C. Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen sau tinh sạch thu được 535 bp. Căn chỉnh với trình tự chuẩn (CIF1_Ref) trên GenBank cho thấy độ tương đồng rất cao, chỉ xuất hiện 03 vị trí nucleotide khác biệt tại vị trí 40, 41 và 390.

CIF1_F:   ATCMATCCATTTACTATATAAAAAAACATACACACACAC--TATACTCCATACAAAGAAA
CIF1_Ref: ATCCATCCATTTACTATATAAAAAAACATACACACACACACTATACTCCATACAAAGAAA

3. Thiết kế và tuyển chọn gRNA: Từ công cụ CRISPR-P 2.0, hai trình tự gRNA nằm trong khung đọc mở của exon 1 đã được lựa chọn:

Ký hiệu gRNA	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$)	Hàm lượng GC (%)	Chiều dài (bp)	Điểm On-target
CIF1-G1	GGCACCTATGTTGCTAGTAACAAGT	$55^\circ\text{C}$	41,8%	24	0,61 (cao)
CIF1-G2	Được chọn lọc theo tiêu chí tin sinh học	Phù hợp	40% – 60%	17–24	Trung bình

4. Tạo dòng trên E. coli và sàng lọc colony PCR: Sau khi biến nạp sản phẩm nối pRGEB31 mang gRNA vào E. coli DH10B, kiểm tra colony PCR bằng mồi đặc hiệu (OsU3-R phối hợp cùng mồi xuôi gRNA) cho ra phân đoạn kích thước lý thuyết ~230 bp:
   • Cấu trúc pRGEB31-CIF1-G1: Thu được 3 khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc số 3, 4, 5).
   • Cấu trúc pRGEB31-CIF1-G2: Thu được 4 khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc số 1, 2, 4, 5).
5. Giải trình tự kiểm tra vector pRGEB31 tái tổ hợp:
   • Với pRGEB31-CIF1-G1: Các mẫu giải trình tự bằng mồi OsU3-F xuất hiện nhiều đỉnh tín hiệu nhiễu và trình tự gRNA đọc được không khớp với thiết kế ban đầu, do đó bị loại bỏ.
   • Với pRGEB31-CIF1-G2: Kết quả giải trình tự cho thấy các khuẩn lạc số 1, 2 và 5 mang trình tự gRNA hoàn toàn chính xác theo thiết kế; riêng khuẩn lạc số 4 có kích thước PCR tương đương nhưng trình tự chèn sai khác. Ba dòng vi khuẩn mang plasmid chuẩn (1, 2, 5) được bảo quản trong glycerol 30% ở nhiệt độ -80°C.
6. Biến nạp plasmid vào Agrobacterium tumefaciens EHA105: Chuyển plasmid pRGEB31-CIF1-G2 (từ dòng clone 1) vào tế bào khả nạp A. tumefaciens EHA105 bằng xung điện. Tách chiết plasmid kiểm tra điện di gel cho thấy băng vector kích thước lớn trên 10 kb (kích thước lý thuyết vector tái tổ hợp > 15 kb). Phản ứng colony PCR kiểm tra các khuẩn lạc 1, 2, 4 với cặp mồi OsU3-R và mồi đảo của gRNA2 cho băng đặc hiệu rõ ràng có kích thước khoảng 300 bp, khẳng định việc tạo dòng thành công.

Conclusion and Recommendations (Chương 5: Kết luận và kiến nghị)

Tổng kết ngắn gọn các kết quả kỹ thuật đạt được và đề xuất các bước triển khai tiếp theo trên mô cây thực tế.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm cụ thể

• Tinh sạch thành công DNA tổng số từ lá cà chua Tiny-Tim với tỷ số $A_{260}/A_{280} \approx 1{,}875$, loại bỏ triệt để tạp chất và RNA.
• Khuếch đại thành công vùng exon 1 gen SlCIF1 kích thước ~600 bp và giải trình tự chính xác đoạn 535 bp, xác định 03 nucleotide đa hình tại vị trí 40, 41, 390 so với cơ sở dữ liệu tham chiếu NCBI.
• Thiết kế 02 trình tự gRNA (G1 và G2) đặc hiệu cho vùng exon 1 của gen SlCIF1 bằng CRISPR-P 2.0.
• Tạo dòng thành công cấu trúc vector biểu hiện nhị thể pRGEB31-CIF1-G2 (kích thước gốc vector 15.037 bp) mang gRNA tái tổ hợp hoàn toàn chính xác.
• Thiết lập và lưu trữ thành công các chủng vi khuẩn E. coli DH10B mang vector pRGEB31-CIF1-G2 (các dòng clone 1, 2, 5) tại -80°C.
• Biến nạp và xác nhận thành công sự hiện diện của vector pRGEB31-CIF1-G2 trong chủng vi khuẩn lây nhiễm thực vật A. tumefaciens EHA105 bằng phương pháp xung điện và colony PCR (sản phẩm PCR đạt kích thước ~300 bp ở các khuẩn lạc 1, 2, 4).

Đóng góp của đề tài

• Hoàn thiện trọn vẹn quy trình tạo vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu vào gen kiểm soát hàm lượng đường SlCIF1 ở cây cà chua.
• Cung cấp chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector pRGEB31-CIF1-G2 đạt chuẩn chất lượng sinh học phân tử, sẵn sàng phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu biến nạp tạo giống cà chua chuyển gen cải thiện độ ngọt.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi nghiên cứu của khóa luận mới dừng lại ở bước tạo dòng vector tái tổ hợp trong vi khuẩn (E. coli và A. tumefaciens), chưa tiến hành biến nạp trên mô sẹo/mô lá và tái sinh cây cà chua Tiny-Tim in vitro.
• Cấu trúc vector mang đoạn chèn gRNA1 (pRGEB31-CIF1-G1) gặp lỗi trong quá trình nối hoặc đọc giải trình tự nên không sử dụng được, làm giảm số lượng cấu trúc đối chứng thử nghiệm.
• Chưa có dữ liệu thực nghiệm đánh giá hiệu quả cắt đột biến in vivo, mức độ ức chế gen SlCIF1, hoạt tính enzyme CWI và hàm lượng đường thực tế tích lũy trên quả.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Sử dụng chủng A. tumefaciens EHA105 mang plasmid pRGEB31-CIF1-G2 để tiến hành chuyển gen vào các lát cắt lá mầm hoặc mô sẹo của giống cà chua Tiny-Tim.
• Tái sinh chồi, chọn lọc dòng cây chuyển gen trên môi trường kháng sinh thích hợp và kiểm tra đột biến lệch khung gen SlCIF1 bằng giải trình tự hệ gen.
• Phân tích hóa sinh đánh giá hoạt tính enzyme acid invertase và định lượng các loại đường (sucrose, glucose, fructose) trên quả cà chua chuyển gen ở các giai đoạn chín khác nhau (từ giai đoạn xanh đẫy - Mature Green đến giai đoạn chín đỏ - Red Ripe).

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm chi tiết cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Nông nghiệp công nghệ cao và Sinh học phân tử thực vật:

• Tham khảo quy trình kỹ thuật: Tài liệu mô tả chi tiết các bước từ tách chiết DNA lá thực vật chứa nhiều hợp chất thứ sinh, khuếch đại gen mục tiêu, thiết kế gRNA bằng công cụ CRISPR-P 2.0 đến kỹ thuật Golden Gate (Cut-ligation) đưa oligo duplex vào vector nhị thể kích thước lớn pRGEB31 (15.037 bp).
• Quy trình sàng lọc và kiểm chứng: Phương pháp phối hợp giữa colony PCR kiểm tra kích thước phân đoạn và giải trình tự Sanger để phát hiện các dòng chèn đúng/sai là bài học thực nghiệm hữu ích cho các đề tài xây dựng vector biểu hiện.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn bất hoạt gen SlCIF1 để nghiên cứu cải thiện chất lượng quả cà chua?

Gen SlCIF1 mã hóa protein ức chế enzyme invertase vách tế bào (Cell Wall Invertase - CWI). CWI là enzyme giữ vai trò thủy phân sucrose thành các đường đơn glucose và fructose để vận chuyển vào tế bào chất. Bất hoạt gen SlCIF1 sẽ làm mất đi yếu tố ức chế CWI, giúp tăng cường hoạt tính phân giải đường của enzyme này, từ đó nâng cao độ ngọt tự nhiên của quả cà chua.

2. Sự khác biệt giữa trình tự exon 1 gen SlCIF1 của giống Tiny-Tim trong nghiên cứu so với cơ sở dữ liệu tham chiếu GenBank là gì?

Khi giải trình tự 535 bp vùng exon 1 gen SlCIF1 nhân bản từ giống Tiny-Tim và so sánh với trình tự tham chiếu (CIF1_Ref, mã số NC_015449.3/Solyc12g099200), tác giả phát hiện có 03 vị trí nucleotide khác biệt tại các vị trí 40, 41 và 390. Việc xác định chính xác các sai khác này là điều kiện tiên quyết để thiết kế gRNA khớp tuyệt đối với hệ gen của giống nghiên cứu.

3. Vì sao cấu trúc vector pRGEB31-CIF1-G1 bị loại bỏ và không được dùng cho các bước tiếp theo?

Mặc dù phản ứng colony PCR cho thấy các khuẩn lạc mang cấu trúc pRGEB31-CIF1-G1 (khuẩn lạc 3, 4, 5) có phân đoạn kích thước ~230 bp, kết quả giải trình tự Sanger với mồi OsU3-F lại xuất hiện nhiều đỉnh tín hiệu nhiễu và trình tự đoạn gRNA đọc được không chính xác so với thiết kế. Do đó, cấu trúc này không đạt tiêu chuẩn để chuyển vào A. tumefaciens.

4. Phương pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH10B và A. tumefaciens EHA105 khác nhau như thế nào?

• Đối với E. coli DH10B: Sử dụng phương pháp sốc nhiệt (Heat shock) ở 42°C trong 60 giây sau khi ủ tế bào khả nạp với plasmid trên đá.
• Đối với A. tumefaciens EHA105: Sử dụng phương pháp xung điện (Electroporation) với thông số kỹ thuật 2.500 V, 200 $\Omega$ và 25 $\mu$F trên cuvet khoảng cách 0,1 cm, sau đó phục hồi ở 28°C.

5. Vector pRGEB31 có kích thước bao nhiêu và mang những đặc điểm cấu tạo cơ bản nào?

Vector pRGEB31 là vector chuyển gen nhị thể (binary vector) có kích thước 15.037 bp được cung cấp bởi Addgene. Vector này chứa khung đọc mã biểu hiện enzyme Cas9, promoter U3 định hướng phiên mã gRNA thực vật, các vị trí cắt giới hạn nhận diện bởi enzyme BsaI phục vụ chèn oligo gRNA, cùng gen chỉ thị chọn lọc kháng kháng sinh Kanamycin.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc đã hoàn thành mục tiêu xây dựng thành công cấu trúc vector biểu hiện CRISPR/Cas9 tái tổ hợp (pRGEB31-CIF1-G2) đặc hiệu định hướng đến vùng exon 1 của gen SlCIF1 trên cây cà chua. Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA chất lượng cao, xác định đặc điểm trình tự exon 1 giống cà chua Tiny-Tim và chứng minh hiệu quả chèn đoạn gRNA thông qua giải trình tự Sanger. Kết quả tạo thành công chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid pRGEB31-CIF1-G2 cung cấp nguồn vật liệu quan trọng cho các bước chuyển gen thực nghiệm nhằm nâng cao hàm lượng đường và chất lượng quả cà chua.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY UNDERGRADUATE THESIS TITLE CONSTRUCTION OF CRISPR/CAS9 VECTOR FOR SILENCING CIF1 GENE OF TOMATO HANOI – 2021 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY UNDERGRADUATE THESIS TITLE CONSTRUCTION OF CRISPR/CAS9 VECTOR FOR SILENCING CIF1 GENE OF TOMATO STUDENT: Nguyen Thi Bich Ngoc MAJOR: Biotechnology SUPERVISORS: Huynh Thi Thu Hue, PhD. Institue of Genome Research, VAST Tran Thi Hong Hanh, MSc. Vietnam National University of Agriculture HANOI – 2021 COMMITMENT I hereby undertake that this is my research project under the scientific guidance of PhD. Huynh Thi Thu Hue and MSc.TranThi Hong Hanh.

The results and data in this thesis have not been published by anyone in any way. This is part of the findings of the Genome Biodiversity Laboratory - Institute of Genome Research. I confirm that all information and data from articles and sources of other authors contain full citations and references from official sources. I take full responsibility for this guarantee.

Hanoi Student Nguyen Thi Bich Ngoc i ACKNOWLEDGMENTS First and foremost, I would like to express my deep thanks to PhD. Huynh Thi Thu Hue, Assoc. Prof Nguyen Xuan Canh, MSc. Tran Thi Hong Hanh, who helped me with my graduation thesis.

They taught me wholeheartedly as well as always created the most favorable conditions for me during the experiments to complete this graduation thesis. I would like to express my sincere thanks to the Vietnam National University of Agriculture, the Faculty Board and the teachers in the Faculty of Biotechnology for creating an interesting learning environment and providing me with invaluable knowledge. as valuable experiences during the past 4 years. During the course of the thesis at the Laboratory of Genome Biodiversity, Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) with the enthusiasm of PhD.

Huynh Thi Thu Hue and staff of laboratory helped me complete my thesis and draw me a lot of experience. They are really dedicated to the profession, devote their best and have inspired me great inspiration in scientific research. Once again, I would like to express my deep thanks to the people who helped me to complete my thesis, and the leadership of the Institute of Genome Research for creating conditions for me to work here. In the end, it is impossible not to mention my parents.

I would like to express my deep thanks to my parents who always supported and encouraged me throughout the thesis making process and life in general. Once again, I would like to send my sincere thanks to everyone! Student Nguyen Thi Bich Ngoc ii TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGMENTS. ii TABLE OF CONTENTS. iii LIST OF TABLES.

v LIST OF FIGURES. vi LIST OF ABBREVIATIONS. General introduction of Tomato. Tiny-Tim Tomato.

Studies of tomatoes. Researches on disease resistance and yield enhancement. Researches on fruit quality. CIF1 gene in plants.

Biological techniques for gene editing technology. ZFNs and TALENs. MATERIALS AND METHODS. Time and place of study.

Leaf samples of Tiny-Tom tomato varieties. Vector and primer. Strains of bacteria: E. Chemicals and reagents.

Genome DNA extraction. Specific gRNA designing for CIF1 gene. Ligation gRNA into pRGEB31 vectors. Plasmid transformation into E.coli by heat shock.

PCR technique check. Plasmid transformation into A. tumefaciens cells by electrical impulses. Sanger DNA sequencing.

RESULTS AND DISCUSSION. Total DNA extraction of Tiny-Tom tomato. Exon 1 region amplifying and sequencing. gRNA specific designing to CIF1 gene .coli strain with gRNA-CRISPR/Cas9 vector.

Colonies selection containing recombinant plasmids by PCR. Sequencing result of CRISPR/CAS9-CIF1. tumefaciens strains with gRNA-CRISPR/Cas9 vector. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS.

36 iv LIST OF TABLES Table 3. List of primers. Composition of PCR reaction. The composition reaction denaturation and renaturation created SlCIF1-G1 and SlCIF1-G2.

Components that cut- ligation the vector and heating cycle. Components PCR multiply the CIF1-G1 fragment. Components PCR multiply the CIF1-G2 fragment. The sequence of gRNAs.

30 v LIST OF FIGURES Figure 1. Tiny-Tim Tomatoes. CIF1 gene in Tomato. Mechanism of CRISPR/Cas9 systems.

Schematic structure of pRGEB31 vector .