Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Curcumin là hợp chất polyphenol tự nhiên được chiết xuất từ thân rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.), nổi bật với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị trong y dược như kháng viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus và dập tắt gốc tự do gây oxy hóa. Các thử nghiệm lâm sàng ghi nhận curcumin có độ an toàn cao, cơ thể người có thể dung nạp liều lên đến 8 g/ngày mà không xuất hiện độc tính hay tác dụng phụ nghiêm trọng. Mặc dù sở hữu phổ hoạt tính rộng, curcumin lại bộc lộ hạn chế lớn về mặt dược động học: độ tan trong nước rất kém, tính kém bền trong môi trường sinh lý và tốc độ chuyển hóa nhanh, dẫn đến sinh khả dụng đường uống thấp.

Về mặt cấu trúc, khung phân tử curcumin bao gồm hai vòng thơm liên kết đối xứng với mạch heptadiene chứa hệ $\beta$-diketone hỗ biến enol. Hoạt tính sinh học của curcumin phụ thuộc trực tiếp vào ba trung tâm phản ứng: nhóm hydroxyl dạng para (-OH) và methoxy dạng meta (-OCH3) trên hai nhân benzene; hệ nối đôi liên hợp $\alpha,\beta$-unsaturated; và cụm chức $\beta$-diketone trung tâm. Việc biến đổi hóa học tại các vị trí này là hướng đi nhằm tìm kiếm các hợp chất tương tự có độ bền sinh học cao hơn hoặc gia tăng hoạt tính chuyên biệt.

Tại Việt Nam, phần lớn các công trình nghiên cứu trước đây tập trung vào kỹ thuật trích ly và phân lập curcuminoid từ củ nghệ hoặc tinh bột nghệ thô để làm tiền chất biến tính. Tuy nhiên, quy trình chiết tách tự nhiên thường chịu ảnh hưởng bởi nguồn nguyên liệu theo mùa vụ, hiệu suất phân lập hạn chế và chi phí dung môi cao. Do đó, việc xây dựng quy trình tổng hợp toàn phần các dẫn xuất curcuminoid đi từ những chất nền benzaldehyde thương mại mang nhóm thế đặc thù là một hướng tiếp cận có tính chủ động cao. Đề tài lựa chọn 3,4-difluorobenzaldehyde làm chất nền ban đầu nhằm gắn các nguyên tử flo có độ âm điện lớn vào nhân thơm, kết hợp đóng vòng dị vòng pyrazole tại vị trí $\beta$-diketone để đánh giá sự thay đổi cấu trúc và hoạt tính kháng oxy hóa.

Nhiệm vụ nghiên cứu được xác định cụ thể gồm bốn nội dung:

  1. Tổng hợp thành công 02 dẫn xuất curcumin từ chất nền 3,4-difluorobenzaldehyde.
  2. Tinh chế và xác định độ tinh khiết của các sản phẩm thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của 02 dẫn xuất bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$), phổ tương quan dị nhân 2D (HSQC) và phổ khối lượng (MS).
  4. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các dẫn xuất tổng hợp được thông qua mô hình quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và xác định giá trị $\text{IC}_{50}$.

Khóa luận được thực hiện từ ngày 17/02/2020 đến ngày 17/08/2020. Các nội dung tổng hợp hữu cơ, tinh chế và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro được tiến hành tại phòng thí nghiệm B213 thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh. Phép đo nhiệt độ nóng chảy được thực hiện tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Trường Đại học Lạc Hồng. Các phân tích phổ nghiệm ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, MS) được đo tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội). Tra cứu dữ liệu cấu trúc hóa học mới được đối chiếu qua hệ thống SciFinder tại Đại học Quốc gia Trung ương Đài Loan (National Central University Taiwan).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của đề tài dựa trên phản ứng ngưng tụ aldol cải tiến của Pabon để tổng hợp các hợp chất $\beta$-diketone đối xứng không no. Khi cho acetylacetone (2,4-pentanedione) phản ứng với benzaldehyde, hydro tại vị trí C3 giữa hai nhóm carbonyl có tính acid mạnh hơn nhiều so với hydro tại hai nhóm methyl đầu mạch (C1 và C5), dễ dẫn đến phản ứng Knoevenagel không mong muốn tại C3. Để định hướng phản ứng xảy ra chọn lọc tại hai vị trí C1 và C5, phức chất boron oxide ($\text{B}_2\text{O}_3$) được sử dụng để khóa dạng enol của acetylacetone. Phức boron ngăn cản sự deproton hóa tại C3, đồng thời xúc tác base yếu $n$-butylamine sẽ bứt proton tại C1 và C5 tạo carbanion tấn công ái nhân vào carbon carbonyl của 3,4-difluorobenzaldehyde. Hợp chất tri-$n$-butyl borate được thêm vào nhằm mục đích thu giữ phân tử nước sinh ra từ phản ứng ngưng tụ, qua đó thúc đẩy cân bằng chuyển dịch về phía tạo sản phẩm. Sau khi tạo khung curcuminoid, phức boron được giải phóng bằng cách thủy phân trong dung dịch acid vô cơ ($\text{HCl}$).

Đối với phản ứng chuyển hóa dị vòng, cơ chế dựa trên sự tấn công ái nhân của tác nhân dinucleophile hydrazine hydrate ($\text{N}_2\text{H}_4\cdot\text{H}_2\text{O}$) vào hai nhóm carbonyl của hệ $\beta$-diketone. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid acetic ($\text{CH}_3\text{COOH}$) đóng vai trò xúc tác và dung môi, trải qua hai giai đoạn hình thành liên kết imine, tách nước và khép vòng 1,2-azole để tạo khung 1H-pyrazole bền vững.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Vận hành hệ thống phản ứng hồi lưu có khuấy từ và kiểm soát nhiệt độ nghiêm ngặt ở 70 °C đối với phản ứng ngưng tụ aldol và 80 °C đối với phản ứng đóng vòng pyrazole.
  • Phương pháp tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết: Tiến trình phản ứng và thành phần các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) tráng sẵn silica gel $60\text{ F}_{254}$ (Merck, Đức), soi dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm. Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột cổ điển sử dụng pha tĩnh silica gel với tỷ lệ khối lượng chất hấp phụ so với mẫu thô là 50:1, tỷ lệ chiều cao và đường kính cột là 7:1, giải ly bằng hệ dung môi phân cực tăng dần $n$-hexane : ethyl acetate. Đo nhiệt độ nóng chảy của tinh thể trên máy Krüss M5000 với tốc độ nâng nhiệt 1 °C/phút, sau khi đã kiểm chuẩn thiết bị bằng chất chuẩn acid benzoic tinh khiết (nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm 123,1 °C).
  • Phương pháp phân tích cấu trúc: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$) tại tần số 500 MHz và phổ carbon ($^{13}\text{C-NMR}$) tại tần số 125 MHz trên thiết bị Bruker Avance III sử dụng dung môi deuterated chloroform ($\text{CDCl}_3$). Xác định tương quan giữa proton và carbon trực tiếp qua phổ 2D HSQC. Phổ khối lượng phân giải ion hóa hóa học (CI-MS) được ghi nhận trên máy Finnigan MAT SSQ-7000 (Agilent Technologies) để xác định khối lượng phân tử.
  • Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro: Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH ở nồng độ 0,1 mM trong ethanol 99,5%. Chuỗi nồng độ mẫu thử được khảo sát từ 0,3 µM đến 333 µM (pha loãng từ nồng độ gốc 33 µM). Hỗn hợp phản ứng được ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đo độ hấp thu quang phổ UV-Vis tại bước sóng $\lambda = 517\text{ nm}$ trên máy quang phổ tử ngoại - khả kiến UH5300 với thể tích đo 3,75 mL trong cuvette 4 mL. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ. Khả năng ức chế (%I) được tính theo công thức: $$%I = 1 - \frac{S}{C}$$ Trong đó $S$ là độ hấp thu quang của mẫu thử và $C$ là độ hấp thu quang của mẫu đối chứng (control). Giá trị nồng độ ức chế 50% ($\text{IC}_{50}$) được tính toán thông qua phần mềm Origin 2020 bằng thuật toán khớp hàm phi tuyến Logistic (Logistic Fit of Concatenated Data).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về cây nghệ vàng (Curcuma longa L.), nguồn gốc phân bố địa lý và hàm lượng các hợp chất tự nhiên trong thân rễ. Nghệ thuộc họ gừng (Zingiberaceae), chứa từ 3% đến 5% tinh dầu và khoảng 6% phức hệ hợp chất màu curcuminoid. Trong đó, curcumin chiếm tỷ lệ chủ đạo từ 70% đến 80%, phần còn lại là demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC). Tác giả dẫn chứng bảng thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong 100 g thân rễ nghệ (năng lượng 390 kcal, carbohydrate 69,9 g, chất béo 8,9 g, protein 8,5 g, phospho 260 mg, sắt 47,5 mg).

Tiếp theo, chương luận giải chi tiết các cơ chế tác động sinh học của curcumin:

  • Kháng oxy hóa: Hoạt động như một phân tử bẫy gốc tự do, ngăn chặn phản ứng chuỗi peroxide hóa lipid màng và bảo vệ cấu trúc DNA.
  • Kháng viêm: Ức chế yếu tố phiên mã nhân $\text{NF-}\kappa\text{B}$, từ đó ngăn chặn sự biểu hiện của các enzyme gây viêm như cyclooxygenase-2 (COX-2), lipoxygenase (LOX) và nitric oxide synthase cảm ứng (iNOS).
  • Kháng đông máu: Hạn chế hoạt động của cyclooxygenase tham gia hình thành tiểu cầu.
  • Kháng tế bào ung thư: Điều hòa chu trình chết tự nhiên (apoptosis) và ức chế sự tăng sinh, di căn của nhiều dòng tế bào ác tính ở vú, phổi, đại tràng, tuyến tiền liệt.

Về mối liên hệ cấu trúc - hoạt tính (pharmacophore), chương phân tích rằng liên kết đôi olefin và các nhóm thế trên vòng benzene đóng vai trò then chốt đối với độc tính chọn lọc trên tế bào ung thư, trong khi nhóm phenolic là trung tâm quét gốc tự do. Chương tổng thuật các công trình nghiên cứu nổi bật trên thế giới: Bo Ram Kim và cộng sự phát triển dẫn xuất ức chế sialidase từ S. perfringens; Ohtsu tổng hợp các dẫn xuất curcuminoid có tác dụng kháng ung thư tuyến tiền liệt mạnh hơn hydroxyflutamide; Lozada-Garcia biến đổi khung curcumin thành các dị vòng isoxazole và pyrazole; Yum Eryanti tổng hợp các dẫn xuất piperidone. Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Phan Tống Sơn, Đào Hùng Cường, Lưu Thị Huế và luận án của Phan Thị Hoàng Anh (tổng hợp 30 dẫn xuất curcuminoid) được đối chiếu. Từ đó, tác giả chỉ ra điểm mới của đề tài: thay vì chiết tách phức tạp từ dược liệu tự nhiên, nghiên cứu lựa chọn hướng tổng hợp hóa học hữu cơ trực tiếp từ 3,4-difluorobenzaldehyde để tạo ra các dẫn xuất chứa nguyên tử halogen (flo) trên vòng thơm và khép vòng dị vòng pyrazole.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất, bao gồm: 3,4-difluorobenzaldehyde (97%, Acros Organics), acetylacetone ($\ge 99,5%$, Acros Organics), boron oxide (99%, Acros Organics), tri-$n$-butyl borate (98%, Aladin), $n$-butylamine (99,5%, Acros Organics), hydrazine hydrate ($> 80%$, Trung Quốc), acid acetic băng (99,5%, Trung Quốc), dichloromethane (99,9%, Acros Organics), ethyl acetate, hydrochloric acid, silica gel 60 $F_{254}$ và ethanol 99,5%.

Quy trình tổng hợp hai hợp chất được trình bày cụ thể:

  • Hợp chất MT01 ((1E,4Z,6E)-1,7-bis(3,4-difluorophenyl)-5-hydroxyhepta-1,4,6-trien-3-one): Cho 1,445 mL acetylacetone vào bình cầu hai cổ 250 mL chứa 35 mL ethyl acetate, thêm 3,4-difluorobenzaldehyde, $\text{B}_2\text{O}_3$ và tri-$n$-butyl borate. Gia nhiệt khuấy từ ở 70 °C trong 15 phút. Nhỏ từ từ dung dịch gồm 0,73 mL tri-$n$-butylamine pha trong 1,27 mL ethyl acetate qua kim tiêm trong vòng 30 phút. Theo dõi phản ứng bằng TLC sau mỗi 2 giờ; phản ứng đạt cân bằng sau 6 giờ khuấy ở 70 °C. Thêm 25 mL dung dịch $\text{HCl}$ 1,0 M vào hỗn hợp và khuấy tiếp 60 phút ở 70 °C để thủy phân phức boron. Chiết 3 lần bằng dichloromethane ($3 \times 30\text{ mL}$), rửa bằng dung dịch $\text{NaHCO}_3$ bão hòa, làm khan pha hữu cơ bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$, cô quay thu cao thô rồi nạp silica gel chạy sắc ký cột giải ly bằng hệ $n$-hexane : ethyl acetate (tỷ lệ 95:5 v/v).
  • Hợp chất MT03 (3,5-bis((E)-3,4-difluorostyryl)-1H-pyrazole): Hòa tan 200 mg (0,57 mmol) hợp chất MT01 trong 10,0 mL acid acetic băng ở bình cầu 100 mL, gia nhiệt khuấy từ tại 80 °C trong 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 58 µL hydrazine hydrate ($\text{N}_2\text{H}_4\cdot\text{H}_2\text{O}$). Theo dõi bằng TLC; phản ứng kết thúc sau 3 giờ khi tác chất phản ứng hoàn toàn. Để nguội, trung hòa bằng 50 mL dung dịch $\text{NaHCO}_3$ bão hòa, chiết dichloromethane ($3 \times 15\text{ mL}$), làm khan bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$, thu hồi dung môi và tinh chế qua cột sắc ký silica gel với hệ giải ly $n$-hexane : ethyl acetate (85:15 v/v).

Chương 2 cũng thiết lập quy trình kiểm tra TLC trên 4 hệ tỷ lệ $n$-hexane : ethyl acetate (95:5, 9:1, 8:2, 7:3 v/v), quy trình đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Krüss M5000, thông số các máy đo phổ ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, MS) và giao thức thử nghiệm DPPH xác định độ hấp thu quang tại bước sóng 517 nm với các bước nhập dữ liệu vào phần mềm Origin 2020.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tổng hợp, tinh chế, giải đoán cấu trúc và thử nghiệm sinh học của hai dẫn xuất:

  1. Đặc trưng hóa lý và cấu trúc của MT01:

    • Hợp chất MT01 thu được ở dạng tinh thể màu vàng, hiệu suất tổng hợp đạt 73%, nhiệt độ nóng chảy đo được là 133 °C, giá trị hệ số lưu $R_f = 0,21$ trong hệ dung môi giải ly $n$-hexane : ethyl acetate (9:1 v/v).
    • Công thức phân tử được xác định là $\text{C}{19}\text{H}{12}\text{O}_3\text{F}_4$, khối lượng phân tử tính toán là 348 g/mol, phù hợp với phổ khối lượng.
    • Phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CDCl}_3$): Tín hiệu mũi đơn tại $\delta = 5,81\text{ ppm}$ ($s, 1\text{H}$) đặc trưng cho proton $\text{C}_4\text{-H}$ dạng enol hỗ biến; các proton olefin gắn trên liên kết đôi xuất hiện với hằng số ghép cặp $J = 15,0\text{ Hz}$, chứng minh cấu hình không gian dạng trans ($E$); các proton trên vòng thơm benzene xuất hiện ở vùng $\delta = 7,19 - 7,37\text{ ppm}$.
    • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ghi nhận 14 tín hiệu trong vùng $\delta = 100 - 165\text{ ppm}$ thuộc các carbon bất bão hòa của nhân thơm và mạch olefin; tín hiệu tại $\delta = 183\text{ ppm}$ là carbon của nhóm carbonyl ($>\text{C=O}$). Phổ HSQC xác nhận tương quan trực tiếp giữa proton enol tại $\delta = 5,81\text{ ppm}$ với carbon ở $\delta = 102\text{ ppm}$.

  2. Đặc trưng hóa lý và cấu trúc của MT03:

    • Hợp chất MT03 thu được ở dạng tinh thể màu trắng, khối lượng 144 mg (tính từ 200 mg MT01 ban đầu), hiệu suất phản ứng đạt 73%, nhiệt độ nóng chảy sắc nét tại 212,4 °C, giá trị $R_f = 0,20$ trong hệ dung môi $n$-hexane : ethyl acetate (8:2 v/v).
    • Công thức phân tử là $\text{C}{19}\text{H}{12}\text{N}_2\text{F}_4$, khối lượng phân tử tương ứng là 344 g/mol.
    • Phổ $^1\text{H-NMR}$ ghi nhận proton tại vị trí C4 của vòng pyrazole đóng mới xuất hiện dạng mũi đơn tại $\delta = 6,613\text{ ppm}$ ($s, 1\text{H}$), tương quan với tín hiệu carbon tại $\delta = 100,5\text{ ppm}$ trên phổ 2D HSQC; hai cặp proton olefin giữ nguyên cấu hình trans với các hằng số ghép $J = 16,0\text{ Hz}$ và $J = 16,5\text{ Hz}$.
    • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ cho thấy sự biến mất của tín hiệu carbonyl tại $\delta = 183\text{ ppm}$, thay thế bằng tín hiệu carbon dị vòng $>\text{C=N}$ và $\text{=C-N}$ tại $\delta = 148,69\text{ ppm}$.
    • Đối chiếu cơ sở dữ liệu SciFinder cho thấy hợp chất MT03 (3,5-bis((E)-3,4-difluorostyryl)-1H-pyrazole) là một dẫn xuất hoàn toàn mới, chưa từng được công bố trong các tài liệu khoa học trước đó.

  3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa và biện luận cơ chế:

    • Trong phép thử quét gốc tự do DPPH, curcumin đối chứng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa rõ rệt với giá trị $\text{IC}_{50} = 11,838 \pm 0,194\ \mu\text{g/mL}$.
    • Cả hai dẫn xuất MT01 và MT03 đều được kết luận là không có hoạt tính kháng oxy hóa trong dải nồng độ thử nghiệm.
    • Tác giả biện luận rằng hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin tự nhiên bắt nguồn từ nhóm hydroxyl phenolic (-OH) trên vòng benzene; nhóm này có khả năng nhường proton $\text{H}^\bullet$ cho gốc tự do DPPH để tạo thành gốc phenoxy tự do bền vững nhờ hệ thống liên hợp giải tỏa điện tử trên toàn phân tử. Ở MT01 và MT03, các nhóm -OH và $-\text{OCH}_3$ tự nhiên đã bị thay thế hoàn toàn bởi các nguyên tử flo (-F). Nguyên tử flo có độ âm điện rất lớn và liên kết $\text{C-F}$ có năng lượng liên kết cao, không thể nhường proton hay tạo thành gốc tự do bền vững, dẫn đến việc mất hoàn toàn khả năng dập tắt gốc tự do DPPH.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp, tinh chế và đặc trưng hóa thành công hai dẫn xuất curcumin chứa nhóm thế flo từ chất nền 3,4-difluorobenzaldehyde. Dữ liệu tổng hợp và đánh giá hoạt tính được thể hiện qua bảng sau:

Tên hợp chất Công thức phân tử Khối lượng phân tử (g/mol) Trạng thái tinh thể Nhiệt độ nóng chảy (°C) Hiệu suất tổng hợp (%) Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH ($\text{IC}_{50}$)
Curcumin (đối chứng) $\text{C}{21}\text{H}{20}\text{O}_6$ 368,38 Tinh thể vàng cam 183 — $11,838 \pm 0,194\ \mu\text{g/mL}$
MT01 $\text{C}{19}\text{H}{12}\text{O}_3\text{F}_4$ 348 Tinh thể màu vàng 133 73% Không có hoạt tính
MT03 $\text{C}{19}\text{H}{12}\text{N}_2\text{F}_4$ 344 Tinh thể màu trắng 212,4 73% Không có hoạt tính

Các đóng góp khoa học chính mà tác giả đã đạt được:

  • Tổng hợp thành công dẫn xuất dị vòng MT03 (3,5-bis((E)-3,4-difluorostyryl)-1H-pyrazole). Kết quả tra cứu hệ thống dữ liệu hóa học quốc tế SciFinder tại Đại học Quốc gia Trung ương Đài Loan xác nhận đây là cấu trúc hóa học mới chưa từng được công bố trên thế giới.
  • Làm chủ quy trình tổng hợp bán vi lượng các hợp chất curcuminoid chứa flo với hiệu suất chuyển hóa ổn định (đều đạt 73%), kiểm soát tốt độ tinh khiết thông qua tối ưu hóa hệ dung môi sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
  • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định quy luật liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính (SAR): việc thay thế hoàn toàn các nhóm chức mang tính khử (hydroxyl phenolic) bằng các nguyên tử halogen (flo) trên khung thơm sẽ triệt tiêu hoàn toàn hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH, đóng góp thêm cơ sở dữ liệu cho việc định hướng thiết kế cấu trúc phân tử curcuminoid trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực nghiệm:

  • Hai dẫn xuất tổng hợp được không thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH do thiếu vắng nhóm cho hydro phenolic.
  • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở phép thử sàng lọc hoạt tính quét gốc tự do DPPH in vitro; chưa tiến hành khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư (như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư phổi) - vốn là hướng ứng dụng có tiềm năng lớn của các dẫn xuất curcuminoid đóng vòng pyrazole đã được ghi nhận trong y văn.
  • Chưa tiến hành thử nghiệm độ tan, hệ số phân bố dầu-nước và độ bền dược động học của các tinh thể dẫn xuất thu được.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

  • Mở rộng thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư và hoạt tính kháng viêm in vitro trên các dòng tế bào thực tế đối với hợp chất mới MT03 để kiểm chứng hiệu quả sinh học của khung pyrazole gắn nhóm difluoro.
  • Thực hiện các thử nghiệm đo độ tan trong các hệ dung môi sinh lý nhằm đánh giá khả năng cải thiện sinh khả dụng so với curcumin tự nhiên.
  • Thiết kế và tổng hợp các dẫn xuất curcumin mới thế hệ tiếp theo theo hướng kết hợp: duy trì nhóm hydroxyl phenolic trên nhân thơm nhằm giữ hoạt tính kháng oxy hóa, đồng thời gắn thêm nhóm thế halogen hoặc đóng vòng dị vòng pyrazole/isoxazole nhằm nâng cao tính bền hóa học và hoạt tính sinh học chọn lọc.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa hữu cơ, Hóa dược và Công nghệ Thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu cung cấp các tài liệu tham khảo cụ thể về:

  • Quy trình thực hành tổng hợp hữu cơ theo phương pháp Pabon cải tiến: kỹ thuật tạo phức với boron oxide để khóa vị trí phản ứng của hợp chất $\beta$-diketone và kỹ thuật bắt nước bằng alkyl borate.
  • Quy trình đóng vòng dị vòng pyrazole từ khung $\beta$-diketone bằng hydrazine hydrate với điều kiện phản ứng hồi lưu có độ tái lặp cao.
  • Bộ dữ liệu quang phổ nghiệm đầy đủ ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, phổ 2D HSQC, MS) cùng phương pháp quy gán tín hiệu cho các hợp chất polyphenol đối xứng mang nguyên tử flo.
  • Quy trình sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa DPPH chuẩn hóa trên máy quang phổ UV-Vis và phương pháp xử lý dữ liệu tính toán $\text{IC}_{50}$ bằng hàm phi tuyến logistic trên phần mềm chuyên dụng Origin 2020.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của boron oxide ($\text{B}_2\text{O}_3$) và tri-$n$-butyl borate trong phản ứng tổng hợp dẫn xuất MT01 là gì?
Trong phân tử acetylacetone, nguyên tử hydro tại vị trí C3 (nằm giữa hai nhóm carbonyl) có tính acid mạnh hơn nhiều so với các nguyên tử hydro ở hai nhóm methyl đầu mạch (C1 và C5). Boron oxide ($\text{B}_2\text{O}_3$) phản ứng với acetylacetone để tạo phức chelate dạng enol, giúp bảo vệ và ngăn chặn sự bứt proton tại vị trí C3. Nhờ đó, xúc tác base $n$-butylamine có thể bứt chọn lọc hai nguyên tử hydro tại C1 và C5 để tạo carbanion tấn công vào phân tử 3,4-difluorobenzaldehyde. Hợp chất tri-$n$-butyl borate được bổ sung nhằm mục đích liên kết và giữ các phân tử nước sinh ra trong quá trình ngưng tụ aldol, giúp chuyển dịch cân bằng phản ứng và nâng cao hiệu suất tổng hợp.

2. Dựa vào những dữ kiện phổ nghiệm nào để khẳng định hợp chất MT03 đã đóng vòng pyrazole thành công từ MT01?
Sự đóng vòng pyrazole thành công được chứng minh qua ba biến đổi quang phổ chính: (1) Trên phổ $^1\text{H-NMR}$, tín hiệu proton enol tại $\delta = 5,81\text{ ppm}$ của MT01 biến mất, thay vào đó xuất hiện mũi đơn tại $\delta = 6,613\text{ ppm}$ ứng với proton tại vị trí C4 của vòng pyrazole; (2) Phổ HSQC xác nhận proton tại $\delta = 6,613\text{ ppm}$ liên kết trực tiếp với carbon C4 dị vòng ở $\delta = 100,5\text{ ppm}$; (3) Trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$, tín hiệu carbonyl ($>\text{C=O}$) tại $\delta = 183\text{ ppm}$ của MT01 hoàn toàn mất đi, thay bằng tín hiệu của nhóm imine/amine dị vòng ($>\text{C=N}$ và $\text{=C-N}$) tại $\delta = 148,69\text{ ppm}$, phù hợp với công thức phân tử $\text{C}{19}\text{H}{12}\text{N}_2\text{F}_4$ và khối lượng phân tử 344 g/mol trên phổ MS.

3. Tại sao hai dẫn xuất MT01 và MT03 hoàn toàn không thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa trong thử nghiệm với DPPH?
Hoạt tính dập tắt gốc tự do của curcumin tự nhiên phụ thuộc chủ yếu vào sự hiện diện của nhóm hydroxyl phenolic (-OH) trên vòng benzene. Nhóm này có liên kết $\text{O-H}$ dễ dàng bị phân cắt đồng ly để nhường nguyên tử hydro ($\text{H}^\bullet$) cho gốc tự do DPPH, chuyển hóa gốc tự do này thành phân tử bền và bản thân curcumin biến thành gốc phenoxy ổn định nhờ giải tỏa điện tử trên hệ liên hợp dài. Ở hai dẫn xuất MT01 và MT03, các nhóm -OH và $-\text{OCH}_3$ đã bị thay thế hoàn toàn bởi các nguyên tử flo (-F). Do flo có độ âm điện rất lớn và liên kết $\text{C-F}$ rất bền vững, phân tử không thể cung cấp proton hay tạo thành gốc tự do ổn định, làm mất hoàn toàn hoạt tính kháng oxy hóa đối với DPPH.

4. Dẫn xuất MT03 có điểm gì mới so với các công trình nghiên cứu về curcuminoid đã được công bố trước đây?
Theo kết quả tra cứu cơ sở dữ liệu hóa học quốc tế SciFinder tại Đại học Quốc gia Trung ương Đài Loan (National Central University Taiwan), hợp chất MT03 (3,5-bis((E)-3,4-difluorostyryl)-1H-pyrazole) là một dẫn xuất hoàn toàn mới, chưa từng được ghi nhận hay công bố trong bất kỳ tài liệu khoa học nào trước thời điểm khóa luận được thực hiện.

5. Quy trình xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ của curcumin và các dẫn xuất trên phần mềm Origin 2020 được thực hiện theo các bước nào?
Sau khi đo độ hấp thu quang phổ ($\text{Abs}$) tại bước sóng 517 nm và tính phần trăm ức chế ($%I$) theo chuỗi nồng độ khảo sát, quy trình xử lý dữ liệu trên Origin 2020 gồm các bước: Mở phần mềm, chọn File > New > Project > Assays; chọn Input Data và nhập các giá trị nồng độ cùng $%I$ tương ứng; tại mục Select Fitting Function, đổi hàm mặc định từ Gauss sang hàm phi tuyến logistic; nhấp vào Execute fit, chọn Logistic Fit of Concatenated Data; phần mềm sẽ tự động dựng đường cong hồi quy thực nghiệm và tính ra giá trị nồng độ ức chế 50% ($\text{IC}_{50}$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Mai Thanh Tài đã tổng hợp thành công hai dẫn xuất curcuminoid từ chất nền 3,4-difluorobenzaldehyde với hiệu suất đạt 73%, trong đó dẫn xuất dị vòng pyrazole MT03 là hợp chất mới chưa từng được công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế SciFinder. Cấu trúc hóa học của các sản phẩm được xác định rõ ràng thông qua hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC) và phổ khối lượng (MS). Thử nghiệm sinh học với gốc tự do DPPH cho thấy việc thay thế nhóm phenolic tự nhiên bằng nguyên tử flo làm mất hoạt tính kháng oxy hóa, cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để định hướng cho các nghiên cứu biến đổi hóa học curcuminoid tiếp theo.