ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đang đối mặt với vấn đề kháng kháng sinh nghiêm trọng. Điều này là do một số yếu tố, bao gồm việc lạm dụng kháng sinh, thuốc kém chất lượng, giám sát không đầy đủ và sự thiếu nhận thức của cộng đồng [1, 2]. Ở cấp độ bệnh viện, người ta ước tính rằng một phần ba số kháng sinh được sử dụng là không cần thiết. Tỷ lệ này có thể còn cao hơn ở cấp độ cộng đồng, nơi mọi người thường đến các hiệu thuốc tư nhân hoặc những người bán hàng không chính thức để mua thuốc [2].
Trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh gây bệnh, vi khuẩn Staphyloccus aureus kháng methicillin (MRSA) và các tụ cầu khuẩn coagulase âm tính kháng methicillin (MRCoNS) được phát hiện và báo cáo nhiều nhất tại các bệnh viện Việt Nam [3]. Chúng gây ra tỷ lệ nhiễm trùng và tử vong cao hơn vì có khả năng kháng hầu hết phác đồ kháng sinh hiện tại. Linezolid là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm kháng sinh oxazolidinone được cấp phép lưu hành, có hoạt tính tốt chống lại các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các staphylococci đa kháng thuốc (bao gồm cả MRSA và MRCoNS), Enterococcus faecium và Enterococcus faecalis (bao gồm cả Vancomycin-Resistant Enterococcus-VRE). Với những ưu điểm đó, linezolid đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng.
Tuy nhiên, các khảo sát đã cho thấy xu hướng tiêu thụ linezolid gia tăng có liên quan đến tỷ lệ sử dụng không phù hợp và tỷ lệ phân lập được các chủng đề kháng [4]. Một nghiên cứu của Nguyễn Thị Lệ Thủy và cộng sự vào năm 2020 phát hiện hai chủng tụ cầu khuẩn coagulase âm tính kháng linezolid (Linezolid resistant coagulase-negative staphylococci-LRCoNS) tại Việt Nam. Trong 70 chủng thu nhận từ khoa Vi Sinh, đại học Dược thành phố HCM, có 2 chủng phân lập từ mẫu máu bệnh nhân trong phòng hồi sức cho thấy tính kháng linezolid. Cả hai chủng phân lập đều mang đột biến trong các thành phần ribosome, cũng như gene kháng cfr (chloramphenicol - florfenicol resistance).
gene cfr này nằm trên plasmid có liên quan chặt chẽ với plasmid pLRSA417, trước đây được tìm thấy ở Trung Quốc [5]. Sự xuất hiện của LRCoNS ở Việt Nam là một mối lo ngại nghiêm trọng. Linezolid là liệu pháp kháng sinh cuối cùng để điều trị nhiễm trùng tụ cầu. Cũng theo bài báo trên, 2 chủng được phân lập không những kháng được linezolid mà còn kháng cả methicillin và các 1 kháng sinh khác.
Vì vậy câu hỏi nghiên cứu được đặt ra là: các staphylococci ngoài môi trường có thể mang các plasmid hoặc nhân tố chuyển vị mang gene kháng linezolid không? Các plasmid hoặc nhân tố chuyển vị có liên hệ thế nào với các plasmid mang gene kháng đã biết trên thế giới? Có rất ít nghiên cứu, theo chúng tôi biết hiện nay làm về sự hiện diện của các gene kháng và nhân tố chuyển vị trên nền mẫu môi trường. Việc phân tích trên một số chủng phân lập từ môi trường như thực phẩm, cơ sở chăn nuôi động vật, nước thải,…sẽ bổ sung thông tin về đặc điểm kháng thuốc của nhóm tụ cầu khuẩn ở Việt Nam. Qua đó, các nghiên cứu sau có thể đưa ra được các chiến lược cụ thể cho việc kiểm soát sử dụng và phát triển liệu pháp kháng sinh ở Việt Nam. Để thực hiện được mục tiêu này, chúng tôi sử dụng công cụ phân tích trình tự bộ gene (WGS) vi khuẩn, ứng dụng giải trình tự thế hệ mới (NGS) để tìm hiểu sâu hơn về những cơ chế di truyền đằng sau sự lây lan tính kháng linezolid của nhóm staphylococci.
Đó là mục tiêu để đề tài: “Giải trình tự và lắp ráp bộ gene các vi khuẩn nhóm staphylococci được phân lập từ môi trường để phân tích đặc điểm kháng linezolid” được tiến hành. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nhóm tụ cầu khuẩn (staphylococci) 1. Phân bố Staphylococci là nhóm vi khuẩn Gram dương có hình cầu và tạo thành chùm giống như quả nho.
Chúng thường được tìm thấy trong môi trường và trên da và niêm mạc của người và động vật [6, 7]. Hầu hết các loài staphylococci đều vô hại, nhưng một số loài có thể gây bệnh. Sự phân bố của staphylococci trong môi trường bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm chất dinh dưỡng [7, 8]. Nhóm staphylococci thích nhiệt độ ấm áp.
Chúng có thể tồn tại ở nhiệt độ từ 4°C đến 45°C, nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 30°C đến 37°C. Nhóm vi khuẩn này cũng cần độ ẩm và chất dinh dưỡng để tồn tại. Khi bước vào trạng thái thiếu dinh dưỡng trong thời gian dài, 99 đến 99,9% tế bào S. aureus mất khả năng sống sót trong vòng 2 ngày đầu tiên ở 37°C.
Khả năng tồn tại của dòng vi khuẩn sau đó vẫn tương đối ổn định trong khoảng thời gian vài tháng [9]. Môi trường không khí có bụi bẩn có thể giữ sức chống chịu, khả năng gây viêm nhiễm và tạo biofilm của vi khuẩn S. aureus trong các hạt sol khí. Tuy nhiên các tế bào này thường ở trạng thái không nuôi cấy được [10].
Các loài staphylococci có thể tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau vì chúng có một số cách thích nghi cho phép [7]. Các loài staphylococci có một lớp vỏ nang bảo vệ chúng khỏi hệ thống miễn dịch. Chúng cũng có protein bề mặt giúp bám dính trên bề mặt và trốn tránh hệ thống miễn dịch và chúng cũng có nhiều enzyme giúp tăng cường hoạt động trao đổi chất hoặc phân hủy kháng sinh, kim loại nặng,… [7, 11]. Phân loại tụ cầu Các nghiên cứu phân loại thường quan tâm phân biệt giữa nhóm tụ cầu dương tính men coagulase (Coagulase-positive staphylococci - CoPS) và nhóm âm tính (Coagulase-negative staphylococci - CoNS).
CoPS mà tiêu biểu là S. aureus có khả năng làm đông máu qua việc chuyển hóa fibrinogen thành fibrin. CoNS không tạo enzyme này và như vậy không làm đông máu [12]. Người ta cũng quan sát được sự khác nhau trong cấu trúc thành tế bào giữa hai nhóm này [13].
Khả năng sinh men coagulase trước đây được kiểm tra bằng huyết thanh thỏ (slide or tube coagulase testing) hoặc bằng bộ test chuyên dụng Staphaurex hoặc 3 Pastorex [14, 15]. Hiện tại đã có nhiều thông tin về đặc tính các loài tụ cầu, nên người ta có thể thực hiện định danh bằng các kit hóa sinh API STAPH để xác định loài và suy ra khả năng sinh men coagulase [16]. Độc lực Độc lực của các loài staphylococci có thể khác nhau giữa các loài và các chủng. Một số loài có độc lực cao hơn những loài khác và có nhiều khả năng gây bệnh hơn.
aureus là loài staphylococci gây bệnh phổ biến nhất. aureus có thể gây ra nhiều loại bệnh nhiễm trùng, bao gồm nhiễm trùng da, viêm phổi và nhiễm trùng huyết [17]. Trong khi đó Staphylococcus epidermidis (S. cholermidis) là một loại vi khuẩn phổ biến trên da thường chỉ gây nhiễm trùng ở những người có hệ thống miễn dịch yếu [17].
Độc lực của chủng staphylococci cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, chẳng hạn như sự hiện diện của các vi khuẩn khác và sự sẵn có của các chất dinh dưỡng. Các độc tố tụ cầu phổ biến bao gồm: hemolysin-α (hla ), hemolysin-β (hlb), leukotoxin (Luk),…[18, 19]. Các độc tố này biểu hiện mạnh ở S. aureus và có khả năng phá hủy màng tế bào vật chủ bằng việc phân hủy cấu trúc mạng lưới tế bào hoặc gây ra phản ứng quá mẫn [19].
Độc lực còn được xác định qua khả năng vi khuẩn bám dính vào tế bào và mô và trốn tránh hệ thống miễn dịch – một chức năng của protein bề mặt [20]. aureus đột biến thiếu sortase dẫn tới thiếu tất cả các protein neo ở thành tế bào của nó sẽ ít độc hơn so với chủng tự nhiên của nó trong mô hình nghiên cứu áp xe da. Ngoài ra, các chủng đặc biệt thiếu protein A, protein liên kết fibronectin, yếu tố kết khối A hoặc protein bề mặt SasF cũng bị suy giảm độc lực. Tính kháng kháng sinh Kháng kháng sinh là khả năng vi khuẩn chống lại tác dụng của kháng sinh [21].
Kháng kháng sinh có thể xảy ra một cách tự nhiên, thông qua đột biến DNA. Nhưng nó cũng có thể thu được thông qua việc chuyển gene kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Các loài staphylococci ngày càng trở nên kháng thuốc kháng sinh. Tụ cầu vàng kháng methicillin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus-MRSA) là một ví dụ điển hình [22].
MRSA lần đầu tiên được xác định vào đầu những năm 1960 tại Vương quốc Anh. Nó nhanh chóng lan sang các nơi khác trên thế giới và đến đầu những năm 1990, MRSA là một vấn đề lớn tại các bệnh viện ở Hoa Kỳ. Kháng MRSA là do sự hiện diện của một gene gọi là mecA. Gene mecA mã hóa PBP2A (penicillin-binding protein 2A) làm cho các vi khuẩn 4 MRSA kháng methicillin và các kháng sinh nhóm beta-lactam khác.
Các yếu tố góp phần vào sự lây lan của MRSA bao gồm việc lạm dụng kháng sinh, thiếu phát triển kháng sinh mới và khả năng MRSA lây lan dễ dàng từ người sang người. Nhóm CoNS bao gồm Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus và một số loài khác. Hầu hết chúng chỉ hội sinh trên da người và tất cả đều ít gây bệnh hơn so với S. Tuy nhiên, chúng có thể gây nhiễm trùng khi bệnh nhân suy giảm sức đề kháng.
Nghiên cứu gần đây trên gia cầm đã chỉ ra rằng nhóm tụ cầu không có men coagulase kháng methicillin (Methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci-MRCoNS) đã được tìm thấy trong 100% các mẫu được thử nghiệm và phổ biến trong chăn nuôi gia cầm [23]. Đây là một mối quan tâm lớn, vì gia cầm là nguồn thực phẩm chính cho con người. Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm được cho là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự lây lan của MRCoNS. Plasmid và nhân tố chuyển vị Staphylococci có thể kháng thuốc kháng sinh thông qua nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm cả việc thu nhận các yếu tố di truyền di động (Mobile genetic element-MGE) [24].
MGE là các cấu trúc DNA có thể di chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (plasmid, prophage,…) hoặc giữa các phân tử DNA với nhau (IS, transposon,…). Chúng có thể mang gene kháng thuốc kháng sinh, cũng như gene mã hóa các yếu tố độc lực. Hai trong số các loại MGE phổ biến nhất ở staphylococci là plasmid và transposon (Hình 1. Plasmid là các phân tử DNA dạng vòng, nhỏ có thể sao chép độc lập với chromosome của vi khuẩn.
Transposon là các chuỗi DNA có thể di chuyển trong chromosome của vi khuẩn hoặc giữa các plasmid. Plasmid và transposon có thể mang nhiều loại gene, bao gồm cả gene quy định khả năng kháng thuốc kháng sinh. Ví dụ, các vùng cassette từ chromosome của staphylococci (SCCmec) là một nhân tố chuyển vị lớn mang gene mã hóa kháng methicillin [25].