CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về bệnh gút và enzym xanthin oxidase 1. Giới thiệu về bệnh gút Gút là một bệnh rối loạn chuyển hóa purin, đặc trưng với sự gia tăng nồng độ acid uric trong máu, dẫn đến sự hình thành và tích tụ tinh thể monosodium urat (MSU) tại các mô, đặc biệt là tại các khớp [2], [8], [9]. Đây là một bệnh lý mãn tính với bốn giai đoạn tiến triển: tăng acid uric không triệu chứng, lắng đọng tinh thể chưa có biểu hiện lâm sàng, các đợt viêm cấp tính và cuối cùng là gút mạn tính có kèm theo sự hình thành các hạt tophi [8].
Mặc dù, cơ thể con người có cơ chế tự điều hòa để kết thúc cơn gút cấp sau vài ngày, nhưng nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển thành bệnh lý mạn tính, gây tổn thương khớp nghiêm trọng và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Hiện nay, trong y học hiện đại, chiến lược điều trị gút trên lâm sàng tập trung chủ yếu vào việc kiểm soát sự lắng đọng của các tinh thể MSU cũng như ngăn chặn các đợt gút tái phát bằng cách duy trì nồng độ acid uric nằm trong khoảng giới hạn bình thường [10]. Đối với cơn gút cấp, các thuốc chống viêm như NSAIDs, colchicin, corticosteroids và một số liệu pháp sinh học như liệu pháp ức chế Interleukin-1 (IL-1 inhibitors) thường được sử dụng nhằm kiểm soát tình trạng viêm, giảm đau và ngăn chặn tổn thương khớp [10]. Về lâu dài, duy trì nồng độ acid uric ổn định đóng vai trò then chốt trong quản lý bệnh gút mạn tính, giúp ngăn ngừa sự tích tụ tinh thể MSU và giảm nguy cơ tiến triển của bệnh.
Các thuốc giảm acid uric trong máu bao gồm allopurinol và febuxostat thường được sử dụng để ức chế enzym xanthin oxidase với mục đích giảm tổng hợp acid uric trong cơ thể [11]. Theo hướng dẫn của Hội Thấp khớp học Hoa Kỳ (American College of Rheumatology) năm 2020, allopurinol là lựa chọn hàng đầu cho hầu hết bệnh nhân gút cần hạ acid uric, kể cả với những bệnh nhân suy thận [12]. Tuy nhiên, thuốc này được ghi nhận có thể gây dị ứng thuốc và phản vệ với tỷ lệ cao ở người châu Á [4]. Bên cạnh các yếu tố di truyền, sự lắng đọng tinh thể MSU trong khớp còn chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố nguy cơ khác, bao gồm chế độ ăn giàu purin (thịt đỏ, hải sản), tiêu thụ rượu bia quá mức, béo phì, hội chứng chuyển hóa và suy giảm chức năng thận.
Những yếu tố này không chỉ làm tăng nguy cơ khởi phát bệnh mà còn thúc đẩy quá trình viêm khớp, dẫn đến tiến triển thành gút mạn tính [13]. Do đó, việc kiểm soát chế độ ăn uống, duy trì cân nặng hợp lý và bảo vệ chức năng thận cũng là những yếu tố then chốt trong chiến lược phòng ngừa và điều trị gút. Vai trò sinh học và cơ chế hoạt động của enzym xanthin oxidase Xanthin oxidase (XO) là một metal - flavoprotein, tồn tại dưới dạng homodimer với khối lượng phân tử khoảng 290 kDa, có chứa Flavin Adenin Dinucleotid (FAD), 3 Molybdenum (Mo) và Sắt (Fe) theo tỷ lệ 2:2:8 [14-16]. Đây là một enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình dị hóa purin từ acid nucleic.
XO có khả năng phản ứng với nhiều loại cơ chất khác nhau, nhưng vai trò chính của nó là xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và tiếp tục chuyển hóa thành acid uric theo các phản ứng a và b [15] (Hình 1. Trong quá trình tái oxy hóa XO, oxy phân tử (O₂) hoạt động như chất nhận điện tử, dẫn đến sự hình thành gốc superoxid (O2-) và hydrogen peroxid (H₂O₂) [17]. Sau đó, các gốc anion superoxid (O2-) tự phát hoặc dưới tác động của enzym superoxid dismutase (SOD) được chuyển hóa thành hydrogen peroxid (H₂O₂) và oxy [16]. Xanthin + O2 + H2O → Acid Uric + H2O2 Ban đầu, thông qua một loạt các phản ứng, purin, guanin monophosphat (GMP) và adenosin monophosphat (AMP) bị thoái hóa thành hypoxanthin hoặc xanthin.
Sau đó, dưới tác động của XO, xanthin tiếp tục bị oxy hóa, tạo ra acid uric và các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species - ROS) [14-16]. Thông thường, acid uric sẽ được thận đào thải qua nước tiểu hoặc bài tiết qua đường tiêu hóa, giúp duy trì nồng độ trong giới hạn sinh lý [16]. Tuy nhiên, khi XO hoạt động quá mức khiến nồng độ acid uric trong máu tăng, làm tăng nguy cơ mắc bệnh gút - một dạng viêm khớp đặc trưng bởi cơn đau dữ dội và một số rối loạn chuyển hóa khác [14], [16]. Do đó, ức chế enzym XO trở thành mục tiêu quan trọng trong điều trị và kiểm soát bệnh gút.
Ngoài ra, sự tích tụ quá mức ROS có thể gây ra stress oxy hóa, được xem như yếu tố liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều tình trạng khác nhau như lão hóa, viêm khớp, ung thư và viêm [18], [19]. Bên cạnh đó, stress oxy hóa cũng góp phần vào quá trình thoái hóa và gây ra các bệnh lý bao gồm xơ vữa động mạch, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và chấn thương tái tưới máu não [18], [20]. Quá trình chuyển hóa xanthin thành acid uric dưới tác dụng xúc tác của enzym xanthin oxidase [16] 1. Phương pháp sàng lọc tác dụng sinh học của dược liệu 1.
Sàng lọc in vitro Sàng lọc in vitro, hay còn được gọi là sàng lọc trong ống nghiệm, là một phương pháp quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất hoặc dược liệu. Trước khi phương pháp này ra đời, việc đánh giá hoạt tính sinh học là một trở ngại lớn trong phát triển thuốc mới [21]. Tuy nhiên, vào những năm 1950, các kỹ thuật in vitro bắt đầu được quan tâm, nghiên cứu và phát triển nhiều hơn, góp phần đáng kể vào việc thu thập dữ liệu sinh học [21], [22]. Một trong những thử nghiệm in vitro phổ biến được dùng để đánh giá hoạt tính ức chế enzym XO là phương pháp đo quang phổ được đề xuất bởi Noro và cộng sự năm 1983 [23].
Nguyên tắc định lượng của phép thử này dựa trên phản ứng oxy hóa xanthin dưới sự xúc tác của xanthin oxidase, trong đó acid uric được tạo thành có khả năng hấp thụ mạnh tại bước sóng 290 nm. Hoạt độ của enzym được xác định gián tiếp thông qua mức độ gia tăng mật độ quang học tại bước sóng này. Khi có sự xuất hiện của mẫu thử có khả năng ức chế XO, lượng acid uric được tạo thành sẽ giảm và kéo theo sự giảm độ hấp thụ quang. Hỗn hợp phản ứng bao gồm dung dịch mẫu thử, dung dịch đệm phosphat (pH=7,5) và dung dịch enzym được ủ ở 25 °C trong 15 phút.
Sau đó, tiến hành bổ sung dung dịch cơ chất xanthin vào hỗn hợp và tiếp tục ủ ở 25 °C trong 30 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm acid hydrochloric 1 N. Bên cạnh đó, mẫu chứng (không 5 chứa chất ức chế), mẫu đối chiếu (thường là allopurinol) và mẫu trắng cũng được chuẩn bị. Trong đó, mẫu trắng được chuẩn bị theo cách tương, tuy nhiên, enzym chỉ được thêm vào sau khi đã bổ sung acid hydrochloric.
Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo tại bước sóng 290 nm bằng máy quang phổ UV-Vis [23], [24]. Tỷ lệ phần trăm ức chế XO (% ức chế) được tính theo công thức: (A−B)−(C−D) % ức chế = x 100 (A−B) Trong đó: A: Mật độ quang đo được của mẫu chứng (không chứa dịch chiết của mẫu thử) B: Mật độ quang của mẫu trắng tương ứng với mẫu chứng C: Mật độ quang của mẫu thử D: Mật độ quang của mẫu trắng tương ứng với mẫu thử Nhìn chung, các phương pháp thử nghiệm in vitro có nhiều ưu điểm như khả năng kiểm soát chặt chẽ điều kiện thí nghiệm, ít tốn kém hơn so với in vivo, có thể thực hiện trên quy mô lớn với độ lặp lại cao, đồng thời giúp tránh được các vấn đề đạo đức liên quan đến thử nghiệm trên động vật [25]. Tuy nhiên, phương pháp này cũng tồn tại những hạn chế đáng kể do sự khác biệt giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường sinh lý thực tế của cơ thể sống, dẫn đến sự sai lệch trong kết quả nghiên cứu [26]. Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro không thể đánh giá được tác động toàn diện của dịch chiết lên hệ thống sinh học phức tạp, bao gồm ảnh hưởng trên hệ miễn dịch hoặc các tương tác thuốc có thể xảy ra.
Do đó, quá trình sàng lọc sinh học thường được bắt đầu bằng các xét nghiệm in vitro nhằm xác định đặc tính và cơ chế tác động của hợp chất, sau đó tiếp tục với các nghiên cứu in vivo để kiểm tra hoạt tính trên hệ thống sinh học cơ thể phức tạp hơn [27]. Việc lựa chọn phương pháp thử nghiệm in vitro phù hợp cần được cân nhắc dựa trên nhiều yếu tố, kết hợp các phương pháp bổ trợ khác để đảm bảo đánh giá toàn diện và tránh bỏ sót những dịch chiết dược liệu tiềm năng. Sàng lọc in vivo Trái ngược với thử nghiệm in vitro, phương pháp sàng lọc in vivo thường được sử dụng để đánh giá toàn diện tác động của dịch chiết dược liệu trên sinh vật sống [28]. Phương pháp này có thể cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế tác dụng của các dịch chiết dược liệu trong một hệ thống sinh học phức tạp [29].
Đối với sàng lọc in vivo, các mô hình động vật được sử dụng gồm nhiều loài khác nhau, từ các loài gặm nhấm như chuột và chuột lang, đến loài có kích thước lớn hơn như thỏ và chó [30-32]. Việc lựa chọn mô hình động vật sẽ phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu cụ thể và tính chất của dược liệu đang được đánh giá sàng lọc. Một trong những ưu điểm của phương pháp in vivo là khả năng đánh giá tác động lên toàn bộ hệ thống sinh học, bao gồm cả các quá trình dược động học (hấp thu, phân 6 bố, chuyển hóa và thải trừ), giúp phát hiện được những tác dụng không mong muốn hoặc độc tính tiềm ẩn từ dịch chiết dược liệu [33]. Ngoài ra, các thử nghiệm trên động vật còn cho phép quan sát và đánh giá được các tình trạng các tổn thương ở mô và cơ quan sau một thời gian điều trị.
Tuy nhiên, việc sử dụng động vật trong nghiên cứu cũng tồn tại nhiều hạn chế. Một thách thức lớn nhất của phương pháp này có thể kể đến là sự khác biệt giữa động vật và con người về sinh lý, hóa sinh, di truyền và hành vi, khiến việc ngoại suy kết quả từ mô hình động vật sang người trở nên phức tạp và có thể dẫn đến sai lệch trong kết quả nghiên cứu.
