Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong thủy sản

Đồ án tốt nghiệp trình bày tổng quan về Listeria monocytogenes trong thủy sản: Cấu trúc, cơ chế gây bệnh và các phương pháp phát hiện vi khuẩn.

• Tác giả: Võ Thành Hưng
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản
• Loại tài liệu: Đồ án

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes là một vi khuẩn gây bệnh listeriosis đứng thứ ba trong nhóm B gây bệnh sau Streptococcus và E. coli. Vi khuẩn này được xem là nguồn lây nhiễm chính trong các sản phẩm thủy sản bảo quản lạnh. Đặc biệt, Listeria monocytogenes có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp, điều mà hầu hết các vi khuẩn gây bệnh khác không thể làm được. Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh thấp (2-5 trường hợp trên một triệu người mỗi năm), nhưng tỷ lệ tử vong do Listeria monocytogenes lại rất cao, đạt 25-30% trong các ca nhiễm bệnh. Những người dễ bị nhiễm bệnh bao gồm trẻ em, trẻ sơ sinh, người cao tuổi, phụ nữ mang thai và những người có hệ miễn dịch yếu.

1.1. Đặc điểm và tính chất của vi khuẩn

Listeria monocytogenes là một vi khuẩn gram dương, có khả năng di động ở nhiệt độ thấp. Vi khuẩn này không tạo bào tử và có khả năng thích nghi tuyệt vời với môi trường thực phẩm lạnh. Điều này khiến nó trở thành mối nguy hiểm lớn trong các sản phẩm thủy sản được bảo quản lạnh. Khác với các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm khác, Listeria monocytogenes không cần liều lượng cao để gây bệnh mà có thể tích lũy trong cơ thể người từ từ.

1.2. Bệnh listeriosis và các biến chứng

Bệnh do Listeria monocytogenes gây ra có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng não và viêm dạ dày ruột. Ở phụ nữ mang thai, Listeria monocytogenes có thể gây ra sẩy thai, đẻ non và tử vong chu sinh. Do tính nguy hiểm cao, việc nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn này là vô cùng cần thiết.

II. Phân bố và sự hiện diện của Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản

Listeria monocytogenes được phát hiện rộng rãi trong các sản phẩm thủy sản trên toàn thế giới, đặc biệt là trong các sản phẩm bảo quản lạnh. Sự hiện diện của vi khuẩn này trong thực phẩm dễ hỏng là một thách thức lớn cho công nghiệp thực phẩm. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong cá, tôm, cua và các sản phẩm thủy sản khác. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa được giám sát đầy đủ, nhưng các báo cáo cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn này trong các chợ và công xưởng thủy sản. Sự bảo quản lạnh không đúng cách và vệ sinh thực phẩm kém là những yếu tố chính dẫn đến oại Listeria monocytogenes trong các sản phẩm này.

2.1. Phân bố địa lý toàn cầu

Listeria monocytogenes được phát hiện ở hầu hết các quốc gia, đặc biệt là những nước có ngành công nghiệp thủy sản phát triển. Các báo cáo từ châu Âu, Bắc Mỹ và châu Á cho thấy tỷ lệ nhiễm Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản dao động từ 5-30% tùy thuộc vào phương pháp bảo quản và điều kiện vệ sinh.

2.2. Tình hình ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nước có ngành thủy sản phát triển mạnh, việc giám sát Listeria monocytogenes vẫn còn hạn chế. Một số nghiên cứu ban đầu cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn này trong các mẫu thủy sản từ các chợ và nhà máy chế biến. Cần có chương trình giám sát định kỳ để đánh giá mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Việt Nam.

III. Cấu trúc và cơ chế bệnh sinh của Listeria monocytogenes

Cấu trúc của Listeria monocytogenes bao gồm vách tế bào peptidoglycan, màng t细胞, và các yếu tố kháng nguyên bề mặt. Vi khuẩn này sở hữu một số protein độc lực đặc biệt giúp nó xâm nhập vào tế bào chủ, tránh thoát khỏi phagosome và phát triển bên trong tế bào. Cơ chế gây bệnh của Listeria monocytogenes khác biệt so với các vi khuẩn khác ở chỗ nó có thể xâm nhập vào tế bào một cách có tổ chức. Các protein độc lực như InlA và InlB membantu vi khuẩn gắn kết với tế bào chủ. Sau khi vào bên trong tế bào, Listeria monocytogenes tiết ra protein ActA để kích thích sự tái tổ chức của actin, cho phép nó di chuyển nhanh chóng bên trong tế bào và lây lan sang các tế bào xung quanh.

3.1. Cấu trúc hình thái của vi khuẩn

Listeria monocytogenes là một trực khuẩn gram dương, không tạo bào tử, có kích thước khoảng 0,5-2 μm. Vi khuẩn này có lông trần (flagella) ở nhiệt độ 20-30°C nhưng mất lông ở 37°C. Điều này giúp nó tránh khỏi phản ứng miễn dịch khi ở trong cơ thể người. Cấu trúc vách tế bào chứa acid lipotechoic và peptidoglycan có vai trò quan trọng trong sự gắn kết với tế bào chủ.

3.2. Các cơ chế xâm nhập và gây bệnh

Listeria monocytogenes sử dụng một quy trình xâm nhập phức tạp gồm các giai đoạn: gắn kết, xâm nhập, thoát khỏi phagosome, và phát triển bên trong tế bào. Protein InlA gắn kết vào receptor E-cadherin trên tế bào chủ, trong khi InlB gắn kết vào receptor MET. ActA protein kích thích polymerization của actin, tạo ra đuôi actin giúp vi khuẩn di chuyển và lây lan giữa các tế bào.

IV. Phương pháp phát hiện và xác định Listeria monocytogenes

Để phòng chống Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản, cần có những phương pháp xác định nhanh chóng và chính xác. Các phương pháp truyền thống bao gồm nuôi cấy khuẩn trên các môi trường chọn lọc như PALCAM agar hoặc OXFORD agar, sau đó thực hiện các test sinh hóa như catalase, motility, API test. Các phương pháp hiện đại hơn như PCR, Real-time PCR và immunofluorescence cho phép phát hiện Listeria monocytogenes nhanh hơn và chính xác hơn. Phương pháp MALDI-TOF có thể xác định chủng Listeria monocytogenes trong vài phút. Việc sử dụng công nghệ sinh học phân tử đang trở nên phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện đại để kiểm tra thực phẩm và đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.1. Phương pháp nuôi cấy và sinh hóa

Phương pháp nuôi cấy vẫn là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện Listeria monocytogenes. Vi khuẩn được nuôi trên PALCAM agar hoặc OXFORD agar ở 37°C trong 24-48 giờ. Các colony đặc trưng có hình dạng hemolysis xung quanh. Sau đó tiến hành các test sinh hóa như catalase dương tính, motility tại 20-25°C, CAMP test, acid từ glucose-maltose. Mặc dù chậm nhưng phương pháp này có độ tin cậy cao.

4.2. Phương pháp sinh học phân tử hiện đại

PCR và Real-time PCR cho phép phát hiện Listeria monocytogenes trong vài giờ thay vì nhiều ngày. Công nghệ MALDI-TOF mass spectrometry có thể xác định chủng vi khuẩn nhanh chóng với chi phí thấp. Next-generation sequencing cung cấp thông tin chi tiết về genotype và virulence factors. Các phương pháp này đặc biệt hữu ích cho kiểm tra đại trà và truy vết nguồn gốc trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh.

Những cơ chế này tạo nên độc lực (virulence) của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này. Listeria monocytogenes là tác nhân gây bệnh listeriosis. Vi khuẩn này được xếp là tác nhân gây bệnh đứng thứ ba thuộc nhóm B sau Streptococcus và E.

Đồng thời là nguồn chính lây nhiễm bệnh cho người trong các sản phẩm bảo quan lạnh, vi sinh vật này có khả năng tồn tại tăng trưởng trong sản phẩm suốt quá trình bảo quản lạnh. Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẻ phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàn biểu hiện. Trong đó Listeria monocytogenes hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội. Mặc dù bệnh do Listeria monocytogenes gây ra là ở tầng số thấp, 2 - 5 trường hợp trên một triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do vi khuẩn này là rất cao, 25 - 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh.

Đối tượng bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes gây ra thường gặp ở trẻ em, trẻ sơ sinh, người già, thai phụ và người có hệ miễn dịch kém. Listeria monocytogenes gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não hoặc sốt viêm dạ dày ruột, đồng thời cũng là nguyên nhân gây ra trẻ chết sau khi sinh, đẻ non và sẩy thai ở phụ nữ. Do đó, với tính phân bố rộng và khả năng gây ra những tác hại nghiêm đối với người bị nhiễm L. Monocytogenes và được sự chấp thuận của khoa Môi trường và Công SVTH: Võ Thành Hưng 2 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản nghệ sinh học, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản”.

Mục đích Cấu trúc và cơ chế gây bệnh của Listeria monocytogenes. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát về cấu trúc của Listeria monocytogenes.  Khảo sát về sự phân bố của Listeria monocytogenes.  Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay.

 Một số phương pháp xác định Listeria monocytogenes. SVTH: Võ Thành Hưng 3 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản CHƯƠNG II TỔNG QUAN SVTH: Võ Thành Hưng 4 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản 2. Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm 2. Salmonella sp Hình 2.1: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn 2.

Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Salmonella  Loài: Salmonella sp 2. Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vậy có khả năng di động, không sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 m.

Salmonella là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 37 0C, pH tối ưu 7,2 - 7,6. Để mọc trên các môi trường thông thường. SVTH: Võ Thành Hưng 5 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản  Đặc điểm sinh hóa: Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính). Lên men sinh hơi các đường glucose, manit, sorbitol, lên men không đều sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose … (Tô Minh Châu và Trần Bích Liên, 1999).

Cấu trúc kháng nguyên  Kháng nguyên O Mỗi Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố kháng nguyên. Hiện nay người ta biết có 67 yếu tố kháng nguyên O. Việc xác định các yếu tố kháng nguyên O là hết sức quan trọng để định nhóm và định type.  Kháng nguyên H Chỉ có ở những Salmonella có lông.

Kháng nguyên H của Salmonella có thể tồn tại dưới 2 pha.  Pha đặc hiệu (phase 1): là những yếu tố có tính chất đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn Salmonella, gồm 28 kháng nguyên lông được kí hiệu bằng chữ cái a, b, c, g,….  Pha không đặc hiệu (phase 2): được kí hiệu số 1, 2, 3,…. (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)  Kháng nguyên Vi Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy được ở kính hiển vi thường.

Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh Salmonella typhi và S. Người ta dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella. SVTH: Võ Thành Hưng 6 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Bảng 2.1: Phân biệt các kháng nguyên O, H, Vi: Tác động của Kháng nguyên Tính chịu nhiệt Formol 50% alcohol 50% O Ổn nhiệt 2h30 ở 1000C Kháng Bị ngăng trở ngưng kết Vi Biến nhiệt 15’06” ở 1000C Nhạy cãm Kháng H Biến nhiệt 2h ở 1000C Nhạy cãm Kháng Hình 2.2: Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella. Yếu tố độc lực Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại là LT và ST.

SVTH: Võ Thành Hưng 7 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản  Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase trong tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), c-AMP sẽ kích thích tiết Cl- và HCO3- ra khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na + vào bên trong tế bào. Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn đến tiêu chảy.  Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) ở trong tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy.

Khả năng gây bệnh Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống…. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1 màng nhày và vào thành ruột. Các tế bào Paneth của niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc động vật, từ người bệnh.

Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. trong quá trình giết mổ củng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.  Bệnh thương hàn SVTH: Võ Thành Hưng 8 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Hình 2.3: Viêm dạ dày – ruột Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S.

typhi, sau đó đến S. paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi khỏi bệnh về mặt lâm sàng, khoảng 5% bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài hàng tháng hoặc hàng năm.

Ở họ, ổ chứa Salmonella là đường mật và vi khuẩn vẫn được tiếp tục đào thải theo phân ra ngoại cảnh. Người lành mang vi khuẩn là nguồn lan truyền bệnh quan trọng. Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến ruột non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng nhân lên và một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố.

Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột. Ngoài ra, nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba, gây ra trạng thái sốt kéo dài, li bì, và gây ra biến chứng trụy tim mạch. Từ các hạch mạc treo ruột vi khuẩn lan tràn vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết và lan đi khắp cơ thể, rồi vi khuẩn vào mật và từ đó quay trở lại ruột. Vi khuẩn theo phân ra ngoại cảnh.

 Các bệnh khác SVTH: Võ Thành Hưng 9 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà Salmonella typhimurium. là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là Salmonella enteritidis. Nhiễm trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 giờ. Bệnh biểu hiện có sốt, nôn, tiêu chảy.

Bệnh khỏi sau 2 - 5 ngày, không có biến chứng. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu hóa như viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi.  Khả năng gây bệnh của một số loài:  Salmonella typhi : Chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi gây ra.

 Salmonella paratyphi A : Chỉ gây bệnh thương hàn cho người và cũng hay gặp ở nước ta sau S.  Salmonella paratyphi B : Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước châu Âu.  Salmonella paratyphi C : Gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết.

Bệnh thường gặp ở các nước Đông Nam Á.  Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis : Gây bệnh cho người và gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella.  Salmonella cholerae suis : Loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết.

Campylobacter sp SVTH: Võ Thành Hưng 10 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Hình 2.4: Phẩy khuẩn Campylobacter 2. Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Eubateriales  Họ: campylobacteriaceae  Chi: Campylobactes  Loài: Campylobactes sp 2.