Đồ án: Sản xuất và nâng cao hoạt độ enzyme cellulase từ Aspergillus oryzae

Đồ án HCMUTE nghiên cứu quy trình sản xuất và phương pháp tối ưu nâng cao hoạt độ enzyme cellulase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae hiệu quả.

• Tác giả: Dương Thị Quỳnh Như
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Quang Duy
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất và nâng cao hoạt độ enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus oryzae
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus oryzae

Cellulase là enzyme thủy phân cellulose thành glucose, đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, dệt may, sản xuất nhiên liệu sinh học và xử lý chất thải hữu cơ. Nấm mốc Aspergillus oryzae được lựa chọn do khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh mẽ và an toàn sinh học. Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa điều kiện sản xuất enzyme từ chủng nấm này, bao gồm môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ và nguồn carbon. Kết quả đạt được có thể ứng dụng trong sản xuất enzyme công nghiệp, giảm chi phí nhập khẩu và thúc đẩy ngành công nghiệp sinh học tại Việt Nam. Cellulase từ A. oryzae còn được sử dụng trong sản xuất rượu, bia, nước giải khát và xử lý phụ phẩm nông nghiệp.

1.1. Vai trò của enzyme cellulase trong công nghiệp

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhờ khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm có giá trị. Trong ngành thực phẩm, enzyme này tham gia sản xuất nước trái cây, cải thiện độ trong và tăng hàm lượng đường. Công nghiệp dệt may sử dụng cellulase để xử lý vải, tạo độ mềm mại và giảm độ co rút. Trong sản xuất nhiên liệu sinh học, cellulase chuyển đổi cellulose thành glucose, tiền đề sản xuất ethanol sinh học. Ngoài ra, cellulase còn được ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ, phân hủy giấy và bã thải nông nghiệp, góp phần giảm ô nhiễm môi trường.

1.2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae là nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao, được phân loại thuộc họ Aspergillaceae. Chủng nấm này phát triển tốt trên môi trường giàu carbohydrate, đặc biệt là cellulose và các dẫn xuất. A. oryzae có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng chịu nhiệt và pH rộng, phù hợp cho sản xuất enzyme công nghiệp. Ngoài cellulase, nấm còn sản sinh các enzyme khác như amylase, protease, đóng góp vào hiệu quả chuyển hóa cơ chất. Đặc biệt, A. oryzae được FDA công nhận an toàn (GRAS), đảm bảo ứng dụng trong thực phẩm.

II. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme cellulase

Hoạt độ enzyme cellulase phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy. Nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến sinh tổng hợp enzyme. Trong đó, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase thường nằm trong khoảng 4,0-6,0, với đỉnh cao nhất tại pH 5,5. Nhiệt độ 30-37°C cũng được xác định là khoảng thích hợp cho sự phát triển của A. oryzae và sản xuất enzyme. Ngoài ra, nguồn carbon (như CMC) và nitơ (như (NH4)2SO4) cần được bổ sung cân đối để tối ưu hóa quá trình lên men.

2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

pH môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp cellulase. Tại pH 5,5, hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất (7,92 ± 0,18 U/ml), phù hợp với nghiên cứu trước đó của El-Ghonemy (2014). Độ pH ảnh hưởng đến điện tích bề mặt tế bào, làm thay đổi tính thẩm thấu màng và hoạt động của enzyme. Nếu pH giảm dưới 3, hoạt động của cellulase bị ức chế do biến tính protein. Do đó, kiểm soát pH trong suốt quá trình lên men là yếu tố quyết định hiệu quả sản xuất enzyme.

2.2. Tác động của nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng

Nhiệt độ 30-37°C được xác định là khoảng tối ưu cho sinh trưởng của A. oryzae và sản xuất cellulase. Nhiệt độ cao hơn có thể gây bất hoạt enzyme, trong khi nhiệt độ thấp làm chậm quá trình trao đổi chất. Nguồn carbon (CMC) cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, trong khi (NH4)2SO4 bổ sung nitơ cần thiết cho tổng hợp protein. Bổ sung 250g malt xay trong 1000ml môi trường đã được chứng minh hiệu quả trong nghiên cứu này.

III. Phương pháp sản xuất và tinh sạch enzyme cellulase

Quy trình sản xuất cellulase từ A. oryzae bao gồm ba giai đoạn chính: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, lên men và thu nhận enzyme. Môi trường MEA (Malt Extract Agar) được sử dụng với độ brix 5,5 và pH 5,5, bổ sung (NH4)2SO4. Sau khi tiệt trùng ở 121°C, môi trường được cấy giống nấm mốc. Quá trình lên men diễn ra trong 72 giờ ở 30°C với tốc độ lắc 150 rpm. Enzyme được thu nhận bằng ly tâm, sau đó tinh sạch bằng cách kết tủa với (NH4)2SO4 80% và dung dịch ethanol 96%. Hiệu suất thu nhận đạt 78% sau tinh sạch.

3.1. Quy trình lên men và thu nhận enzyme thô

Sau khi cấy giống vào môi trường MEA đã chuẩn hóa, nấm mốc A. oryzae được nuôi cấy trong 72 giờ ở 30°C với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Quá trình lên men tạo ra enzyme cellulase trong dịch nuôi cấy. Dịch sau lên men được ly tâm ở 4°C, 10.000 rpm trong 20 phút để loại bỏ tế bào nấm. Dịch thu được chứa enzyme cellulase thô, có hoạt độ khoảng 5,2 U/ml. Đây là bước quan trọng để chuẩn bị cho quá trình tinh sạch tiếp theo.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch enzyme cellulase

Enzyme thô được tinh sạch bằng cách bổ sung (NH4)2SO4 80% (w/v) để kết tủa protein. Sau khi lắng, protein được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH 7,0. Tiếp theo, dung dịch được xử lý với ethanol 96% để loại bỏ tạp chất. Quá trình này tăng hoạt độ enzyme lên 12,8 U/ml, gấp 2,5 lần so với enzyme thô. Hiệu suất thu nhận enzyme sau tinh sạch đạt 78%, chứng tỏ quy trình hiệu quả.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng của enzyme cellulase

Nghiên cứu đạt được hoạt độ enzyme cellulase tối đa 12,8 U/ml sau tinh sạch, cao hơn 2,5 lần so với enzyme thô. Kết quả này vượt trội so với nghiên cứu trước đây sử dụng cùng chủng nấm (7,92 U/ml tại pH 5,5). Enzyme thu được có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp, xử lý chất thải hữu cơ và cải thiện chất lượng thực phẩm. Ngoài ra, quy trình sản xuất được tối ưu hóa có thể áp dụng trong quy mô công nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu enzyme. Kết quả nghiên cứu góp phần thúc đẩy ngành công nghiệp sinh học tại Việt Nam.

4.1. Đánh giá hiệu quả sản xuất enzyme

Kết quả khảo sát cho thấy hoạt độ enzyme đạt đỉnh tại pH 5,5 và nhiệt độ 30°C, phù hợp với đặc tính sinh học của A. oryzae. Nồng độ CMC 1,5% và (NH4)2SO4 0,2% được xác định là tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme. Hiệu suất thu nhận enzyme sau tinh sạch đạt 78%, cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Điều này chứng minh quy trình sản xuất được tối ưu hóa hiệu quả, có thể nhân rộng trong sản xuất công nghiệp.

4.2. Ứng dụng tiềm năng trong thực tiễn

Enzyme cellulase từ A. oryzae có thể ứng dụng trong sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ, bã mía hoặc vỏ trấu. Ngoài ra, nó được sử dụng để xử lý nước thải ngành dệt may, phân hủy cellulose trong bùn thải. Trong ngành thực phẩm, enzyme cải thiện độ trong của nước trái cây và tăng hàm lượng đường. Với khả năng phân hủy cellulose, enzyme còn hỗ trợ sản xuất thức ăn chăn nuôi từ phụ phẩm nông nghiệp, góp phần phát triển kinh tế tuần hoàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở Đầu Chương 2: Tổng quan Chương 3: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 4: Kết quả và bàn luận Chương 5: Kết luận và kiến nghị 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Tổng quan cellulose Cellulose là một trong những vật liệu sinh học phong phú nhất trên trái đất. Cellulose là một homopolyme của glucose, các đơn phân là glucose được nối với nhau bằng liên kết β- 1,4 (Brigham, 2018). Các chuỗi cellulose tương tác với nhau thông qua nhiều liên kết chéo như liên kết hydro và tương tác van der waal để tạo thành các bó kết hợp lại để tạo thành các sợi nhỏ có đường kính 5-15 nm.

Cellulose bền đến nhiệt độ 300℃. Cellulose không tan trong nước vì có liên kết hydro mạnh trong mạng tinh thể. Tuy nhiên, nó có thể hòa tan trong một số dung môi: acid đậm đặc như: acid photphoric 85% , acid sulfuric 72% và acid clohydric 40%; Các dung dịch muối vô cơ (ví dụ: cuprammonium hydroxide, cadoxen (tức là ion cadimi và etylenglycol) (Holtzapple, 2003). Cellulose có thể bị thủy phân thành glucose bằng acid hoặc enzyme.

Quá trình thủy phân bằng acid tạo ra một số sản phẩm phân hủy, chẳng hạn như 5- hydroxymetylfurfural, acid fomic, acid levulinic, fomandehide, furfural và nhựa (Holtzapple, 2003). Gốc glucose trong cấu trúc cellulose thường tồn tại ở cấu trúc không gian dạng ghế bành, nghĩa là glucose sẽ phân bố theo không gian đa chiều chứ không phân bố theo mặt phẳng. Trong điều kiện tự nhiên, cellulose tồn tại ở hai dạng, đó là dạng kết tinh và dạng vô định hình. Dạng kết tinh là dạng bền vững, ở đó các sợi cellulose được kết nối với nhau theo kiểu đan chéo và tạo nên sức bền cơ học cao.

Chính vì những lí do này, ở điều kiện tự nhiên, cellulose rất khó bị phá hủy. Cellulose chỉ bị phá hủy bởi vi sinh vật trong những điều kiện thích hợp (Nguyen, 2002). Giới thiệu chung enzyme cellulase 2. Phân loại và cơ chế tác động Enzyme cellulase có thể thủy phân liên kết β-1, 4-D-glucan trong cellulose để tạo ra glucose, cellobiose và oligosaccharides.

Phức hệ enzyme cellulase bao gồm ít nhất 3 loại enzyme tham gia vào quá trình thủy phân đó là 𝛽-glucosidase (EC 3.21), endo-1,4-β-D- glucanase (EC 3.4) và exo-1,4-β-D-glucanase. Để phản ứng thủy phân đạt hiệu quả tốt nhất thì 3 loại enzyme kể trên phải đồng thời tham gia vào quá trình thủy phân cellulose. 3 Trong đó exo-1,4-β-D-glucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó endo-1,4-β-D-glucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành cellobiose và và cello- oligosaccharide. Cuối cùng 𝛽-glucosidase có vai trò cắt cellobiose để giải phóng glucose và hoàn thành quá trình thủy phân (Patel và cộng sự, 2019).1 Cơ chế thủy phân của cellulase lên cellulose (Saini và cộng sự, 2015) 2.

Ứng dụng Hiện nay các ngành công nghiệp hiện đại đã dần thay thế những hóa chất độc hại trong sản xuất bằng enzyme có nguồn gốc từ thực vật và vi sinh vật, từ đó nhu cầu đối với các loại enzyme cũng ngày càng tăng. Các sản phẩm của quá trình phân giải bằng enzyme là những chất dinh dưỡng cho vi sinh vật, động vật và thực vật. Enzyme cellulase là một trong những enzyme hàng đầu được sản xuất rộng rãi và được ứng dụng nhiều nhất trong hơn 30 năm nay (Ejaz và cộng sự, 2021). 4 Các ngành công nghiệp sử dụng enzyme cellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật là: Ngành dệt may, sản xuất giấy, sản xuất chất tẩy rửa, y học, nông nghiệp, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

Cụ thể trong năm 2016, nhu cầu sử dụng cellulase trong ngành thức ăn chăn nuôi chiếm 29,71%, đối với lĩnh vực dệt may chiếm 13,77% và ngành thực phẩm đạt 26,73% nhu cầu sử dụng cellulase (Jayasekara và cộng sự, 2018). Một số vi sinh vật có khả năng sinh cellulase Enzyme cellulase có thể được sản xuất từ nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Đối với nấm sợi, enzyme cellulase được tổng hợp chủ yếu là enzyme ngoại bào. Một số loại nấm sợi có khả năng tổng hợp cellulase: Aspergillus fumigatus, A.

terrus, Trichoderma koningi, T. reesei, Penicillium spp, Altenaria tenuis, Fusarium culmorum, F. Đối với vi khuẩn, các loại vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp cellulase tốt hơn so với vi khuẩn kị khí lên đến 90-95%. Cụ thể Bacillus sp., Cellulomonas và Clostridium là những loài vi khuẩn sản xuất cellulase phổ biến, ngoài ra hệ vi sinh vật có trong dạ dày của các loài động vật ăn cỏ cũng có khả năng tổng hợp cellulase như: Cillobacterium cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum.

(Srivastava và cộng sự, 2019) Xạ khuẩn cũng là một trong những nguồn tổng hợp cellulase nhưng vẫn chưa được áp dụng rộng rãi và phổ biến như nấm sợi và vi khuẩn. Một số loại xạ khuẩn sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu có tiềm năng phân giải cellulose: Streptomyces sp. Giới thiệu chung chủng Aspergillus oryzae Nấm mốc Aspergillus oryzae đóng một vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất thực phẩm tại châu Á, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm và đồ uống lên men như: saké, shoyu (nước tương) và miso (tương đậu nành). Những năm gần đây, Aspergillus oryzae còn được sử dụng nhằm mục đích sản xuất các enzyme công nghiệp phục vụ cho lĩnh vực chế biến thực phẩm.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (Yullanna) Aspergillus oryzae là một loại nấm sợi hiếu khí và thuộc chi Aspergillus circumdati.

Phần Aspergillus Flavi chứa các loài quan trọng về mặt công nghiệp, chẳng hạn như Aspergillus oryzae, cũng như các loại nấm có ý nghĩa về mặt nông học và y học, chẳng hạn như Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, nhưng 2 chủng mốc này lại có khả năng tạo ra chất gây ung thư mạnh, độc tố aflatoxin. Về mặt phân loại, Aspergillus oryzae có quan hệ họ hàng gần với Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus sojae, chúng cũng đã được sử dụng để lên men shoyu trong một thời gian dài. Mặc dù có quan hệ họ hàng gần như vậy, Aspergillus oryzae không bao giờ tạo ra aflatoxin và do đó chúng được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men. Aspergillus oryzae có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 32–36℃ và không thể phát triển trên 44℃.

Chủng nấm mốc này được ghi nhận có độ pH sinh trưởng tối ưu là 5–6 và có thể sinh bào tử ở khoảng pH 2–8. Ở hầu hết các chủng Aspergillus oryzae màu của mẫu cấy tươi hoặc bào tử là màu xanh lục vàng, nhưng màu của mẫu cấy cũ là màu nâu, đôi khi có màu xanh lục với các sắc thái nâu. Đầu bào tử thường có hình cầu tỏa ra (Gomi, 2014). 6 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.

Nguồn vi sinh vật nghiên cứu Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong nghiên cứu được cấy chuyền từ đĩa giống gốc mua từ Viện sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội). Số hiệu chủng giống: VTCC-F-037. Môi trường sử dụng 3. Môi trường giữ giống Chúng tôi sử dụng môi trường thạch Malt extract agar (MEA) để giữ giống nấm mốc.

Thành phần môi trường MEA:  Nước: 1000 ml.  Malt xay nhỏ: 250 g.  Chuẩn hóa: Độ brix = 5,5 và pH = 5,5.  Bổ sung thêm ammonium sulfate (NH4)2SO4 để cung cấp nguồn nito cho nấm mốc phát triển.

Môi trường nhân giống nấm sợi Chúng tôi sử dụng môi trường malt để nhân giống nấm mốc. Thành phần môi trường nhân giống có những thành phần cơ bản giống với môi trường giữ giống, tuy nhiên không sử dụng agar. Tiệt trùng môi trường nhân giống đã chuẩn hóa trong autoclave ở nhiệt độ 121℃. Sau đó, môi trường được làm nguội tự nhiên về nhiệt độ phòng rồi bắt đầu cấy giống vi sinh vật vào môi trường.

Môi trường lên men Chúng tôi sử dụng môi trường malt như môi trường nhân giống để lên men, thu nhận enzyme từ chủng giống Aspergillus oryzae. Hóa chất sử dụng cho môi trường  CMC (carboxymethyl cellulose)  (NH4)2SO4 (ammonium sulfate)  Agar  Nước cất  NaOH  HCl 3. Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính của enzyme  Glucose (C6H12O6.H2O)  Thuốc thử DNS (3,5 – dinitrosalicylic acid)  Muối potassium sodium tartrate tetrahydrate (C4H4O6KNa. Hóa chất sử dụng cho phương pháp tinh sạch enzyme cellulase  Ammonium sulfate (NH4)2SO4  CaCl2  Nước cất  Ethanol 96% 3.

Thiết bị dụng cụ 3. Thiết bị Một số thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm:  Máy ly tâm lắng ROTANTA 460 Hettich Zentrifugen, Đức.  Nồi hấp tiệt trùng Autoclave ALP CL – 40L, Nhật Bản.  Máy lắc ống nghiệm Vortex ZX3, Đức.

 Máy quang phổ UV – Vis Halo Vis 20 Dynamica, Vương quốc Anh.  Kính hiển vi Euromex BB.4260-P-LED-Bioblue, Hà Lan.  Khúc xạ kế cầm tay ATAGO Master (0,0 – 33,0 Brix), Nhật Bản. 8  Tủ ủ vi sinh Memmert, Đức.

 Máy khuấy từ 10 vị trí.  Tủ cấy vô trùng Streamline Esco Class II BSC, Singapore.  Tủ lắc ủ nhiệt JEIOTECH Hàn Quốc.  Cân phân tích 4 số.

 Cân phân tích 2 số. Dụng cụ  Cối, chày.  Màng thẩm tích (dialyzer membrane) làm bằng cellophane (Thông số: 14.000 MWCO Daltons; Chiều ngang: 44 mm; Chiều dài: 100 mm).  Ống nghiệm duran, Đức.

 Bình định mức (100 ml, 500 ml).  Ống ly tâm.  Que cấy kim loại. Phương pháp nghiên cứu 3.

Phương pháp vi sinh vật 3. Phương pháp giữ giống Dùng phương pháp cấy ziczac trên thạch nghiêng với nấm sợi Aspergillus Oryzae trong môi trường malt extract agar. Phương pháp lên men Cố định số lượng tế bào nấm mốc bằng cách cho một lượng 10-15 ml nước cất đã tiệt trùng vào ống thạch nghiêng chứa bào tử nấm mốc. Dùng que cấy vòng để lấy bào tử nấm mốc, tiếp theo đếm số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu.

Mật độ tế bào nấm mốc được xác định theo công thức: (Trịnh, 2021) 𝑎 400 𝑁=( × ) × 103 × 10𝑛 𝑏 0,1 Trong đó: N: số tế bào có trong 1,0 ml mẫu cho vào buồng đếm. a: Số tế bào trên 5 ô vuông lớn. b: Số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16×5=80). 400: Tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn.

0,1: Thể tích (𝑚𝑚2) mẫu chứa trên ô trung tâm. 103: Số chuyển 𝑚𝑚3 thành ml. 10n: độ pha loãng mẫu. Chúng tôi sử dụng ống ly tâm có thể tích 50 ml đã tiệt trùng hút 30 ml môi trường malt đã tiệt trùng vào ống.

Hút dịch chứa huyền phù tế bào nấm mốc đã tính toán trước cho vào từng ống ly tâm, cố định mỗi ống ly tâm sẽ có số bào tử nấm mốc dao động khoảng 107. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện với những yếu tố khảo sát khác nhau trong mỗi thí nghiệm. Phương pháp thu nhận enzyme Khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men trong mỗi ống sẽ được nghiền bằng cối sứ.