Quy trình điều chế Genipin từ Geniposide trong hạt dành dành bằng enzym Cellulase

Tổng quan quy trình điều chế genipin từ geniposide hạt dành dành. Luận văn ứng dụng phương pháp thủy phân với xúc tác enzym cellulase hiệu quả.

• Tác giả: Đoàn Thị Minh Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Ngà
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Điều chế Genipin từ Geniposide trong hạt Dành Dành bằng phản ứng thủy phân với xúc tác Enzyme Cellulase
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây Dành Dành và Geniposide

Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) là một loài thực vật có giá trị cao trong y học cổ truyền Đông Á, đặc biệt là ở Trung Quốc và Việt Nam. Hạt dành dành chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học quý giá, trong đó geniposide là thành phần chính. Geniposide là một iridoid glycoside, có công thức phân tử C17H28O9, với khối lượng phân tử 376.41 g/mol. Hợp chất này được biết đến với các tính chất chống viêm, chống trầm cảm và cải thiện lưu thông khí huyết. Geniposide được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Để tận dụng tối đa lợi ích của geniposide, việc điều chế genipin từ geniposide trở thành một bước quan trọng trong quá trình tạo ra các sản phẩm hữu ích.

1.1. Đặc điểm và thành phần hóa học của hạt Dành Dành

Hạt dành dành là nguồn tự nhiên phong phú của các iridoid glycoside, đặc biệt là geniposide. Ngoài geniposide, hạt dành dành còn chứa các monoterpenoid khác như gardenoside, geniposidic acid, và nhiều hợp chất phenolic. Các thành phần này có tác dụng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Thành phần crocin cũng được tìm thấy trong hạt, có khả năng cải thiện thị lực và chức năng não bộ. Sự đa dạng này làm cho hạt dành dành trở thành nguyên liệu lý tưởng cho các nghiên cứu về điều chế genipin.

1.2. Ứng dụng của Genipin trong y dược

Genipin, sản phẩm từ geniposide, là một aglycone quan trọng có khối lượng phân tử 226.23 g/mol. Nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: tạo chất kết dính trong các sản phẩm y tế sinh học, tăng cường độ bền của protein, và trong các công thức dược phẩm. Genipin có khả năng hình thành các liên kết chéo với protein, giúp cải thiện tính ổn định của các sản phẩm. Ngoài ra, genipin còn có hoạt tính chống khuẩn và chống viêm, làm cho nó trở thành một thành phần quý giá trong ngành dược phẩm hiện đại.

II. Phương pháp Enzym trong Điều chế Genipin

Phương pháp enzym là một cách tiếp cận hiện đại và hiệu quả để điều chế genipin từ geniposide trong hạt dành dành. Phương pháp này sử dụng xúc tác enzyme cellulase để thủy phân liên kết glycosidic trong geniposide, giải phóng genipin aglycone. So với các phương pháp hóa học truyền thống, phương pháp enzym có nhiều ưu điểm: đặc hiệu cao, điều kiện phản ứng nhẹ, an toàn hơn, và thân thiện với môi trường. Enzyme cellulase được lựa chọn vì khả năng thủy phân cụ thể liên kết beta-glucosidic trong geniposide. Quá trình phản ứng diễn ra ở pH trung tính, nhiệt độ vừa phải (khoảng 37-40°C), đảm bảo bảo tồn cấu trúc của genipin và giảm thiểu các phản ứng phụ không mong muốn.

2.1. Lựa chọn Enzyme Cellulase và điều kiện tối ưu

Enzyme cellulase là lựa chọn tối ưu cho phương pháp thủy phân geniposide. Cellulase có khả năng nhận dạng cụ thể liên kết beta-1,4-glycosidic trong geniposide, đảm bảo hiệu suất cao. Các điều kiện tối ưu bao gồm: pH từ 4,0 đến 5,5, nhiệt độ 37-40°C, thời gian phản ứng 6-8 giờ, và nồng độ enzyme cellulase 50-100 mg/mL. Yếu tố nồng độ enzyme, tỷ lệ mặt cắt (substrate to enzyme ratio), và thời gian phản ứng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất điều chế genipin.

2.2. Ưu điểm của phương pháp Enzym so với hóa học

Phương pháp enzym vượt trội hơn phương pháp thủy phân hóa học về nhiều khía cạnh. Thứ nhất, enzyme cellulase hoạt động với độ đặc hiệu cao, chỉ tác động trên liên kết mục tiêu. Thứ hai, điều kiện phản ứng nhẹ (pH trung tính, nhiệt độ thấp) bảo vệ genipin khỏi phân hủy. Thứ ba, không sinh ra các sản phẩm phụ độc hại như trong thủy phân axit hoặc kiềm. Cuối cùng, phương pháp enzym thân thiện với môi trường và tiết kiệm năng lượng, phù hợp với xu hướng sản xuất xanh hiện đại.

III. Quy trình Thực nghiệm Điều chế Genipin

Quy trình điều chế genipin từ bột hạt dành dành bao gồm nhiều bước liên tiếp. Đầu tiên, chiết geniposide thô bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi thích hợp, sau đó sử dụng than hạt hoạt tính để loại bỏ các sắc tố không mong muốn. Tiếp theo, thực hiện phân lập geniposide bằng sắc ký cột sephadex LH-20 để có geniposide thuần. Bước quan trọng nhất là thủy phân geniposide với xúc tác enzyme cellulase dưới các điều kiện tối ưu (pH 4,5, 37°C, 7 giờ) để tạo ra genipin. Cuối cùng, tinh sạch genipin bằng sắc ký cột silica gel. Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.1. Các bước chiết xuất và tinh sạch Geniposide

Chiết xuất geniposide bắt đầu bằng việc ngâm bột hạt dành dành trong dung môi ethanol hoặc methanol ở nhiệt độ phòng trong 24-48 giờ. Dịch chiết được lọc và cồn được bay hơi dưới chân không. Tiếp theo, dung dịch geniposide thô được rửa bằng n-butanol ở pH tối ưu (khoảng 3,5-4,0) để tách geniposide khỏi các tạp chất. Geniposide được tinh sạch bằng sắc ký cột sephadex LH-20 bằng cách sử dụng dung môi ethanol 50% làm dung dịch rửa.

3.2. Phản ứng Thủy phân với Enzyme Cellulase

Phản ứng thủy phân được thực hiện bằng cách hòa tan geniposide tinh sạch (100-200 mg) trong đệm phosphate pH 4,5. Thêm enzyme cellulase (100 mg/mL, 0,5 mL) vào dung dịch. Phản ứng diễn ra ở 37°C trong lò nung 6-8 giờ với khuấy liên tục. Theo dõi quá trình bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) tại từng giai đoạn. Khi genipin hình thành đủ, dẫn điện enzyme bằng cách đun nóng đến 100°C trong 5 phút. Genipin được trích bằng ethyl acetate hoặc ether dầu mỏ.

IV. Kết quả Phân tích và Triển vọng Ứng dụng

Nghiên cứu điều chế genipin từ hạt dành dành bằng phương pháp enzym đã cho kết quả rất khả quan. Hiệu suất chuyển hóa geniposide thành genipin đạt 60-75% trong điều kiện tối ưu. Genipin thu được có độ tinh khiết cao (>95%) theo kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cấu trúc của genipin được xác nhận bằng phổ NMR và phổ khối lượng, phù hợp với dữ liệu văn献. So với phương pháp thủy phân hóa học, phương pháp enzym cho hiệu suất cao hơn 15-20%, chi phí hoạt động thấp hơn, và độ ảnh hưởng môi trường thấp hơn. Triển vọng ứng dụng genipin rất lớn trong công nghệ dược phẩm hiện đại.

4.1. Đặc trưng hóa và xác định cấu trúc Genipin

Genipin thu được được xác định bằng nhiều phương pháp phân tích. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho thấy độ tinh khiết của genipin trên 95%, với thời gian lưu giữ cụ thể. Phổ khối lượng (MS) xác nhận khối lượng phân tử [M+H]+ = 227. Phổ NMR ¹H và ¹³C cho thấy các tín hiệu đặc trưng của cấu trúc iridoid. Phổ hồng ngoại (IR) cho thấy các bande hấp thụ ứng với các nhóm chức năng của genipin. Dữ liệu này hoàn toàn phù hợp với các tài liệu tham khảo đã công bố.

4.2. Triển vọng ứng dụng và phát triển công nghệ

Genipin từ phương pháp enzym mở ra nhiều triển vọng ứng dụng thực tiễn. Trong lĩnh vực dược phẩm, genipin được sử dụng như tác nhân kết dính trong các vật liệu sinh học. Trong thực phẩm chức năng, nó được thêm vào để tăng cường hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm. Ngoài ra, genipin có tiềm năng trong công nghệ mỹ phẩm và chẩn đoán y tế. Việc phát triển quy trình điều chế genipin từ hạt dành dành bằng phương pháp enzym có thể mở ra cơ hội cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn, đóng góp vào tăng giá trị nông sản và phát triển kinh tế bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Geniposide và genipin là hai hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis). Genipin là một aglycone có nguồn gốc từ geniposide đã được nghiên cứu và chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm kháng viêm, kháng vi khuẩn, kháng ung thư và chống oxi hóa được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như dược phẩm, thực phẩm và công nghệ mỹ phẩm. Ngoài việc thể hiện nhiều tác dụng dược lý, genipin đã trở thành một hợp chất đầy hứa hẹn được sử dụng như một chất tạo liên kết ngang do nó có khả năng phản ứng với các nhóm amine bậc một trong các vật liệu sinh học để tạo ra hợp chất dị vòng. Khi lượng genipin tăng lên, mức độ liên kết ngang của vật liệu sinh học và genipin tăng lên dẫn đến giảm độ trương nở và khả năng thấm ướt, cho phép nó hình thành mạng lưới với các polymer sinh học quan trọng, ví dụ như gelatin và chitosan được áp dụng cho kỹ thuật mô và chất mang thuốc để tăng cường vận chuyển.

Khả năng liên kết ngang của genipin có thể so sánh với các tác nhân liên kết ngang hóa học như glutaraldehyde, nhưng có độc tính tế bào thấp và tạo thành các sản phẩm liên kết ngang ổn định và tương thích sinh học. Hơn nữa, là một tiền chất tham gia phản ứng tạo chất màu tốt trong ngành công nghiệp thực phẩm, cụ thể genipin có phản ứng với các amino acid để tạo thành sắc tố màu xanh lam ổn định nhiệt, an toàn và ăn được. Do có nhiều ứng dụng khác nhau nên nhu cầu về genipin rất lớn; tuy nhiên, hàm lượng genipin trong cây dành dành khá thấp; trong khi geniposide có hàm lượng cao hơn. Vì vậy, các phương pháp điều chế genipin tinh khiết từ nguồn gốc thực vật đã trở thành một hướng nghiên cứu tiềm năng và hứa hẹn trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học.

Trong đó, một quy trình điều chế hiệu quả, khả thi và thân thiện với môi trường hơn đã được đề ra thông qua các phương pháp như chiết và sử dụng công nghệ sinh học. Dựa trên các nghiên cứu đã công bố trong và ngoài nước, với tinh thần ham học hỏi tôi đã chọn đề tài “Điều chế genipin từ geniposide trong hạt dành dành bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme cellulase”, nhằm mục đích khảo sát phương pháp điều chế genipin tinh khiết và cung cấp thông tin cho các nghiên cứu về phân lập hợp chất thiên nhiên từ cây dành dành. Từ đó nâng cao giá trị của cây dành dành trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hoạt tính sinh học của các hợp chất này, giúp cải thiện sức khỏe con người. xii TỔNG QUAN 1.

Tổng quan về cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) 1. Giới thiệu chung Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis), thường được gọi là cây Chi tử, là một loại cây bụi thường xanh thuộc họ Rubiaceae có nguồn gốc từ một số vùng thuộc Đông Nam Á như Việt Nam, Đài Loan, Nhật Bản, Myanmar và Ấn Độ và được trồng nhiều ở Trung Quốc. Nó mọc ở nhiều vùng ôn đới và cận nhiệt đới [1] [2]. Quả khô của cây được liệt kê là nguyên liệu thô trong Dược điển Trung Quốc và Nhật Bản, phổ biến với tên gọi là “Zhizi” ở Trung Quốc, “Sanshishi” ở Nhật Bản và “Cape Jasmine” ở Hàn Quốc [3].

Các bộ phận của cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) có thể được sử dụng là hạt, lá, hoa và rễ. Lá chứa saponin, flavonoid, polyphenol và tinh dầu. Hạt có chứa iridoid glycoside và crocin. Ở Trung Quốc, những bông hoa được sử dụng như một chất tăng hương vị trong lá trà.

Hạt có thể ăn được và có thể được sử dụng làm chất tạo màu vàng tự nhiên trong thực phẩm như nghệ [4]. Hợp chất crocetin chứa trong hạt theo truyền thống được sử dụng làm gia vị, màu thực phẩm và thuốc thảo dược [5]. Hạt của loại cây này còn có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau. Theo truyền thống, hạt dành dành được sử dụng trong công thức y học dân gian để điều trị các bệnh khác nhau, chẳng hạn như trị đái tháo đường, chống viêm, thanh nhiệt giải độc, máu huyết tiêu ứ, hoạt huyết thông kinh, trị đái tháo đường, chống viêm, chống trầm cảm, đặc tính chống oxy hóa và cải thiện chất lượng giấc ngủ [2].

Nó cũng đã được tuyên bố là thực vật đa năng đầu tiên được sử dụng cho chức năng thực phẩm và y tế ở Trung Quốc [1], [3]. Thành phần hóa học trong cây dành dành phát huy một số hoạt tính sinh học nhất định cả in vitro và in vivo. Trong số đó, iridoid glycoside và sắc tố màu vàng thường được coi là thành phần hoạt tính sinh học chính và đặc trưng. Nghiên cứu gần đây cho thấy chiết xuất từ cây dành dành có hoạt tính chống trầm cảm [6] và các đặc tính dược lý khác nhau.

Hơn nữa, geniposide và genipin là những hợp chất iridoid quan trọng nhất được phân lập từ cây dành dành. Là hoạt chất chiếm ưu thế với hoạt tính dược lý, genipin cũng là một tác nhân 1 liên kết ngang sinh học nổi bật. Sắc tố màu vàng cũng đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc nhuộm tự nhiên. Do đó, cây dành dành đã được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may và công nghiệp hóa chất, bên cạnh việc sử dụng thuốc chủ yếu [3].

Đặc điểm thực vật cây dành dành Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) là một loại cây thân thảo hàng năm thân thẳng có nhiều nhánh, những bông hoa lớn và lá dày. Thân cây có thể đạt chiều cao khoảng 1-2 mét với rễ cọc [7], [8]. Lá hình bầu dục, dày, nhẵn bóng ở mặt trên. Hoa đơn tính, cuống ngắn, màu trắng, mọc ra từ đầu cành, to tương tự như hoa hồng trắng có tán hình tròn và xếp thành một bông đơn độc, có mùi thơm.

Lá cây tươi tốt quanh năm, thường mọc đối nhau hoặc mọc thành vòng 3 lá. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5, mùa quả tháng 8 đến tháng 10. Hình dạng của hạt hình bầu dục, vỏ mỏng, có màu vàng đỏ khi chín muộn vào cuối thu, thịt quả màu vàng cam, hạt nhiều, dẹt, chứa sắc tố màu vàng và có nhiều hạt. Hạt dành dành khô dùng làm thuốc [4].

Hình ảnh cây dành dành được trình bày ở Hình 1. Thành phần hóa học 1. Các thành phần dễ bay hơi Các hợp chất dễ bay hơi chính trong cây dành dành là acid béo, ketone, adehyde, ester, rượu và các dẫn xuất thơm [6], [9]. Do nhiệt độ và thời gian thực hiện khác nhau, tinh dầu từ hạt dành dành chứa các hợp chất dễ bay hơi với hàm lượng và tỷ lệ khác nhau.

Ngoài ra, còn có các thành phần không ổn định như trường hợp iridoid có thể chuyển hóa một phần thành các thành phần dễ bay hơi trong quá trình xử lý ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu từ hạt dành dành được chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn CO2, trong đó 16 thành phần chính của chiết xuất đã được phân tích bởi GC-MS. Trong những năm gần đây, với các kỹ thuật khai thác hiện đại có sẵn, nhiều nghiên cứu về việc khai thác cây dành dành để tìm ra phương pháp chiết tối ưu. Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) (Nguồn: Sưu tầm) 1.

Crocin và các dẫn xuất Crocin là một nhóm các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ carotenoid xuất hiện trong hạt dành dành và nghệ tây từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc thảo dược truyền thống 3 và chất tạo màu tự nhiên [12], [13]. Crocin và các dẫn xuất của nó trong hạt dành dành [14] được đề cập trong Hình 1. Nghệ tây là nguồn crocin tự nhiên chính (crocetin ester), là các dẫn xuất carotene hòa tan trong nước cấu thành với hàm lượng chung nằm trong khoảng 16–28% trong nhụy hoa khô [15]. Vì sự hiếm có và giá nghệ tây cao, việc tìm kiếm các nguồn thay thế, tức là phụ phẩm nông nghiệp có giá trị tiềm năng cực kỳ cao.

Trong số tất cả các dẫn xuất của crocetin, crocin là hợp chất chính đại diện cho màu của hạt dành dành [16]. Là một sắc tố màu, độc tính của crocin thấp không thể phát hiện được, thân thiện với môi trường và ổn định về mặt hóa học so với nhiều sắc tố thực phẩm tự nhiên khác [17]. Nó có vai trò như một chất chống oxy hóa, màu thực phẩm và chất chuyển hóa thực vật. Nghiên cứu cho thấy ethanol (EtOH) được chọn làm dung môi vì tính an toàn trong tiêu dùng của con người và ít gây hại đến môi trường [18].

Hạt dành dành được chiết bằng phương pháp chiết đồng nhất trong dung dịch nước EtOH 50o với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là (1:15), kích thước hạt nguyên liệu là 1,7mm, thời gian chiết xuất là 41 giây [19]. Hiệu suất chiết của sắc tố màu vàng lớn hơn 50% khi sử dụng hệ thống chiết có sự hỗ trợ của vi sóng so với khi sử dụng phương pháp chiết tiêu chuẩn [20]. Nồng độ EtOH 50o trong nước có lợi cho việc tăng năng suất chiết, điều này được cho là do thành phần đường phân cực và nhiều nhóm OH tạo liên kết hydro với nước tốt nên dung môi EtOH cần bổ sung nước để dễ tan crocin vì vậy nồng độ EtOH quá cao không có lợi cho việc chiết crocin. Hợp chất phenolic Một số phenolic acid đã được xác định trong hạt dành dành, chẳng hạn như 3,5-di-O- caffeoyl-4-O-(3-hydroxy-3-methyl)gluta-roylquinic acid; 3,5-di-O-caffeoylquinic acid; 4- O-sinapoyl-5-O-caffeoyl-quinic acid [21] và chlorogenic acid [22] và một lignin glucoside mới, (+)-(7S,8R,8’R)-lyoniresinol 9-O-β-D-(6’’-O-trans-sinapoyl)glucopyranoside được đề cập ở Hình 1.

Các hợp chất phenolic được sử dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm và đau [23]. Phương pháp bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa các thông số chiết hợp chất phenolic từ hạt dành dành. Ảnh hưởng của ba biến số độc lập, cụ thể là nồng độ EtOH (°), nhiệt độ (°C) và thời gian (phút) đến hàm lượng phenolic tổng. Kết quả nghiên cứu cho 4 thấy điều kiện tối ưu được xác định là ở nồng độ EtOH 51,8 o, nhiệt độ 72,9 °C và thời gian 34,6 phút với hiệu suất tối đa của tổng hợp hàm lượng phenolic tổng là 24,86 mg/g bột khô [24].

Cấu trúc hóa học của (+)-(7S,8R,8’R)-lyoniresinol 9-O-β-D-(6’’-O-trans- sinapoyl)glucopyranoside Hình 1. Crocin và các dẫn xuất của nó trong hạt dành dành 5 Bảng 1.