Nghiên cứu điều chế Dihydromyricetin từ Chè Dây làm nguyên liệu chất chuẩn

Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Dihydromyricetin từ lá Chè dây. Khóa luận hướng tới mục tiêu điều chế DHM làm nguyên liệu chất chuẩn.

• Tác giả: Vũ Thị Hương
• Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thái Hà Văn
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên cứu điều chế Dihydromyricetin từ vị thuốc Chè dây theo hướng làm nguyên liệu cho chất chuẩn
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp cử nhân
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Dihydromyricetin và Chè dây

Dihydromyricetin là một hợp chất flavonoid quan trọng được phân lập từ lá Chè dây (Ampelopsis grossedentata). Đây là một dược liệu truyền thống có giá trị cao trong y học cổ truyền Việt Nam, được sử dụng để chống oxy hóa và hỗ trợ sức khỏe. Cây Chè dây chứa nhiều thành phần hữu ích, đặc biệt là các hợp chất flavonoid với hoạt tính sinh học mạnh mẽ. Dihydromyricetin nổi bật vì khả năng làm chất chuẩn trong các nghiên cứu dược phẩm, giúp kiểm định chất lượng các sản phẩm từ dược liệu này. Việc chiết xuất và tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây là một quá trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật chuyên biệt và điều kiện tối ưu để đạt hiệu suất cao.

1.1. Đặc điểm và thành phần của cây Chè dây

Cây Chè dây là một loài thực vật quý hiếm với thành phần hóa học phong phú. Lá Chè dây chứa 5 hợp chất flavonoid chính, trong đó dihydromyricetin chiếm tỷ lệ cao nhất. Ngoài ra, lá còn chứa các acid hữu cơ và các thành phần khác có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh hoạt tính sinh học vượt trội của Ampelopsis trong việc bảo vệ sức khỏe con người.

1.2. Ý nghĩa của Dihydromyricetin làm chất chuẩn

Dihydromyricetin làm chất chuẩn có vai trò quan trọng trong kiểm định chất lượng dược phẩm. Chất chuẩn này giúp các nhà khoa học định lượng hàm lượng dihydromyricetin trong các sản phẩm từ Chè dây bằng các phương pháp phân tích như HPLC. Việc thiết lập chất chuẩn từ hợp chất tự nhiên là nhu cầu cấp thiết trong ngành dược, đặc biệt để chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng các sản phẩm dược liệu.

II. Quy trình chiết xuất phân lập và tinh chế Dihydromyricetin

Quy trình chiết xuất dihydromyricetin từ lá Chè dây thường sử dụng ethanol 75% hoặc dung dịch natri tetraborat 2,0% làm dung môi chính. Các bước chính bao gồm: chiết xuất, phân lập flavonoid toàn phần, kết tinh và tinh chế. Mỗi bước đòi hỏi kiểm soát tỉ mỉ các yếu tố như nồng độ dung môi, thể tích dung dịch và số lần tinh chế. Phương pháp thẩm định phương pháp định lượng được sử dụng để xác định độ tinh khiết của chất dihydromyricetin thu được. Kết quả cuối cùng là một chất chuẩn có độ tinh khiết cao, phù hợp để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu dược phẩm và kiểm định chất lượng.

2.1. Phương pháp chiết xuất sử dụng Ethanol 75

Phương pháp chiết xuất với ethanol 75% là một trong những quy trình hiệu quả nhất để tách dihydromyricetin từ lá Chè dây. Nồng độ ethanol được chọn tối ưu để tối đa hóa lượng hợp chất flavonoid thu được. Các yếu tố như thể tích để kết tinh flavonoid và nồng độ ethanol dùng tinh chế cần được khảo sát kỹ lưỡng để đạt hiệu suất cao nhất. Phương pháp này thường cho kết quả chiết xuất cao và dihydromyricetin có độ tinh khiết tốt.

2.2. Phương pháp chiết xuất sử dụng Natri tetraborat

Dung dịch natri tetraborat 2,0% là một dung môi thay thế hiệu quả trong chiết xuất dihydromyricetin. Phương pháp này có ưu điểm là an toàn hơn và thân thiện với môi trường. Quá trình phân lập và tinh chế với natri tetraborat yêu cầu số lần tinh chế thích hợp để loại bỏ tạp chất và nâng cao độ tinh khiết. So sánh kết quả của 2 phương pháp cho thấy cả hai đều có hiệu quả, nhưng lựa chọn phụ thuộc vào nhu cầu ứng dụng cụ thể.

III. Thẩm định phương pháp định lượng Dihydromyricetin

Thẩm định phương pháp định lượng là bước quan trọng để đánh giá tính hợp lệ của phương pháp phân tích dihydromyricetin. Các tiêu chí thẩm định bao gồm: tính thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Phương pháp HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) thường được sử dụng để định lượng dihydromyricetin với độ chính xác cao. Xây dựng đường chuẩn từ chất chuẩn dihydromyricetin là bước cơ bản nhất. Các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng có tính thích hợp tốt, tuyến tính trong vùng nồng độ rộng, và độ chính xác đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC và ICH.

3.1. Đánh giá tính thích hợp hệ thống và độ tuyến tính

Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá bằng cách chạy thử nghiệm và so sánh sắc kí đồ của chất chuẩn. Các thông số như độ phân giải, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) cần đáp ứng các yêu cầu cho trước. Độ tuyến tính được xác định thông qua việc xây dựng đường chuẩn với nhiều nồng độ khác nhau, đảm bảo mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh trên sắc kí đồ.

3.2. Độ đúng độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Độ đúng được thẩm định bằng phương pháp hồi quy hoặc bình phương nhỏ nhất, so sánh giá trị lý thuyết và thực nghiệm. Độ lặp lại được kiểm tra bằng cách chạy mẫu nhiều lần và tính RSD của kết quả. Độ chính xác trung gian được đánh giá trên những ngày khác nhau với thiết bị khác nhau, đảm bảo tính ổn định của phương pháp trong điều kiện thực tế.

IV. Các yếu tố ảnh hưởng và ứng dụng thực tiễn của chất chuẩn

Nhiều yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết xuất và độ tinh khiết của dihydromyricetin từ Chè dây. Các khảo sát chỉ ra rằng nồng độ dung môi, thể tích dung dịch, nồng độ ethanol tinh chế, số lần tinh chế và phương pháp chiết đều có tác động đáng kể. Việc tối ưu hóa các yếu tố này giúp nâng cao hiệu suất và đảm bảo chất lượng của chất chuẩn dihydromyricetin. Ứng dụng thực tiễn của chất chuẩn này rất rộng rãi, từ kiểm định chất lượng các sản phẩm dược liệu, chuẩn hóa các sản phẩm tự nhiên, đến hỗ trợ các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và tác dụng sinh học của dihydromyricetin.

4.1. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và tinh chế

Nồng độ dung môi ethanol (từ 60% đến 95%) ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết xuất dihydromyricetin. Thể tích dung dịch dùng để kết tinh flavonoid và nồng độ ethanol dùng tinh chế cần tối ưu hóa riêng biệt. Số lần tinh chế càng nhiều, độ tinh khiết của dihydromyricetin càng cao, nhưng cũng giảm hiệu suất tổng thể. Việc cân bằng giữa hiệu suất và độ tinh khiết là mấu chốt để tạo ra chất chuẩn có chất lượng tối ưu.

4.2. Ứng dụng chất chuẩn Dihydromyricetin trong kiểm định dược phẩm

Chất chuẩn dihydromyricetin được sử dụng làm nguyên liệu tham chiếu trong kiểm định chất lượng các sản phẩm từ Chè dây bằng phương pháp HPLC. Xây dựng đường chuẩn từ chất chuẩn này cho phép định lượng chính xác hàm lượng dihydromyricetin trong mẫu. Các ứng dụng khác bao gồm chuẩn hóa các chiết xuất Chè dây, hỗ trợ các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa (liên quan đến MDA), và đánh giá tác dụng sinh học của sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dược liệu từ lâu đã là nguồn cung cấp quan trọng các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho nghiên cứu và phát triển dược phẩm. Trong những năm gần đây, xu hướng khai thác và phát triển các hoạt chất từ thực vật đang ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các hợp chất có tiềm năng ứng dụng cao trong điều trị và chăm sóc sức khỏe. Việt Nam với hệ thực vật phong phú là nguồn cung cấp dồi dào các loài dược liệu có tiềm năng ứng dụng cao trong nghiên cứu và sản xuất dược phẩm. Chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.) là một trong những dược liệu triển vọng, đã được nghiên cứu chứng minh chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid, trong đó nổi bật nhất là dihydromyricetin.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng dihydromyricetin có khả năng chống oxy hóa mạnh, bảo vệ tế bào gan, kháng viêm, và hỗ trợ cai nghiện rượu [1], [2], [3]. Ngoài ra, dihydromyricetin còn có triển vọng được ứng dụng trong điều trị hội chứng chuyển hóa và bệnh đái tháo đường type 2 [4], [5]. Tuy nhiên, hiện nay chất chuẩn dihydromyricetin tại Việt Nam vẫn chủ yếu phải nhập khẩu với giá thành cao, dao động từ vài đến hàng chục triệu đồng mỗi gam tùy độ tinh khiết, và thời gian đặt hàng kéo dài, gây trở ngại cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu. Điều này làm hạn chế khả năng phát triển các sản phẩm chiết xuất tiêu chuẩn hóa từ Chè dây [6].

Chính vì vậy, việc nghiên cứu quy trình điều chế dihydromyricetin tinh khiết từ Chè dây trong nước, đạt tiêu chuẩn dùng làm nguyên liệu cho chất chuẩn, là hướng đi có giá trị thiết thực cả về mặt khoa học lẫn kinh tế. Nó không chỉ góp phần phục vụ nghiên cứu, phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng, mà còn giúp chủ động nguồn nguyên liệu cho chất chuẩn, giảm lệ thuộc vào nhập khẩu và nâng cao giá trị dược liệu Việt Nam trên thị trường quốc tế. Xuất phát từ các vấn đề trên, nhằm xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế và kiểm định chất lượng dihydromyricetin từ Chè dây, hướng tới việc tạo ra nguyên liệu chuẩn hóa phục vụ công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu điều chế dihydromyricetin từ vị thuốc Chè dây theo hướng làm nguyên liệu cho chất chuẩn” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn được điều kiện chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây.

Điều chế dihydromyricetin từ Chè dây theo hướng làm nguyên liệu cho chất chuẩn. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1. Tổng quan về cây Chè dây 1. Tên khoa học Tên khoa học: Ampelopsis cantoniensis (Hook.

Tên đồng nghĩa: Cissus cantoniensis Hook et Arn [8]. Tên khác: Chè hoàng giang, song nho, pàn oỏng, khau cha (Tày) [8]. Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [9], vị trí phân loại của cây Chè dây như sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Nho (Vitales) Họ Nho (Vitaceae) Chi Ampelopsis 1. Đặc điểm thực vật Cây leo.

Thân và cành cứng, hình trụ, có lông nhỏ. Tua cuốn chẻ đôi, mọc đối diện với lá. Lá kép lông chim, mọc so le, có 7-13 lá chét có cuống, hình trái xoan, dài 2,5- 7,5 cm, rộng 1,5-5 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mép có ít răng cưa, nhẵn, mặt trên lá khi khô có những vệt trắng loang lổ như bị nấm mốc, mặt dưới rất nhạt; lá kèm khô xác [7]. Cụm hoa mọc đối diện với lá thành ngù phân nhiều nhánh, rộng 3-6 cm; hoa nhiều màu trắng; đài hình chén, có lông mịn, 5 răng ngắn; tràng có 5 cánh, mép hơi nhăn; nhị 5, chỉ nhị mảnh; bầu hình nón, nhăn, có 2 ô, mỗi ô 2 noãn [7].

Quả mọng khi chín màu đen; hạt 3-4, thót lại ở gốc [7]. Đặc điểm sinh thái, phân bố Chè dây có ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc, Lào, Ấn Độ và Indonesia [8]. Tại Việt Nam, Chè dây phân bố ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Lào Cai. Sau đó được phát hiện thêm ở nhiều điểm như Đồng Văn, Mèo Vạc, Yên Minh, Quản Bạ (Hà Giang); Hương Khê (Hà Tĩnh); Trà My (Quảng Nam); Đăk Tô, Konplông (Kon Tum); K’Bang (Gia Lai) và một số điểm khác ở Nghệ An, Lâm Đồng và Đồng Nai.

Trong đó Đồng Văn và Yên Minh là nơi có Chè dây mọc tập trung nhất [8]. Chè dây là loại cây ưa ẩm và ưa sáng, thường leo và mọc trùm lên trên các loại cây bụi và cây gỗ nhỏ ở vùng đồi, ven rừng hoặc ở bờ nương rẫy. Độ cao phân bố từ 2 600-1600 m. Cây thích nghi với vùng á nhiệt đới núi cao như Hà Giang, Lào Cai,… Mùa ra chồi và sinh trưởng mạnh trùng với mùa mưa ẩm [8].

Bộ phận dùng Phần trên mặt đất của cây Chè dây thu hái vào lúc cây chưa ra hoa, cắt nhỏ, phơi khô [8]. Tổng quan về dược liệu lá Chè dây Folium Ampelopsis 1. Mô tả Lá đã phơi sấy khô của cây Chè dây [Ampelopsis cantoniensis (Hook. Đặc điểm dược liệu: lá thường nhàu nát, khi dàn phẳng có hình trái xoan hoặc hình mũi mác, dài 2,5 cm đến 7,5 cm, phía cuống tù hay hơi tròn, đầu lá nhọn, mép có ít răng cưa.

Mặt trên màu lục xám, có những vết trắng loang lổ trông như mốc, mặt dưới màu nhạt hơn. Cuống lá nhẵn, dài 3 mm đến 12 mm. Thể nhẹ, chất giòn, dễ gãy nát, mùi thơm, vị đắng sau hơi ngọt nhẹ [7]. Thành phần hóa học Trong dược liệu lá Chè dây gồm có các thành phần: flavonoid, tanin, acid hữu cơ, caroten, các nguyên tố vi lượng K, Ca, Fe, Zn và một số vitamin [10], [11].

Flavonoid Năm flavonoid chính có trong dược liệu lá Chè dây gồm có: myricitrin, myricetin, quercetin, dihydromyricetin, phloretin [12], [13]. Ngoài năm flavonoid trên, các hợp chất flavonoid khác đã được tìm thấy trong lá Chè dây như: quercitin, phloritin, 5,7- dihydroxychromone, 3,5,7-trihydroxychromone, alstilbin, aromadendrin, 3′,5′,5,7- tetrahydroxyflavanone [13]. Trong đó nhiều nhất là myricetin và dihydromyricetin với hàm lượng cao (18-19 %) [12], [14]. Một số hợp chất flavonoid được phân lập từ Chè dây STT Tên thành phần Công thức cấu tạo Phân nhóm TLTK 1 Dihydromyricetin Flavanol [10], [12] 3 2 Myricetin Flavonol [10], [12] 3 Quercetin Flavonol [12], [13] 4 Myricitrin Flavonol [12], (myricetin-3-O- [13] rhamnoside) 5 Phloretin Chalcone [12], [13] 6 Quercitin Flavonol [13] 4 7 5,7-Dihydroxy Flavone [13] chromone 8 Dihydro [13] Phlorizin chalcone glycoside 9 3,5,7-Trihydroxy Flavone [13] chromone 10 Alstilbin Flavanonol [13] glycoside 11 Aromadendrin Flavanonol [13] 12 3′,5′,5,7- Flavanonol [13] Tetrahydroxy flavanone 13 2-(3,4-dihydroxy- Dihydro [13] phenyl)ethyl-O-β- chalcone D- glucopyranoside 5 b.

Tanin Tanin catechin trong lá Chè dây có hàm lượng cao, khoảng 10,8-13,3 % [10]. Tanin trong lá Chè dây thuộc nhóm tannin catechic được ngưng tụ từ các đơn phân tử cơ bản là catechin và epicatechin là hai đồng phân của nhau [10], [15]. Acid hữu cơ Bảng 1. Công thức cấu tạo của một số acid hữu cơ trong Chè dây STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK 1 Acid gallic [13] 2 Acid phloretic [13] 3 Acid digallic [13] d.

Các hợp chất khác 6 Bảng 1. Công thức cấu tạo của một số thành phần khác trong Chè dây STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK 1 Methyl gallate [13] 2 Arbutin [13] 3 3,4-Dihydro-2- [13] (3′,4′,5′- trihydroxyphenyl)-2H- chromene-4,5,7-triol 1. Tác dụng chống loét dạ dày Theo nghiên cứu tiến hành thực nghiệm gây loét dạ dày bằng mô hình Shay trên chuột cống trắng. Flavonoid toàn phần uống với liều 1 g/kg/ngày liền 4 ngày trước khi thắt môn vị.

Kết quả chỉ số loét ở lô chứng là 7,1; lô thuốc là 2,66, loét giảm 62,5 %, thể tích dịch vị lô thuốc giảm 24,4 %, độ acid tự do giảm 26,4 %, độ acid toàn phần giảm 21,5 % [8]. Hoạt tính chống loét của lá Chè dây còn được đánh giá bằng thử nghiệm loét do indomethacin gây ra. Sau 12 giờ nhịn ăn, chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm, mỗi nhóm 10 con. Nhóm I (nhóm đối chứng) và nhóm II được uống nước cất với liều 10 mL/kg.

Nhóm III được điều trị bằng omeprazol (30 mg/kg). Nhóm IV và V được uống bột phun khô của lá Chè dây với liều lượng 500 và 1000 mg/kg. Tất cả chuột được uống hàng ngày trong 7 ngày và sau đó không ăn trong 24 giờ. Dùng indomethacin (40 mg/kg) cho tất cả các nhóm ngoại trừ nhóm đối chứng.

Kết quả cho thấy mức độ loét do indomethacin ở chuột nhóm IV và V giảm lần lượt là 41,46 % và 61,57 % so với nhóm II. Mức độ loét ở chuột nhóm III dùng omeprazole giảm 71,62 % [16]. Tác dụng giảm đau Tiến hành gây đau bằng tiêm trong màng bụng 0,1 mL/20 g chuột nhắt trắng dung dịch acid acetic 0,1 %. Liều flavonoid toàn phần tiêm dưới da là 1 g/kg.

Kết quả số cơn quặn đau tính cho từng 5 phút một ở lô thuốc giảm 50-80 % so với lỗ chứng [8]. Tác dụng kháng khuẩn Dùng phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch với 2 nồng độ 0,5 % và 1 % flavonoid toàn phần. Kết quả thuốc có tác dụng khá trên Bacillus subtilis ATCC 6633 (nồng độ 1 % gần bằng ampicilin 0,2 UI/mL), trên B.pumilus ATCC 8241 (mạnh hơn erythromycin 0,2 UI/mL), trên B. Tác dụng chống oxy hóa Phản ứng oxy hóa lipid màng tế bào gan chuột nhắt trắng sẽ sản sinh ra malonyl dialdehyd (MDA), chất này phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra một phức có màu.

Đo cường độ màu ở 532 nm sẽ biết MDA sinh ra nhiều hay ít. Các thuốc có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm hàm lượng MDA sinh ra giảm đi. Tiến hành thử cao khô toàn phần Chè dây và 2 flavonoid là myricetin và dihydromyncetin, thấy cả 3 chế phẩm đều làm giảm MDA trong tế bào và có tác dụng chống oxy hóa khá [8], [3]. Ngoài ra kết quả của nghiên cứu tiến hành để khảo sát hoạt động dọn gốc 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) của 5 hợp chất flavonoid có trong lá Chè dây được thể hiện trong bảng 1.

Hoạt tính chống oxy hóa của 5 hợp chất flavonoid có trong lá Chè dây Phần trăm hấp thụ DPPH Nồng độ (µM) 5 10 25 50 100 SC₅₀ Chất (µM/mL) 25,66 ± 40,80 ± 50,72 ± 65,73 ± 81,20 ± 19,52 ± Acid ascorbic 0,70 1,65 1,30 0,68 0,82 0,70 26,45 ± 41,27 ± 52,91 ± 65,08 ± 76,72 ± 19,64 ± Myricitrin 1.