MỞ ĐẦU Protein tái tổ hợp ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực sản xuất và trong nghiên cứu khoa học…Việc nghiên cứu phát triển các loại protein mới hay tìm cách nâng cao năng xuất biểu hiện của một hệ thống vật chủ từ lâu đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một sản phẩm protein tái tổ hợp mới phụ thuộc rất nhiều vào việc chọn vật chủ biểu hiện, hiện nay vẫn chƣa có một loại vật chủ phù hợp cho biểu hiện mọi loại protein nên trƣớc khi bắt đầu sản xuất ở mức độ công nghiệp chúng ta phải lựa chọn một hệ thống biểu hiện phù hợp. Có rất nhiều hệ thống biểu hiện đƣợc thƣơng mại hóa để biểu hiện protein tái tổ hợp nhƣ sử dụng sinh vật nhân sơ nhƣ E.coli, Bacillus… hay sinh vật nhân chuẩn nhƣ Nấm men Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris … hay các tế bào bậc cao nhƣ tế bào côn trùng hay tế bào động vật [3]. pastoris đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu biểu hiện gen ngoại lai, đến nay đã có hơn 200 loại protein đƣợc biểu hiện trong P.
Với chủng nấm men này, nhiều protein ngoại lai đƣợc tạo ra với hàm lƣợng lớn có thể đạt trên 10g/l, tuy nhiên một số protein lại đƣợc biểu hiện ở mức độ thấp (dƣới 1 mg/l), hoặc không xác định đƣợc. Để nâng cao khả năng biểu hiện của protein, một số phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng nhƣ: thay thế mã bộ ba cho phù hợp, biểu hiện đồng thời với chaperone hoặc với các protein khác, gây đột biến một số gen của chủng biểu hiện tối ƣu điều kiện nuôi cấy … Tuy nhiên không phải tất cả các trƣờng hợp đều thành công do những hiểu biết về di truyền phân tử và quá trình lý hóa trong chủng nấm men này vẫn còn hạn chế. Những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome của chủng P. pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng YEAST_2 array, bao gồ m khoảng 12.000 bô ̣ mẫu dò đă ̣c hiê ̣u cho các gen trong hê ̣ genome của S.
cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe cho thấy có 6 gene có sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gene mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1 [15]. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com GeneMF(ALPHA)1 mã hóa cho α-factor có vai trò trong sinh sản của nấm men. Gene(MF(ALPHA)1 không có mặt trong chủng P. pastoris gốc ban đầu, nhƣng trong vector biểu hiện pPIC9, đƣợc đƣa vào các chủng nấm men P.
pastoris trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp. Cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào thông báo về mối liên hệ giữa sự biểu hiện của gen ngoại lai và gene(MF(ALPHA)1 trong các hệ biểu hiện. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gene(MF(ALPHA)1 trong các chủng nghiên cứu sẽ đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật Real-time PCR với mồi đặc hiệu. Đây là phƣơng pháp thông dụng nhất hiện nay đƣợc sử dụng để khẳng định lại kết quả microarray.
Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá sự biểu hiện của gen sẽ có độ nhạy, độ chính xác lớn hơn và có thể thực hiện với số lƣợng mẫu lớn hơn để đánh giá sự biểu hiện của gene(MF(ALPHA)1 từ đó có những định hƣớng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao mức độ biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh amylase và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR” Công việc đƣợc tiến hành tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 1.Đặc điểm hệ biểu hiệnP. pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae sinh vật nhân chuẩn, có khả năng chuyển hóa methanol. Nấm men này là sinh vật đơn bào, tế bào có dạng hình elip hoặc hình cầu và sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và sinh sản hữu tính bằng hình thức tiếp hợp (Hình 1.1: Hình thái của nấm men P. pastoris[44] Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P.
pastoris đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430, và có thể đƣợc chia thành: các chủng dại (X-33, Y- 114430); các chủng có quá trình đột biến làm khuyết histidinol dehydrogenase (GS115); các chủng có đột biến gây mất các gene liên quan tới quá trình sử dụng methanol (KM71, MC 100-3); các chủng khuyết protease (SMD1163, SMD1165, SMD1168) [19]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1: Các chủng biểu hiệnP. Pastoris Tên chủng Kiểu gen Kiểu hình + X-33 Chủng dại Mut GS115 His4 Mut+His- KM71H His4 arg4 aox1Δ::AGR4 Muts His- GS115/Albumin His4 Muts His4 ar4g aox1Δ::SAGR4 MC100-3 Mut-His- aox2Δ::Phis4 SMD1168 Pre4Δ his4 Mut+His- khuyết protease SMD1165 Prb 1 his4 Mut+His- khuyết protease Hầu hết các chủng mang đột biến ở genedehydrogenase histidinol (his4) để cho phép lựa chọn các vector biểu hiện chứa his4 khi biến nạp. khi DNA plasmid đƣợc biến nạp vào nấm men, ta thƣờng nhận đƣợc các chủng tái tổ hợp thƣờng có ba kiểu hình: Mut+, Muts, Mut-[10, 12].
Chủng có kiểu hình Mut+ phát triển tốt trong môi trƣờng chứa methanol nhƣ chủng dại (X-33 và GS115). Chủng bị đột biến mất geneAOX1 có kiểu hình Muts, còn chủng bị đột biến mất cả hai geneAOX có kiểu hình Mut-, các chủng này sinh trƣởng chậm trong môi trƣờng có methanol. Ở chủng KM71H (his4 arg4 aox1Δ::AGR4) phần lớn gen AOX1 bị loại bỏ và thay bởi geneAGR4 của S. cerevisiae, nên phải dựa vào gen AOX2 để tạo enzyme AOX do đó tốc độ sinh trƣởng trong methanol chậm.
Chủng MC100-3 (his4 arg4 aox1Δ:: SAGR4 aox2Δ::Phis4) có kiểu hình Mut-, bị loại bỏ cả hai gen AOX và thế bởi geneAGR4 và genePhis4. Chủng này không thể sinh trƣởng trong môi trƣờng có methanol. Tất cả các chủng, ngay cả chủng đột biến Mut-, đều có khả năng biểu hiện tốt qua promoter AOX1. Một số chủng có kiểu hình khuyết protease nhƣ: SMD1163, SMD1165 và SMD1168, có khả năng hạn chế sự gia tăng của protease một yếu tố quan trọng làm mất tính ổn định và giảm tiết protein ngoại lai, đặc biệt là trong môi trƣờng lên men có mật độ tế bào cao, nên thƣờng đƣợc dùng để biểu hiện các protein ngoại lai.
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện P. coli đã đƣợc sử dụng nhƣ vật chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp từ rất sớm, tuy nhiên vì E. coli là sinh vật nhân sơ nên không có khả năng thực hiện việc cải biến sau dịch mã, nên loại protein đƣợc biểu hiện bị giới hạn, đặc biệt là protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn [18].
Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong E. coli phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm cấu trúc của protein muốn biểu hiện. Khi protein muốn biểu hiện ở dạng tan nếu việc tạo cấu trúc bậc cao bị lỗi sẽ dẫn tới việc tạo thành các thể vùi nên yêu cầu có bƣớc làm tan và tái gấp nếp để có protein có đúng cấu trúc mong muốn tuy nhiên việc này không hề dễ dàng, tiêu tốn nhiều thời gian, dẫn tới việc giảm nồng độ sản phẩm và tăng giá thành biểu hiện. coli thƣờng không phù hợp cho những nghiên cứu biểu hiện protein có cầu nối disulphide cao hoặc những protein yêu cầu có sự cải biến sau dịch mã nhƣ: glycosyl, phosphoryl hóa, lipid hóa, tạo cầu disulphide, sunfat hóa… Do đó, protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ E.
coli có thể bị thay đổi chức năng. Trong trƣờng hợp đó những hệ thống biểu hiện eukaryote nhƣ S. pastoris… đƣợc ƣu tiên sử dụng[41]. Cereviasiaetuy có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã của eukaryote nhƣng thƣờng có sự glycosyl hóa quá mức với chiều dài chuỗi carbonhydrate gắn vào protein rất lớn từ 50-150 phân tử mannose.
Điều này làm tăng cao khối lƣợng phân tử của protein và đồng thời gây nên tính kháng nguyên ở các protein tái tổ hợp. Ngoài ra, quá trình N-glycosyl hóa ở S.cerevisiae luôn có chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc. Các liên kết này có tính kháng nguyên cao nên cũng góp phần làm tăng tính kháng nguyên của phân tử protein [34, 37]. pastoris có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trƣng củasinh vật nhân chuẩn nhƣ: xử lý các trình tự tín hiệu (gồm cả dạng pre và prepro), gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide, glycosyl hóa, phosphoryl hóa, acetyl hóa, sunfat hóa, và gắn gốc đƣờng ở đầu O và N.
góp phần làm tăng khả năng tan, ổn định về tính chất của protein và tạo nên các phân tử protein có hoạt tính sinh học. Bên cạnh 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đó Pichia cũng gắn các gốc đƣờng với số mannose ngắn hơn nhiều so với S. Ngoài ra quá trình N- glycosyl hóa ở P. pastoris thƣờng chỉ gắn chuỗi carbonhydrate với 8-14 phân tử mannose và không chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc, do vậy chúng không làm tăng tính kháng nguyên của các protein [34].
Đây là một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện nhân sơ không có đƣợc [24]. pastoris thƣờng đƣợc lựa chọn để biểu hiện các protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn. pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S. Với promoter mạnh nhƣ AOX1 hoặc GAPDH, lƣợng protein tạo ra từ P.
pastoris có thể tăng đến 30% tổng số protein tế bào[12]. Gene đƣợc điều khiển bởi các promoter này khi đƣợc kết hợp vào bộ gen của P. pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao với hàm lƣợng lên đến vài gram/L. Trong đó promoter AOX1 đƣợc đặc biệt quan tâm vì khả năng cảm ứng bằng methanol, thuận lợi trong việc kiểm soát biểu hiện của gene[4].
Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E. coli là IPTG. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, chi phí lên men thấp, không đòi hỏi các yếu tố tăng trƣởng hoặc các chất bổ sung vốn đắt tiền. Quá trình lên men có thể đƣợc thực hiện nhanh chóng đáp ứng các yêu cầu lên men, các thông số ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất cũng nhƣ hoạt tính protein nhƣ pH, độ thông khí, lƣợng CO2 có thể đƣợc kiểm soát.
Các hệ thống biểu hiện bậc cao thƣờng phải tiến hành nuôi cấy tế bào trên môi trƣờng đắt tiền, thƣờng mất nhiều thời gian và tốn kém, hơn nữa hiệu suất biểu hiện protein lại không cao. Cho đến nay, P. pastoris đã đƣợc sử đụng để biểu hiện hơn 200 protein tái tổ hợp khác nhau có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, thực vậtvà động vật, trong đó có protein của ngƣời.