Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation of the effect of some growth regulators on callogenesis and somatic embryogenesis of paramignya trimera oliv guillaum

Khóa luận đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình callogenesis và phôi sinh dưỡng của Paramignya trimera Oliv. Guillaum.

• Tác giả: Tran Nguyen Hai Tho
• Người hướng dẫn: Nguyen Vu Phong, A/Prof.
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo và phôi soma ở cây Paramignya trimera
• Loại tài liệu: undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• DECLARATION OF AUTHORSHIP
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: INTRODUCTION
• 1.1. Introduction of Paramignya trimera (Oliv.)
• 1.2. Morphological characteristic
• 1.3. Distribution
• 1.4. The medicinal value of Paramignya trimera
• 2. CHƯƠNG 2: MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Places and duration for conducting experiments
• 2.2. Equipment and tool
• 2.3. Sterilize the Paramignya trimera seed explant
• 2.4. Investigate the effects of explant type and concentration of NAA combined with BA on callus induction
• 2.5. Examination of somatic embryo induction
• 2.6. Observe anatomical morphology
• 3. CHƯƠNG 3: RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Efficacy of sterilizing P. trimera seed explants with Javel Solution
• 3.2. Influence of kinds of explants and NAA, BA concentrations on callus formation
• 3.3. Examination of somatic embryo induction from zygotic embryo
• 3.4. Investigating the effects of TDZ on somatic embryo induction
• 4. CHƯƠNG 4: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATION
• APPENDIX
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến mô sẹo

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo mô sẹo và phôi soma ở cây Paramignya trimera. Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của các loại PGR khác nhau đến quá trình này. Việc hiểu rõ về tác động của PGR sẽ giúp tối ưu hóa quy trình nhân giống và bảo tồn loài cây quý hiếm này.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây Paramignya trimera

Paramignya trimera là một loài cây thuộc họ Rutaceae, nổi bật với các thành phần hóa học quý giá. Cây có khả năng chống lại nhiều loại bệnh và có giá trị dược liệu cao.

1.2. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nông nghiệp

Chất điều hòa sinh trưởng giúp điều chỉnh sự phát triển của cây, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Việc áp dụng PGR trong nghiên cứu này sẽ mang lại những hiểu biết mới về quy trình nhân giống.

II. Thách thức trong quá trình tạo mô sẹo ở Paramignya trimera

Quá trình tạo mô sẹo ở cây Paramignya trimera gặp nhiều thách thức, bao gồm tỷ lệ sống sót thấp và khả năng tạo mô sẹo không đồng đều. Những yếu tố này ảnh hưởng đến hiệu quả của việc nhân giống in vitro.

2.1. Tỷ lệ sống sót của mẫu cấy

Tỷ lệ sống sót của mẫu cấy sau khi khử trùng bằng dung dịch Javel chỉ đạt 70%, điều này cho thấy cần cải thiện quy trình khử trùng để nâng cao hiệu quả.

2.2. Khả năng tạo mô sẹo từ các loại mẫu cấy khác nhau

Các loại mẫu cấy như phôi hợp tử và lá mam cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn so với các loại mẫu khác, điều này cần được nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình.

III. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của PGR đến mô sẹo

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp nuôi cấy mô tế bào để đánh giá ảnh hưởng của các loại PGR như NAA và BA đến quá trình tạo mô sẹo và phôi soma. Các thí nghiệm được thực hiện trên Woody Plant Medium (WPM) với các nồng độ khác nhau.

3.1. Quy trình nuôi cấy mô tế bào

Quy trình nuôi cấy mô tế bào bao gồm khử trùng mẫu cấy, nuôi cấy trên môi trường WPM và theo dõi sự phát triển của mô sẹo. Điều này giúp xác định nồng độ PGR tối ưu cho quá trình tạo mô.

3.2. Đánh giá hiệu quả của các loại PGR

Nghiên cứu cho thấy nồng độ 2.0 mg/l NAA và 0.2 mg/l BA mang lại tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất, đạt 86.75%. Điều này chứng tỏ tầm quan trọng của việc lựa chọn đúng loại PGR.

IV. Kết quả nghiên cứu về phôi soma ở Paramignya trimera

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát triển phôi soma cao nhất đạt 88.89% khi nuôi cấy mô sẹo lá non trên WPM chứa TDZ. Tuy nhiên, nồng độ TDZ cao hơn dẫn đến tỷ lệ phôi phát triển bất thường tăng cao.

4.1. Tỷ lệ phát triển phôi từ mô sẹo

Mô sẹo lá non cho tỷ lệ phát triển phôi cao nhất, cho thấy khả năng tạo phôi tốt từ mô sẹo này. Điều này mở ra hướng đi mới cho việc nhân giống cây Paramignya trimera.

4.2. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến phôi soma

Nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ TDZ cao hơn 0.3 mg/L dẫn đến tỷ lệ phôi bất thường tăng cao, điều này cần được xem xét kỹ lưỡng trong các nghiên cứu tiếp theo.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong bảo tồn cây Paramignya trimera

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về quy trình tạo mô sẹo và phôi soma mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển giống cây quý hiếm này. Việc áp dụng các phương pháp in vitro sẽ giúp tăng cường nguồn gen và bảo tồn loài.

5.1. Tầm quan trọng của bảo tồn giống cây

Bảo tồn giống cây Paramignya trimera là cần thiết để duy trì nguồn gen và phát triển dược liệu. Việc nhân giống in vitro sẽ giúp tăng cường số lượng cây trồng.

5.2. Ứng dụng trong ngành dược phẩm

Nghiên cứu này có thể cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành dược phẩm, giúp sản xuất các sản phẩm từ cây Paramignya trimera với chất lượng cao và ổn định.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo mô sẹo và phôi soma ở cây Paramignya trimera. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc bảo tồn và phát triển loài cây này.

6.1. Tóm tắt kết quả chính

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ PGR tối ưu có thể nâng cao hiệu quả tạo mô sẹo và phôi soma, từ đó góp phần vào việc bảo tồn loài cây quý hiếm này.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các loại PGR khác và điều kiện nuôi cấy để tối ưu hóa quy trình nhân giống cây Paramignya trimera.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY- HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATION OF THE EFFECT OF SOME GROWTH REGULATORS ON CALLOGENESIS AND SOMATIC EMBRYOGENESIS OF Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum Major : BIOTECHNOLOGY Name : TRAN NGUYEN HAI THO Student’s ID : 19126171 School year : 2019-2023 Thu Duc City, 03/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY- HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS EVALUATION OF THE EFFECT OF SOME GROWTH REGULATORS ON CALLOGENESIS AND SOMATIC EMBRYOGENESIS OF Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum Advisors Student Nguyen Vu Phong, A/Prof. Tran Nguyen Hai Tho Ha Thi Truc Mai, M. Thu Duc City, 03/2024 ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my special thanks and gratitude to my supervisor, Nguyen Vu Phong, A/Prof., and Ha Thi Truc Mai, M., who allowed me to do this thesis, which also helped me in doing a lot of experiments and thesis. They provided me with the tools that I needed to choose the right direction and complete my thesis.

I am really thankful to them. Secondly, I would like to thank the teachers of the Faculty of Biological Sciences at Nong Lam University, my friends from the BIP teams, and especially Ms. Dang Huynh Thuy Vy and Ms. Cao Thi Cam Huong for their help, suggestions, and encouragement during the time I was working on the thesis.

Besides, I would like to thank my parents for their wise counsel and sympathetic ears. You are always there for me. Finally, I would like to sincerely thank everyone for the best things they have given me. You are always there for me.

DECLARATION OF AUTHORSHIP My name is Tran Nguyen Hai Tho, ID: 19126171, Class: DH19SHB of Biotechnology major at Nong Lam University in Ho Chi Minh City. I declare: This is a graduation thesis written directly by myself; the data and information in the study are completely honest and objective. I am fully responsible to the board for these commitments. Ho Chi Minh City, 31th March 2024 Student Tran Nguyen Hai Tho 1 ABSTRACT The study conducted at Nong Lam University’s Laboratory of Plant Integrated Biology focused on the influence of plant growth regulators (PGRs) on callogenesis and somatic embryogenesis in Paramignya trimera.

Over the course of the study from March to December 2023, the aim was to identify the optimal type and concentration of PGRs for effective callus formation and embryo development in this plant species. Initial experiments involved sterilizing seed explants with Javel solution and using different types of explants such as zygotic embryos, cotyledons, hypocotyls, and radicles. These explants were cultured on Woody Plant Medium (WPM) supplemented with various combinations of NAA and BA for callus induction, and later, for somatic embryo induction, explants were transferred to WPM with TDZ. The results highlighted that sterilization with 20% Javel solution for 20 minutes provided a 70% survival rate and a 44.79% germination rate for seeds.

Callus induction was most successful with zygotic embryo and cotyledon explants, showing an 86.75% formation rate, respectively, when cultured on WPM with 2.0 mg/l NAA and 0. These calluses were nodular, firm, and capable of embryo generation. Additionally, the study noted the formation of adventitious roots in some explants.For somatic embryo development, the highest success rate (88.89%) was achieved with young leaf callus cultured on WPM containing 0. However, higher concentrations of TDZ (0.3 mg/L) resulted in a higher rate of abnormal embryo development (83.

This research provides valuable insights into the conditions necessary for effective somatic embryogenesis and callogenesis in Paramignya trimera, potentially contributing to the conservation and propagation efforts for this species. Keywords: Callogenesis, Paramignya trimera, plant growth regulators, somatic embryogenesis, tissue culture. 1H TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học tổng hợp thực vật của Đại học Nông Lâm tập trung vào ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) đến quá trình hình thành mô sẹo và tạo phôi soma ở cây Paramignya trimera. Trong suốt quá trình nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 12 năm 2023, mục đích là xác định loại và nồng độ PGR tối ưu để hình thành mô sẹo và phát triển phôi hiệu quả ở cây Paramignya trimera.

Các thí nghiệm ban đầu liên quan đến việc khử trùng mẫu hạt giống bằng dung dịch Javel và sử dụng các loại mẫu cấy khác nhau như phôi hợp tử, lá mam, trụ dưới lá mam và rễ mầm. Những mẫu này được nuôi cấy trên Woody Plant Medium (WPM) được bổ sung nhiều sự kết hợp khác nhau của NAA va BA dé tạo mô sẹo, và sau đó dé tao phôi soma, các mẫu được chuyền sang WPM bổ sung TDZ. Kết quả nhân mạnh rằng việc khử trùng bằng dung địch Javel 20% trong 20 phút mang lại tỷ lệ sống sạch là 70% và tỷ lệ nảy mầm của hạt là 44,79%. Việc tạo mô sẹo thành công nhất với các mẫu phôi hợp tử và lá mam cho thấy tỷ lệ hình thành lần lượt là 86,61% và 93,75% khi nuôi cấy trên WPM với 2,0 mg/l NAA va 0,2 mg/l BA.

Những mô seo này có dang nốt san, chắc và có kha năng tạo phôi. Ngoài ra, nghiên cứu còn ghi nhận sự hình thành rễ bat định ở một số mẫu mô sẹo. Ở nghiên cứu phôi soma, tỷ lệ phát triển phôi hình cầu cao nhất (88,89%) đạt được với mô sẹo lá non được nuôi cay trên WPM chứa 0,07 mg/L TDZ. Tuy nhiên, nồng độ TDZ cao hơn (0,3 mg/L) dan đến tỷ lệ phôi phát triển bat thường cao hơn (83,33%).

Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết có giá trị về các điều kiện cần thiết cho quá trình tạo phôi soma và hình thành mô sẹo hiệu quả ở Paramignya Trimera, có khả năng góp phần vào nỗ lực bảo tồn và nhân giống loài này. Từ khóa: Hình thành mô sẹo, Paramignya Trimera, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tạo phôi soma, nuôi cây mô. 1V CONTENT Trang ACKNOWLEDGEMENT.-- ----- - SH HH HH ng 1 DECLARATION OF AUTHORSHIP.22 re ii ASTER SPR OP ors ese EEE sree ees se en see ee 11 T KỆ TẾ Tu#n ga tiötraGarhditGtrötiiritGlsSuBdgSSGtrfijiytqtdiaudaGsingSaaggpiosasgl iv COIN TEE IN secondo ci ease eg ren Heiter etna V LIST OF ABBREVIATIONS. ege vii IIRSU9)59.

vill LIST OF FIGURES successes ee caer RS ix CHAPTER. INTRODUCTION sáng 4216 16660153638481801610350395015500440001484158 1 I1 (0430 c0ì0uï.6ä§S€äTCH (öD]EGLMWŠ sissssnsiesisiatti0/08016 050801081685638133E36305E8S9SS2TG2RGE08⁄EGGISSBSSUG00383gH09812G31613888408 2 1. Reasearch vo on. Introduction of Paramignya trimera (Oliv.

Morphological characteristic ;:‹‹:ses: các: x54605666115015112 61611 1361535166555 50 18535 E8051 E58 14440933464 3 2) 23. OTS OU Of ayer ares are ee 3 2154, The medicinal value of Po DHGT(iccstsssesssgiotkosccljSSLSEQELGESESGSGSHRSGSLSB.sẻ 4 227/21512119)01819118109/S51138191172)6019315-TSTTSSẸSẼSSC Cố ố ốc ốc 6 P60 Su. scicsssssnsssncsemssenenanaimninns aad aan amen aaaR RAE AE ARNE 8 2.2, Staves of callus developinettl:. Factors a[feetinp:GalÏUSsxesscsssssixecsssssseietsec,S1455086105985303Đ/3S835548110:38530880803g035% 9 2.

Somatic embryos Su. Somatic CMbIyoOs Số. SOMALUC €HIBTVG0GI16SIS TH PLANE ws ssses ovesescovencernesseesnsesssussnenssessonnssrsenenverssesversanners lãi 2. Factors affecting somatic ermryOS.-- --- --- 2+5 * 22+ 2E 22x22 2 tr tr ưet 11 2.

Application of somatic embryogenesis.ccceeceeecceeeceeteceeseceeceeeeceseeeeeeaees 13 Vv PA»Nhì 0)(00(2-. In vitro Studies ON 060:x/,/2,. Studies on the callus formation of P. Studies on the somatic embryogenesis formation from the callus of P.

MATERIALS AND METHODS. Places and duration for conducting eXperiImenifS. Equipment and tool. MIA(GTHBÌSs:ssc6cáxssco na sg51616011210581338EHXEESAELSSSLRSEESSEECSESEENSEXEXREESSLESSXSSEEEEHSEESSELRXSEESSSRSSEEASESE 17 2;3» L; BlØlop16al:Trial6TiaÌSeesesessasaeseseeibsbeisusssllikl3eixessssereitEoksSilSÐsuEtieEgotssedficgptsrfehgiEEk 17 B28 MS GIT -zszz>szxszszss>ssatbsisfc4atEio0i482kiogadgb3ig:BmSGiGE2GGSSE0/5.Gg880đ01cb0đi019/98/09930E0/SS0U2IERHX8 17 Ea.

Sterilize the Ð trimera seed explant. ce ceccecee cece eee eeceeeescesceeeeseesenseneenes 18 3. Investigate the effects of explant type and concentration of NAA combined with BA Oi CALS INCU CHOP seeeaseseesikieinbdeiiiaiadabaduaslickikeoagsulokeagsualclsginbudsiuodideskung ii grcgudzcianrbk 19 3. Examination of somatic embryo 1nducf1oni.

-------- 52552 +52 =+sc+sc+sczsccxe 20 3. Observe anatomical morphOÌOV. ata) PROCESSING cs ong ti660185G251G0050G30IA SLãNt8QGfStR0bsifSgGRdlcSgtrkatiBsgstditS5iGaiv3800%/G0038G76/62 5458. RESULTS AND DISCUSSION sissssssssesssssassssssonsssrsssseacxvoeanssnassnsvezneesenes 22 4.1 Efficacy of sterilizing P.

trimera seed explants with Javel Solution. Influence of kinds of explants and NAA, BA concentrations on callus formation 23 4. Examination of somatic embryo induction. Examination of somatic embryo induction from zygotic embryo.

Investigating the effects of TDZ on somatic embryo Induction.-- -- 31 AAs DISSCUSSION se. Efficacy of sterilizing Ð trimera seed explants with Javel Solution. Influence of explant types and NAA, BA concentrations on callus formation. Examination of somatic embryo induction.

CONCLUSIONS AND RECOMMENDATION. ốc CC 40 APPENDUX: sung ngon 1201010080052 GI5GIS4GSESBEENSHBJESSNGHESEĐGĐDSGBESOONGEHUSMSNERNBSHSSSSỹĐE33Ngg8033cGagn8a8s81 44 LIST OF ABBREVIATIONS BA Benzyl andenine PIB Integrative Plant Biology ME Malt extract MS Murashige and Skoog, 1962 NAA a-Naphathalene acetic acid PGRs Plant growth regulators TDZ Thidiazuron WPM Woody plant medium, 1980 VI LIST OE TABLES Trang Table 2. Some disinfectants are used in plant tissue cuÏture. Time and rate of Javel solution used in treatmens.

The rate of callus induction due to the effect of NAA combined with BA 19 Table 4. Efficacy of sterilizing xao tam phan seed explants with Javel Solution. Influence of types of explants and NAA, BA concentrations on callus DTV H[GULOTÏL <i-c<62621862101E066n20bit0izgi2gi2iSsiilielidccikcgiokgRuiocsjgkrbidgaosptkcloiatiisaoosizlistioekilietktegtgilssBisskgaexidbrigssiobsbi 24 Table 4. Callus morphology after 4 weeks and 8 weeks of culture.

(Next) Callus morphology after 4 weeks and 8 weeks of culture. Effect of explant type and concentration of NAA and BA on adventitious root formation from callus after 4, 6, and 8 weeks of cuÌfure. Percentage of explants forming globular-shaped embryos after 4 and 8 weeks OR GIEUEGGBHBSEHIGGIEGHRISILS.SSHIGGGBDNHSGHIENESRSSRIEBGGS3880030G03803GGGBR/013H888 52 Table 4. Percentage of explants with abnormal embryo formation after 4 and 8 weeks 0i eee ecccceeeeecccccccceceeeceececsessseececececcceceseesssssssceceeccececersrsssssssececeeeeeeeeesetenees 34 Vill LIST OF FIGURES Trang Figure 2.

Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum plant in Mr. Van Khon Nguyen’s garden Trang Bom — Dong Nai. Ð trimera fruits and seeds. Some explant conditions after sferi]1zafIon.

Callus induction from 4 types of explants after 8 weeks on WPM+2 mg/L TẠA +02 mig Te BA re It gc. sicirstr sinner wa tection csneta ndean te tenteiceem ten eedneauae ibaa tices 25 Figure 4. Callus formed from the explants after 8 weeks. Adventitious roots formed from callus in all types of explants on WPM + 2 mg/L NAA + 0.2 mg/L BA after 8 weeks of culture.

Organogenesis from zygotic eMbryo6.:ecceeeeeeee eee eeeeeeeeeeeeeeeenees 31 Figure 4. Embryos form from the callus after 8 weeks of culture. Somatic embryos were formed after 18 weeks of culture in treatment S1 (WPM + 0. Somatic embryos were formed after 10 weeks of culture on treatment S4 WPM + 0.

The circular cavity positions are the positions where the explant is under different objective stereoscopic TmICTOSCOD€S. Embryo explants developed buds after 22 weeks of culture in treatment S1 WPM + 0. Embryo explants were formed after 22 weeks of culture in treatment S1 MW EM + 0:07 ie Me, TIDbác cocz sis econ te vai tastrvr i nice ch a wo do bbb aa tet 36 1X CHAPTER 1. trimera is a plant belonging to the genus Paramignya, family Rutaceae, with the scientific name Paramignya trimera (Oliv.

In oriental medicine, it is often called "Don Diep Dang Thich”. In the human world, it is called the "re moi" plant or the "than xa" plant. Ð trimera has high medicinal value and is an important medicine in traditional medicine because it contains groups of rare substances such as coumarin triterpenoids, flavonoids, saponins, alkaloids, and glycoside derivatives. These groups of substances have been shown to have anti-inflammatory effects, treat liver disease and diabetes, and help repel many cancer cell lines.

It is because of the excellent effect of P. trimera in the treatment and reverse of cancer that, in recent years, the price of Ð trimera has been inflated. Therefore, this medicinal plant is being hunted by people and exploited to the point of exhaustion to make medicine, so its distribution range is increasingly narrowed and in danger of extinction in the wild if no measures are taken for effective conservation. Therefore, in the current market of P.