Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum), thuộc chi Paramignya, họ Cam quýt (Rutaceae), còn được biết đến trong y học cổ truyền với các tên gọi như "Đơn diệp đằng thích", cây "rễ mọi" hay cây "thần xạ". Loài thực vật này chứa các nhóm hoạt chất thứ cấp quý như coumarin, triterpenoid, flavonoid, saponin, alkaloid và dẫn xuất glycoside. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh dịch chiết từ rễ và lá Xáo tam phân có hoạt tính kháng viêm, bảo vệ gan (giảm nồng độ enzyme AST, ALT và hạn chế tổn thương gan gây bởi Paracetamol trên mô hình chuột), hỗ trợ điều trị đái tháo đường type 2 (ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase với giá trị $\text{IC}_{50} = 36{,}6\ \mu\text{g/mL}$), kháng khuẩn (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella), và gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư (như HepG2, MCF-7, HT29, A2780, H460, A431, Du145, BE2-C, U87, SJ-G2, SMA).

Do giá trị dược liệu cao, nguồn dược liệu Xáo tam phân tự nhiên bị khai thác cạn kiệt, phạm vi phân bố tự nhiên (chủ yếu tại vùng đồi núi khô cằn tỉnh Khánh Hòa như Hòn Hèo, Ninh Hòa, Cam Ranh, Vạn Ninh và một số khu vực lân cận) bị thu hẹp nghiêm trọng, đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng. Các phương pháp nhân giống truyền thống (giâm cành, chiết cành, ghép) gặp nhiều rào cản kỹ thuật: tốc độ sinh trưởng chậm, khó ra rễ, tỷ lệ chết do thối thân dao động từ 2% đến 11%, khó thuần hóa khi đưa từ rừng tự nhiên về vườn trồng và đòi hỏi lượng lớn vật liệu khởi đầu. Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, cụ thể là tạo mô sẹo (callogenesis) và phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), là giải pháp cần thiết nhằm nhân nhanh số lượng lớn cây giống đồng nhất về di truyền, sạch bệnh, phục vụ bảo tồn và sản xuất sinh khối dược liệu.

Mục tiêu nghiên cứu:

  • Xác định loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Plant Growth Regulators - PGRs) thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma ở cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum).

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát hiệu quả khử trùng mẫu hạt giống cây Xáo tam phân bằng dung dịch Javel (Sodium hypochlorite - $\text{NaClO}$) ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau.
  2. Đánh giá ảnh hưởng của auxin $\alpha$-Naphthalene acetic acid (NAA) kết hợp với cytokinin Benzyladenine (BA) đến khả năng tạo mô sẹo từ các loại mẫu cấy: phôi hợp tử (zygotic embryo), lá mầm (cotyledon), trụ dưới lá mầm (hypocotyl) và rễ mầm (radicle).
  3. Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng (BA kết hợp chiết xuất mạch nha ME, sucrose; và Thidiazuron - TDZ) lên sự hình thành và phát triển của phôi soma trực tiếp từ phôi hợp tử và gián tiếp từ mô sẹo lá non.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Quả, hạt giống, phôi hợp tử, các bộ phận của cây mầm in vitro (lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm) và mô sẹo từ lá non cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) 1 năm tuổi thu thập tại Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Sinh học tổng hợp thực vật (PIB), Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 03/2023 đến tháng 12/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

  • Tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency): Tế bào soma thực vật giữ nguyên hệ gen và có khả năng khử biệt hóa (dedifferentiation) trở về trạng thái mô phân sinh để tạo mô sẹo, sau đó tái biệt hóa (redifferentiation) thành các cơ quan hoặc phát triển thành phôi soma lưỡng cực (gồm cực chồi và cực rễ riêng biệt).
  • Cơ chế khử trùng bằng $\text{NaClO}$: Trong môi trường nước, $\text{NaClO}$ tạo thành acid hypochlorous ($\text{HClO}$) và ion $\text{OCl}^-$. $\text{HClO}$ không mang điện tích có khả năng thấm qua màng tế bào vi sinh vật, oxy hóa enzyme hô hấp tế bào (cytochrome), phá hủy nhóm sulfhydryl ($\text{-SH}$) và oxy hóa protein, vô hoạt vi sinh vật bám nhiễm trên bề mặt mẫu.
  • Vai trò của PGRs: Tỷ lệ Auxin/Cytokinin chi phối hình thái học in vitro. Auxin (NAA) kích thích phân chia tế bào và cảm ứng mô sẹo, rễ; Cytokinin (BA, TDZ) kích thích phân chia nhân và biệt hóa chồi, cảm ứng tạo phôi soma. TDZ (Thidiazuron - nhóm phenylurea) thể hiện hoạt tính cytokinin mạnh, thúc đẩy các khối tiền phôi (pre-embryonic masses) chuyển hóa thành phôi soma hình cầu.
  • Hiện tượng đa phôi (polyembryony) và phát sinh phôi bất thường ở Rutaceae: Quá trình phát sinh phôi soma ở các loài họ Cam quýt thường đi qua các pha hình thái: hình cầu (globular), hình tim (heart-shaped), hình ngư lôi (torpedo) và phát triển chồi mầm; tuy nhiên, nồng độ cytokinin/TDZ cao có thể làm rối loạn vận chuyển phân cực auxin, dẫn đến phôi dị dạng hoặc dính chùm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Bố trí thí nghiệm: Bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design - CRD).
    • Thí nghiệm khử trùng hạt: 4 nghiệm thức (nồng độ Javel 20% và 25%; thời gian 15 phút và 20 phút), mỗi nghiệm thức 10 bình (2 mẫu/bình), lặp lại 4 lần. Hạt được rửa sạch vỏ quả, ngâm xà phòng loãng 5% (15 phút), xử lý thuốc trừ nấm Mancozeb 10 phút, cồn 70° (30 giây), dung dịch Javel + Tween 20 theo nghiệm thức, tráng nước cất vô trùng 3 lần và xử lý kháng sinh Tetracycline + Ampicillin (tỷ lệ 1:1) trong 30 phút.
    • Thí nghiệm cảm ứng mô sẹo: 12 nghiệm thức kết hợp 4 loại mẫu cấy (phôi hợp tử, lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm) với 3 tổ hợp PGRs trên nền môi trường WPM (Woody Plant Medium) điều chỉnh $\text{pH} = 5{,}1$: đối chứng (0 mg/L NAA + 0 mg/L BA), 1 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA, và 2 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA. Thí nghiệm lặp lại 2 lần, mỗi lần 2 bình, mỗi bình 4 mẫu cấy.
    • Thí nghiệm cảm ứng phôi soma từ phôi hợp tử: Nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 50 g/L (5%) sucrose, 500 mg/L Malt Extract (ME) và 2 mg/L BA, bố trí 5 đĩa nuôi cấy (4 mẫu/đĩa).
    • Thí nghiệm cảm ứng phôi soma từ mô sẹo lá non: Sử dụng mô sẹo thu nhận từ lá non nuôi cấy 8 tuần trên WPM + 2 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA, chuyển sang môi trường WPM chứa các nồng độ TDZ khác nhau (0,07; 0,1; 0,2; 0,3 mg/L). Bố trí 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi đĩa 3 mẫu (tổng cộng 36 mẫu).
  • Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi $25 \pm 2^\circ\text{C}$, độ ẩm $60 - 65%$.
  • Phương pháp giải phẫu hình thái mô học: Mẫu phôi ở các giai đoạn phát triển được cắt lát mỏng, ngâm dung dịch Javel 5% (17 phút) để tẩy sắc tố, trung hòa bằng acid acetic 1% (2 phút), rửa nước cất, nhuộm xanh methylene (5-10 giây) và nhuộm acetocarmine (15-30 phút, hơ nóng nhẹ trên đèn cồn), quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học (vật kính 4X, 10X, 40X) và kính hiển vi soi nổi (1X, 2X, 3.2X).
  • Xử lý số liệu: Số liệu tỷ lệ phần trăm (%) được chuyển đổi theo công thức $y = \arcsin(\sqrt{x/100}) \times 180/\pi$ trước khi phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh trung bình nghiệm thức theo kiểm định Tukey's HSD ($p < 0{,}05$ và $p < 0{,}01$) trên phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu (Introduction)

Chương này phân tích tổng quan về vị trí phân loại, giá trị kinh tế và dược liệu của cây Xáo tam phân (Paramignya trimera). Tác giả nêu bật thực trạng cạn kiệt nguồn gen ngoài tự nhiên, các khó khăn của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (tỷ lệ thối cành 2-11%, hệ số nhân thấp) và sự cần thiết của việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro thông qua cảm ứng mô sẹo và phát sinh phôi soma. Chương 1 xác định rõ mục tiêu tổng quát, các nhiệm vụ cụ thể và phạm vi của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Đặc điểm thực vật học, phân bố và giá trị hóa dược: Mô tả chi tiết hình thái thân leo có gai, cấu trúc lá, hoa, quả, rễ chứa tinh dầu mùi sâm; tổng hợp các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ, thân, lá Xáo tam phân trên các dòng tế bào ung thư và mô hình động vật.
  • Kỹ thuật khử trùng mẫu thực vật: Phân tích cơ chế và hiệu quả của các chất khử trùng thông dụng (Canxi hypochlorite, Natri hypochlorite, $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{HgCl}_2$), nhấn mạnh xu hướng thay thế $\text{HgCl}_2$ độc hại bằng Javel ($\text{NaClO}$) thân thiện với môi trường và an toàn cho người thực nghiệm.
  • Quá trình phát sinh mô sẹo (Callogenesis): Bản chất tế bào mô sẹo (mô sẹo xốp vs mô sẹo chắc, mô sẹo có sắc tố), ba con đường khử biệt hóa mô thực vật dưới tác động của auxin, và các yếu tố ảnh hưởng (loại mẫu cấy, độ tuổi mẫu, nồng độ auxin/cytokinin, môi trường khoáng MS, WPM, MT, điều kiện ánh sáng).
  • Quá trình phát sinh phôi soma (Somatic embryogenesis): Khái niệm phôi soma, hai con đường phát sinh trực tiếp và gián tiếp; tổng quan các công trình nghiên cứu trên chi Citrus và các nghiên cứu in vitro đã công bố trên cây Xáo tam phân (công trình của Phí Thị Cẩm Miện và cs., 2017; Trần Trung Hiếu và cs., 2017; Ngô Thị Xuyến và cs., 2018; Cao Thị Cẩm Hướng, 2022).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Trình bày chi tiết nguồn gốc vật liệu sinh học (hạt quả Xáo tam phân tại Đồng Nai), danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng (WPM, MS), trang thiết bị thí nghiệm và điều kiện phòng nuôi. Trình bày chi tiết quy trình khử trùng hạt bằng Javel, thiết kế các nghiệm thức cảm ứng tạo mô sẹo từ 4 loại mẫu cấy (phôi hợp tử, lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm) với NAA và BA, quy trình cảm ứng phôi soma trực tiếp từ phôi hợp tử và gián tiếp từ mô sẹo lá non bằng TDZ, cùng kỹ thuật làm tiêu bản vi phẫu giải phẫu và các công thức xử lý thống kê.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Trình bày và thảo luận toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:

  • Đánh giá hiệu quả khử trùng hạt giống: Phân tích tương quan giữa nồng độ Javel (20%, 25%) và thời gian xử lý (15, 20 phút) đến tỷ lệ nhiễm khuẩn, tỷ lệ mẫu sống sạch và tỷ lệ nảy mầm.
  • Ảnh hưởng của loại mẫu cấy và nồng độ NAA, BA đến sự tạo mô sẹo và rễ bất định: Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo sau 4, 6, 8 tuần; mô tả hình thái mô sẹo (màu vàng nhạt, cấu trúc sần sùi dạng nốt chắc, có tiềm năng sinh phôi); ghi nhận hiện tượng phát sinh rễ bất định từ mô sẹo lá mầm, trụ dưới lá mầm và rễ mầm.
  • Quá trình cảm ứng phôi soma: Khảo sát sự phân hóa của phôi hợp tử thành phôi hình cầu và chồi đa phôi trên môi trường WPM bổ sung 5% sucrose, 500 mg/L ME và 2 mg/L BA; đánh giá hiệu quả cảm ứng phôi soma từ mô sẹo lá non theo dải nồng độ TDZ (0,07 - 0,3 mg/L), phân tích hình thái tế bào học của phôi hình cầu, phôi hình tim và phôi dị dạng qua lát cắt vi phẫu hiển vi.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusions and Recommendations)

Tóm tắt các thông số tối ưu rút ra từ nghiên cứu: nồng độ Javel khử trùng tối ưu, tổ hợp PGRs tạo mô sẹo tốt nhất và nồng độ TDZ cảm ứng phôi soma cao nhất; đồng thời đưa ra các định hướng nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh hoàn chỉnh.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm chính

Bảng 1: Hiệu quả khử trùng mẫu hạt Xáo tam phân bằng dung dịch Javel

Nghiệm thức Nồng độ Javel (%) Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm khuẩn (%) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%) Tỷ lệ nảy mầm (%)
A1 20 15 46,25 48,75 37,50
A2 20 20 22,50 70,00 44,79
A3 25 15 28,75 63,75 30,00
A4 25 20 18,75 73,75 23,75

Bảng 2: Tỷ lệ tạo mô sẹo từ các loại mẫu cấy trên môi trường WPM sau 8 tuần

Loại mẫu cấy Đối chứng (0 mg/L NAA + 0 mg/L BA) 1,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA 2,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA
Phôi hợp tử 0,00% 50,00% 86,61% (75,00%)
Lá mầm 0,00% 62,50% 93,75%
Trụ dưới lá mầm 0,00% 62,50% 93,75%
Rễ mầm 0,00% 37,50% 56,25%

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến sự hình thành phôi hình cầu và phôi dị dạng từ mô sẹo lá non sau 8 tuần

Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/L) Tỷ lệ phôi hình cầu (%) Tỷ lệ phôi dị dạng (%)
S1 / E1 0,07 88,89% (88,78%) 22,22%
S2 / E2 0,10 72,22% 44,44%
S3 / E3 0,20 55,56% 66,67%
S4 / E4 0,30 38,89% 83,33% (83,22%)

Kết quả chi tiết và phát hiện khoa học

  1. Quy trình khử trùng hạt: Xử lý hạt bằng dung dịch Javel 20% trong 20 phút cho kết quả cân bằng tối ưu giữa việc kiểm soát tạp nhiễm (tỷ lệ nhiễm khuẩn giảm còn 22,50%) và duy trì sức sống của phôi hạt (tỷ lệ mẫu sống sạch đạt 70,00%, tỷ lệ nảy mầm đạt 44,79%). Việc nâng nồng độ Javel lên 25% tuy giảm tỷ lệ nhiễm nhưng làm tổn thương cấu trúc tế bào do tính oxy hóa mạnh, dẫn đến tỷ lệ nảy mầm suy giảm rõ rệt (còn 23,75%).
  2. Khả năng cảm ứng mô sẹo: Môi trường WPM bổ sung 2,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo cao nhất trên cả 4 loại mẫu cấy, đạt 93,75% ở lá mầm và trụ dưới lá mầm, 86,61% ở phôi hợp tử và 56,25% ở rễ mầm. Mẫu cấy ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung PGRs không hình thành mô sẹo và chết dần. Mô sẹo thu được có màu vàng nhạt đến trắng đục, kết cấu dạng nốt sần, chắc, đặc trưng của mô sẹo có tiềm năng sinh phôi soma.
  3. Hình thành rễ bất định: Môi trường chứa 2,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA kích thích hình thành rễ bất định trực tiếp từ mô sẹo lá mầm (86,61%), rễ mầm (55,00%) và trụ dưới lá mầm sau 8 tuần, trong khi mô sẹo từ phôi hợp tử không xuất hiện rễ bất định.
  4. Phát sinh phôi soma và giải phẫu mô học:
    • Cảm ứng trực tiếp từ phôi hợp tử trên môi trường WPM + 5% sucrose + 500 mg/L ME + 2 mg/L BA ghi nhận 2 hướng phát triển: hình thành phôi hình cầu sau 6-12 tuần hoặc phát triển thành cụm đa chồi mầm mang lá (do đặc tính đa phôi của loài).
    • Cảm ứng gián tiếp từ mô sẹo lá non: TDZ nồng độ thấp (0,07 mg/L) cho tỷ lệ tạo phôi hình cầu cao nhất (88,89%), phôi có màu xanh đặc trưng, cấu trúc tế bào đẳng kính, tế bào chất đậm đặc và nhân rõ ràng.
    • Khi tăng nồng độ TDZ lên 0,3 mg/L, tỷ lệ phôi dị dạng tăng vọt lên 83,33%. Quan sát giải phẫu cho thấy phôi dị dạng không hình thành vách ngăn tế bào hoàn chỉnh, phát triển thành các cụm phôi đa cực dính liền nhau; sau 22 tuần nuôi cấy, các phôi này có khả năng bật chồi con ở bề mặt tiếp xúc môi trường.

Đóng góp của đề tài

  • Xác lập thành công quy trình khử trùng mẫu hạt giống Xáo tam phân bằng dung dịch Javel ($\text{NaClO}$) thay thế hóa chất độc hại $\text{HgCl}_2$, đảm bảo an toàn lao động và bảo vệ môi trường.
  • Xác định được công thức môi trường tối ưu cho giai đoạn cảm ứng mô sẹo chắc sinh phôi (WPM + 2,0 mg/L NAA + 0,2 mg/L BA) và cảm ứng phôi soma hình cầu (WPM + 0,07 mg/L TDZ) từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây Xáo tam phân.
  • Cung cấp dẫn liệu giải phẫu học chi tiết về các giai đoạn phát triển phôi soma và hiện tượng phôi dị dạng ở loài Paramignya trimera.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ phôi phát triển bất thường (phôi dị dạng, dính chùm, đa cực) còn cao khi sử dụng TDZ ở nồng độ từ 0,1 mg/L đến 0,3 mg/L (tỷ lệ dị dạng từ 44,44% đến 83,33%).
  • Các phôi hình cầu cảm ứng từ phôi hợp tử sau 12 tuần chưa chuyển tiếp đồng loạt sang các giai đoạn hình thái tiếp theo (hình tim, hình ngư lôi).
  • Thí nghiệm mới dừng lại ở giai đoạn tạo phôi soma và bật chồi mầm từ phôi dị dạng sau 22 tuần, chưa theo dõi đến giai đoạn hoàn chỉnh cây con ra ngôi đất.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Khảo sát các dải nồng độ TDZ thấp hơn 0,07 mg/L hoặc thử nghiệm các loại cytokinin khác (BAP, Kinetin) kết hợp với điều chỉnh hàm lượng đường sucrose để hạn chế tỷ lệ phôi dị dạng.
  • Nghiên cứu môi trường kích thích phôi soma trưởng thành và nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh (môi trường khoáng không bổ sung PGRs hoặc bổ sung chất ức chế ethylene như STS - Silver thiosulfate).
  • Khảo sát khả năng bảo quản nguồn gen phôi soma và nhân sinh khối mô sẹo trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc để phục vụ chiết xuất hoạt chất thứ cấp.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Cán bộ nghiên cứu, giảng viên, học viên cao học và sinh viên các ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Dược học và Công nghệ Tế bào Thực vật.
  • Giá trị khoa học và ứng dụng:
    • Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn hóa về việc khử trùng hạt giống cây dược liệu thân gỗ bằng Javel.
    • Cung cấp dữ liệu định lượng chính xác về phản ứng tạo mô sẹo và phôi soma của các loại mô cấy khác nhau (phôi hợp tử, lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm, lá non) của cây Xáo tam phân dưới tác động của NAA, BA và TDZ.
    • Cung cấp phương pháp nhuộm vi phẫu giải phẫu (xanh methylene kết hợp acetocarmine) để kiểm tra cấu trúc mô học của phôi soma thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn dung dịch Javel (NaClO) thay vì Thủy ngân clorua ($\text{HgCl}_2$) để khử trùng hạt Xáo tam phân?

Trong các nghiên cứu trước đây (như Ngô Thị Xuyến và cs., 2018), $\text{HgCl}_2$ 0,1% được sử dụng phổ biến nhưng đây là hóa chất có độc tính rất cao, khó đào thải, gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe người thao tác và môi trường. Nghiên cứu này chứng minh dung dịch Javel ($\text{NaClO}$) nồng độ 20% trong 20 phút hoàn toàn có thể thay thế hiệu quả với tỷ lệ sống sạch đạt 70,00% và tỷ lệ nảy mầm 44,79%, giúp giảm thiểu rủi ro độc hại mà vẫn duy trì hiệu quả khử trùng cao.

2. Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nào cho hiệu quả tạo mô sẹo tốt nhất từ các loại mẫu cấy?

Tổ hợp môi trường WPM bổ sung 2,0 mg/L NAA kết hợp 0,2 mg/L BA là tối ưu nhất. Ở nồng độ này, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 93,75% đối với lá mầm và trụ dưới lá mầm, 86,61% đối với phôi hợp tử và 56,25% đối với rễ mầm. Mô sẹo tạo thành có dạng nốt sần, chắc, màu vàng nhạt hoặc trắng đục, có tiềm năng tạo phôi cao.

3. Nồng độ TDZ nào là phù hợp nhất để kích thích tạo phôi soma từ mô sẹo lá non?

Nồng độ TDZ tối ưu là 0,07 mg/L (nghiệm thức S1), cho tỷ lệ hình thành phôi soma dạng hình cầu cao nhất đạt 88,89% sau 8 tuần nuôi cấy và tỷ lệ phôi dị dạng thấp nhất (22,22%). Khi tăng nồng độ TDZ lên 0,3 mg/L, tỷ lệ phôi hình cầu giảm xuống 38,89% và tỷ lệ phôi dị dạng tăng mạnh lên 83,33%.

4. Hiện tượng phôi dị dạng biểu hiện như thế nào và nguyên nhân do đâu?

Quan sát giải phẫu vi thể cho thấy phôi dị dạng không hình thành vách ngăn tế bào hoàn chỉnh, xuất hiện các khối mô trương phình, dính liền nhau và phân cực không định hướng thành nhiều cực chồi. Nguyên nhân được giải thích là do nồng độ cytokinin (TDZ) cao làm xáo trộn quá trình vận chuyển phân cực của auxin nội sinh trong giai đoạn chuyển tiếp từ phôi hình cầu sang phôi hình tim, dẫn đến rối loạn phân chia tế bào.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Nguyên Hải Thơ đã nghiên cứu và xác lập các thông số nuôi cấy in vitro quan trọng cho cây Xáo tam phân (Paramignya trimera), bao gồm quy trình khử trùng hạt giống bằng Javel 20% trong 20 phút (đạt tỷ lệ sống sạch 70% và nảy mầm 44,79%). Nghiên cứu khẳng định môi trường WPM bổ sung 2,0 mg/L NAA và 0,2 mg/L BA cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo sinh phôi cao nhất (đạt 93,75% ở lá mầm và trụ mầm), đồng thời xác định nồng độ 0,07 mg/L TDZ giúp cảm ứng tạo phôi soma hình cầu từ mô sẹo lá non đạt hiệu suất 88,89%. Các kết quả thực nghiệm và dẫn liệu giải phẫu học này đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác bảo tồn nguồn gen và hoàn thiện quy trình vi nhân giống loài dược liệu quý Xáo tam phân.