Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi trồng cá tra Pangasianodon hypophthalmus tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong xuất khẩu thủy sản, chiếm 17.7% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2020. Giá trị xuất khẩu cá tra năm 2021 đạt hơn 1.4 tỷ USD, tăng 1.3% so với năm trước, và quý I/2022 đạt 646 triệu USD, hướng đến mục tiêu 2 tỷ USD trong năm 2022. Tuy nhiên, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã làm thiệt hại nghiêm trọng, với tỷ lệ chết lên đến 90-100% ở cá giống và 30-50% ở cá thịt. Việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đã bị cấm từ năm 2020, tạo áp lực lớn trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể PVN09 nhằm ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể này. Nghiên cứu tập trung vào phân tích trình tự bộ gene, xác định phổ xâm nhiễm và khảo sát các điều kiện môi trường như loại môi trường, MOI, pH, tốc độ lắc, nhiệt độ, thời điểm xâm nhiễm và các chất bổ trợ trong quá trình sản xuất chế phẩm phage PVN09. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP. Hồ Chí Minh trong năm 2022.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển liệu pháp phage như một giải pháp thay thế kháng sinh, góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh, giảm thiểu thiệt hại kinh tế và đảm bảo chất lượng sản phẩm cá tra xuất khẩu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy): Sử dụng phage có độc lực ly giải vi khuẩn gây bệnh, ưu tiên phage không chứa gene kháng kháng sinh và không tham gia chu trình tiềm tan để tránh chuyển gene ngang và kháng thuốc.
  • Công nghệ giải trình tự gene thế hệ mới (Next-generation sequencing - NGS): Áp dụng công nghệ Illumina NextSeq550 để phân tích trình tự genome phage PVN09, giúp xác định đặc điểm sinh học và tính an toàn của phage.
  • Mô hình sản xuất chế phẩm phage: Quy trình sản xuất gồm giai đoạn thượng nguồn (upstream) tạo lượng lớn phage và giai đoạn hạ nguồn (downstream) tinh sạch chế phẩm. Nghiên cứu tập trung tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến giai đoạn thượng nguồn như môi trường nuôi cấy, MOI, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc, thời điểm xâm nhiễm và chất bổ trợ.

Các khái niệm chính bao gồm: Multiple of Infection (MOI), mật độ phage (PFU/mL), phổ xâm nhiễm, độc lực phage, và các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sản xuất phage.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri E1 và phage PVN09 được sử dụng, với phage PVN09 phân lập từ gan cá tra. Dữ liệu genome phage được thu thập qua giải trình tự NGS Illumina.
  • Phương pháp phân tích: Dữ liệu thô được kiểm tra chất lượng bằng FastQC, xử lý loại bỏ trình tự chất lượng thấp và adapter bằng Trimmomatic, lắp ráp genome bằng Unicycler, kiểm tra lỗi lắp ráp với Pilon và Qualimap. Chú giải cấu trúc và chức năng gene sử dụng Prokka và BLASTP. Phân tích cây phát sinh loài bằng MEGAX và IQ-TREE.
  • Khảo sát phổ xâm nhiễm: Phương pháp spot test trên 11 chủng vi khuẩn khác nhau để xác định khả năng ly giải của phage PVN09.
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm phage: Thiết kế thí nghiệm one-factor-at-a-time (OFAT) với các yếu tố môi trường (loại môi trường TSB, BHI, EIM), MOI, pH, tốc độ lắc (0, 50, 150 rpm), nhiệt độ (24-30°C), thời điểm xâm nhiễm (0-7 giờ), và các chất bổ trợ (Ca2+/Mg2+ 0-1 mM, glycerol 0-5% w/v). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2-3 lần, phân tích thống kê bằng ONE-WAY ANOVA với độ tin cậy 95% (p < 0.05).
  • Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 02/2022 đến tháng 08/2022 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Đặc điểm genome phage PVN09: Genome dài 37,970 bp, GC 48.65%, gồm 48 ORFs, không chứa gene độc lực, gene kháng kháng sinh hay gene bất lợi. Phage thuộc họ Autographiviridae, chi Teseptimavirus, có đặc điểm tương tự phage T7. (Tỉ lệ ánh xạ reads 97.32%, độ tương đồng với Escherichia phage vB_EcoP_PHB20 là 94%).

  2. Phổ xâm nhiễm: Phage PVN09 có khả năng ly giải đặc hiệu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri E1, không xâm nhiễm các chủng vi khuẩn khác như Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterotica.

  3. Ảnh hưởng của môi trường và MOI: Môi trường TSB cho mật độ phage cao nhất, tăng khoảng 2 log PFU/mL so với BHI và EIM. MOI tối ưu là 0.1, giúp tăng mật độ phage từ 10^8 lên gần 10^10 PFU/mL.

  4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ: pH 6.0 là điều kiện tối ưu cho sản xuất phage PVN09, với mật độ phage tăng đáng kể so với pH thấp hơn 5.0 hoặc cao hơn 7.5. Nhiệt độ từ 24 đến 30°C cho hiệu suất cao nhất, tăng mật độ phage khoảng 2 log so với nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn.

  5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc và thời điểm xâm nhiễm: Tốc độ lắc 150 rpm tối ưu cho sự khuếch tán và hấp phụ phage. Thời điểm xâm nhiễm sau 3 giờ tăng sinh vi khuẩn cho mật độ phage cao nhất, so với xâm nhiễm sớm hoặc muộn hơn.

  6. Ảnh hưởng của các chất bổ trợ: Bổ sung ion Ca2+/Mg2+ 0.6 mM và glycerol 5% (w/v) làm tăng mật độ phage PVN09 khoảng 2 log PFU/mL, hỗ trợ sự ổn định và tăng sinh phage.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân tích genome khẳng định phage PVN09 là phage độc lực, an toàn cho ứng dụng liệu pháp phage, không chứa gene kháng kháng sinh hay gene độc, phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn phage trong điều trị bệnh. Phổ xâm nhiễm đặc hiệu giúp tránh ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi và hệ sinh thái môi trường nuôi.

Các yếu tố môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất sản xuất phage, trong đó môi trường TSB giàu dinh dưỡng hỗ trợ sự phát triển vi khuẩn chủ và phage. MOI 0.1 cân bằng giữa số lượng phage và vi khuẩn, tránh hiện tượng kháng phage và tối ưu hóa sản lượng. pH và nhiệt độ phù hợp đảm bảo hoạt động enzyme và sự hấp phụ phage hiệu quả.

Tốc độ lắc 150 rpm tạo điều kiện khuấy trộn tốt, tăng cường tiếp xúc phage và vi khuẩn. Thời điểm xâm nhiễm sau 3 giờ khi vi khuẩn đạt pha tăng trưởng log giúp phage nhân lên nhanh và hiệu quả. Các chất bổ trợ như ion Ca2+/Mg2+ và glycerol hỗ trợ cấu trúc capsid và ổn định phage, tăng mật độ phage thu được.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, phage PVN09 có đặc điểm tương đồng với các phage kháng E. ictaluri khác nhưng có mật độ phage cao hơn, phù hợp cho sản xuất quy mô pilot. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh mật độ phage theo các điều kiện môi trường, pH, nhiệt độ và MOI để minh họa rõ ràng hiệu quả tối ưu hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu quy trình sản xuất chế phẩm phage PVN09: Áp dụng môi trường TSB, pH 6.0, nhiệt độ 24-30°C, tốc độ lắc 150 rpm, MOI 0.1, thời điểm xâm nhiễm sau 3 giờ tăng sinh vi khuẩn để đạt mật độ phage cao (xấp xỉ 10^10 PFU/mL). Thời gian thực hiện mỗi mẻ 40 mL trong vòng 5 giờ. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm và nhà máy sản xuất chế phẩm phage.

  2. Bổ sung các chất hỗ trợ: Sử dụng ion Ca2+/Mg2+ 0.6 mM và glycerol 5% (w/v) trong môi trường nuôi cấy để tăng hiệu suất sản xuất và ổn định phage trong quá trình bảo quản. Thời gian áp dụng ngay từ giai đoạn thượng nguồn.

  3. Kiểm soát chất lượng và an toàn: Thường xuyên kiểm tra trình tự genome phage để đảm bảo không có gene kháng kháng sinh hoặc gene độc phát sinh trong quá trình nhân bản. Chủ thể thực hiện: bộ phận kiểm soát chất lượng.

  4. Nghiên cứu mở rộng và thử nghiệm in vivo: Tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên cá tra để đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh gan thận mủ, đồng thời khảo sát tính ổn định và hiệu quả của chế phẩm phage trong điều kiện nuôi thực tế. Thời gian dự kiến 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu thủy sản và doanh nghiệp nuôi trồng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Nghiên cứu về liệu pháp phage, đặc tính sinh học phage và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản.

  2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và thuốc thú y thủy sản: Áp dụng quy trình sản xuất chế phẩm phage PVN09 để phát triển sản phẩm thay thế kháng sinh, nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh.

  3. Người nuôi cá tra và các tổ chức quản lý thủy sản: Hiểu rõ về bệnh gan thận mủ, phương pháp phòng chống an toàn, giảm thiểu thiệt hại kinh tế và bảo vệ môi trường nuôi.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Xây dựng các chính sách hỗ trợ phát triển liệu pháp phage, kiểm soát sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, đảm bảo an toàn thực phẩm và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phage PVN09 có an toàn khi sử dụng trong nuôi cá tra không?
    Phân tích genome cho thấy phage PVN09 không chứa gene độc lực hay gene kháng kháng sinh, chỉ ly giải vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đặc hiệu, đảm bảo an toàn cho cá tra và môi trường nuôi.

  2. Điều kiện nào tối ưu để sản xuất chế phẩm phage PVN09?
    Môi trường TSB, pH 6.0, nhiệt độ 24-30°C, tốc độ lắc 150 rpm, MOI 0.1 và thời điểm xâm nhiễm sau 3 giờ tăng sinh vi khuẩn là các điều kiện giúp tăng mật độ phage lên khoảng 2 log PFU/mL.

  3. Phage PVN09 có phổ xâm nhiễm rộng không?
    Phage PVN09 chỉ ly giải đặc hiệu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri E1, không ảnh hưởng đến các vi khuẩn khác như Escherichia coli hay Aeromonas hydrophila, giúp tránh tác động không mong muốn đến hệ vi sinh vật.

  4. Tại sao cần bổ sung ion Ca2+/Mg2+ và glycerol trong quá trình sản xuất?
    Các ion này hỗ trợ cấu trúc capsid phage và tăng hiệu quả hấp phụ, trong khi glycerol giúp ổn định phage, từ đó tăng mật độ phage thu được và kéo dài thời gian bảo quản.

  5. Liệu pháp phage có thể thay thế hoàn toàn kháng sinh trong nuôi cá tra không?
    Liệu pháp phage là giải pháp tiềm năng thay thế kháng sinh, đặc biệt trong phòng và điều trị bệnh gan thận mủ. Tuy nhiên, cần kết hợp với các biện pháp quản lý nuôi trồng và thử nghiệm lâm sàng để đảm bảo hiệu quả toàn diện.

Kết luận

  • Phage PVN09 là phage độc lực, an toàn, không chứa gene kháng kháng sinh hay gene độc, phù hợp ứng dụng liệu pháp phage trong nuôi cá tra.
  • Môi trường TSB, pH 6.0, nhiệt độ 24-30°C, tốc độ lắc 150 rpm, MOI 0.1 và thời điểm xâm nhiễm sau 3 giờ là điều kiện tối ưu sản xuất chế phẩm phage PVN09 với mật độ cao (xấp xỉ 10^10 PFU/mL).
  • Bổ sung ion Ca2+/Mg2+ 0.6 mM và glycerol 5% (w/v) giúp tăng mật độ phage và ổn định chế phẩm.
  • Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển liệu pháp phage thay thế kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.
  • Đề xuất tiến hành thử nghiệm in vivo và mở rộng quy mô sản xuất để ứng dụng thực tiễn, góp phần phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam.

Hành động tiếp theo là triển khai thử nghiệm lâm sàng trên cá tra và phát triển quy trình sản xuất thương mại chế phẩm phage PVN09. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích hợp tác để đưa liệu pháp phage vào ứng dụng rộng rãi.