Chương 1. Tổng quan tài liệu Phương pháp thiết kế mồi phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhưng chung quy vẫn phải căn cứ vào các chỉ số cơ bản sau: Chiều dài mồi: ảnh hưởng trực tiếp đến tính đặc hiệu và thời gian cũng như nhiệt độ bắt cặp của mồi vào DNA đích. Đây là chỉ số then chốt đóng vai trò quan trọng cho thành công của phản ứng PCR. Người ta thường bắt gặp những trình tự DNA duy nhất dài 24 nucleotides.
Mồi quá dài (lớn hơn 50 nucleotide) ảnh hưởng đến tốc độ bắt cặp của mồi và DNA khuôn, sự bắt cặp hoàn toàn với phân tử DNA khuôn không kịp xảy ra trong thời gian chu kỳ phản ứng, làm giảm hiệu quả gắn mồi, ảnh hưởng tới hoạt tính và độ chính xác của DNA polymerase. Do đó tốt nhất chúng ta nên thiết kế mồi có chiều dài khoảng 18-30 nucleotide để chúng bắt đặc hiệu vào vùng DNA đích. Tránh thiết kế cặp mồi chứa chuỗi 4 nucleotide liên tục G hoặc C [2]. Nhiệt độ nóng chảy (Tm): Người ta thường thiết kế sao cho mồi có nhiệt độ bắt cặp và kéo dài trong khoảng 55-600C.
Mồi có Tm hơn 650C thường tạo sản phẩm thứ cấp [2]. Trong thiết kế Taqman probe cho phản ứng realtime PCR chúng ta cần chú ý sao cho độ lệch Tm giữa cặp mồi khuếch đại trình tự đích và Tm của probe trong khoảng 5-100C [29]. GC%: đây là thông số lý tính đặc trưng cho DNA vì nó liên quan tới nhiệt độ bắt cặp và nhiệt độ nóng chảy. Do vậy, chúng ta nên thiết kế cặp mồi có GC% nằm trong khoảng 45-60%.
Tuy nhiên, thông số này không phải là thông số quyết định duy nhất trong việc thiết kế mồi. Khi thiết kế taqman probe người ta thường dùng trình tự không quá 30 nucleotides và chứa C nhiều hơn G [2]. Trình tự đầu 3’: đóng vai trò tiên quyết cho sự bắt cặp đúng hay sai của mồi. Chúng ta nên thiết kế mồi chứa 1 nucleotide G hoặc C ngay tại đầu 3’ và GC% cao hơn về phía đầu 5’, thấp hơn về phía đầu 3’ [2].
Trong phản ứng Real-time PCR dùng taqman probe, người ta chọn vị trí chuyên biệt của probe chỉ cách 2-5 base tính từ đầu 3’ của primer khuếch đại trình tự đích [29]. Giảm tối đa hiện tượng bắt cặp sai: tạo thành dimer, cấu trúc hairpin, … Cấu trúc hairpin không là vấn đề nghiêm trọng trong thiết kế mồi (hình 1.6), nếu đầu 5’ bắt cặp với đoạn ngắn liền kề, vì mồi vẫn còn đầu 3’ đủ dài cho DNA polymerase nhận diện để kéo dài Trang 10 Chương 1. Tổng quan tài liệu tổng hợp trình tự gen đích. Nếu đầu 3’ bắt cặp với đoạn ngắn liền kề sẽ gây hậu quả nghiêm trọng vì mồi không gắn được trên DNA khuôn và xuất hiện sự kéo dài mồi, gây thiếu các thành phần phản ứng cho chu kỳ tiếp theo và có thể tạo một trình tự DNA mới.
Tuy nhiên, nếu đầu 3’ bắt cặp hoàn toàn với đầu 5’ sẽ gây thiếu hụt mồi cho chu kỳ phản ứng đó [2]. Ngoài ra, chúng ta cần quan tâm đến hiện tượng bắt cặp chéo của các mồi, nhất là khi thiết kế mồi dùng trong phản ứng PCR giải trình tự hoặc SNP-PCR cần tránh tuyệt đối hiện tượng này. Các trường hợp primer dimer [42] Hình 1. Cấu trúc hairpin [41] Tất cả những yếu tố cơ bản đáng quan tâm ngày nay được phần mềm hóa nên việc thiết kế mồi trở nên nhẹ nhàng hơn trước.
Có rất nhiều phần mềm thiết kế mồi chuyên dùng có mặt như primer 3, … và cả ở thương mại Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) và Oligo (Molecular Biology Insights, Cascade, CO). Thiết kế mồi khuếch đại các vùng marker STR DNA gặp phải một số khó khăn nhất định. Các mồi cần được thiết kế sao cho các sản phẩm khuếch đại được đánh dấu cùng loại màu huỳnh quang phải khác nhau hoàn toàn về kích thước. Thêm vào đó, các mồi phải vừa tạo được đầy đủ sản phẩm khuếch đại thể hiện qua mức độ cân bằng chiều cao peak vừa tạo được sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thể hiện qua việc không xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu – điều này gây khó khăn trong việc đọc hồ sơ DNA.
Cuối cùng, các mồi nên được thiết kế để tối ưu hiện tượng “thêm Adenosine” vào tất cả các sản phẩm STR PCR [9], [24]. Trang 11 Chương 1. Tổng quan tài liệu 1. Enzyme Amplitaq Gold Polymerase Enzyme AmpliTaq Gold™ DNA polymerase là enzyme quan trọng cho phản ứng STR-PCR vì nó đã được sửa đổi hóa học để duy trì trạng thái bất hoạt ở nhiệt độ thường [3].
Enzym này được kích hoạt trở lại trước khi thực hiện phản ứng PCR nhờ thêm bước tăng nhiệt độ lên 95oC trong 10 hoặc 11 phút. Ở pH dưới 7, hoạt tính polymerase được phục hồi. Dung dịch Tris trong phản ứng PCR có độ nhạy pH thay đổi theo nhiệt độ. Mỗi 10C tăng lên làm cho pH giảm khoảng 0,02 đơn vị [18].
Dung dịch đệm Tris có pH 8,3 ở 250C sẽ giảm xuống khoảng 6,9 ở 950C, do đó không chỉ DNA mạch khuôn biến tính mà hoạt tính polymerase của TaqGold cũng được kích hoạt. Vì vậy, TaqGold phù hợp nhất khi dùng dung dịch đệm Tris có pH 8,0 hoặc 8,3 ở 250C. AmpliTaq Gold không phù hợp với phản ứng PCR có dung dịch đệm pH 9,0 thường được dùng cho AmpliTaq DNA polymerase thông thường [26] bởi TaqGold vẫn ở trạng thái bất hoạt vì pH giảm không đủ để có thể gây ra thay đổi hóa học trên cấu trúc phân tử lysine mà cụ thể là nhóm epsilon-amino [18]. Multiplex PCR trong STR-PCR Phản ứng multiplex PCR khuếch đại cùng lúc hơn 2 vùng DNA bằng cách đơn giản thêm hơn một cặp mồi vào thành phần phản ứng và chúng phải tương thích với nhau.
Nói một cách khác, nhiệt độ bắt cặp của mồi nên bằng nhau và chúng không chứa vùng bắt cặp bổ sung lẫn nhau nhằm tránh hiện tượng tự bắt vào nhau tạo thành dimer-primer thay vì bắt cặp vào mạch DNA đích. Cứ mỗi cặp mồi thêm vào phản ứng multiplex PCR làm gia tăng khả năng chúng tương tác lẫn nhau. Ngoài sự thuận lợi là khuếch đại đồng thời được nhiều vùng DNA cùng một lúc thì multiplex PCR vẫn gặp phải những hạn chế như khi thiết kế không khéo sẽ tạo ra những sản phẩm không đặc trưng (mồi bắt chéo với nhau) đây là nhược điểm quan trọng nhất, hiện tượng stutter (nhược điểm thuộc về bản chất của kit thương mại). Ngoài ra, việc sử dụng loại enzyme Taq polymerase không đặc hiệu cho phản ứng cộng với nồng độ các cặp mồi không phù hợp thì amplicon có kích thước ngắn sẽ tạo ra nhiều hơn amplicon có kích thước dài, thậm chí những amplicon có kích thước dài từ 500bp trở lên có khả năng không thể tạo thành… Trang 12 Chương 1.
Tổng quan tài liệu Mỗi thử nghiệm PCR hầu như yêu cầu mức độ tối ưu nhất định cả hóa chất lẫn chu kỳ luân nhiệt. Multiplex PCR cũng không ngoại lệ. Thực tế, việc tối ưu cho thử nghiệm multiplex PCR gặp nhiều thử thách hơn so với thử nghiệm PCR truyền thống bởi các cặp mồi phải cùng lúc bắt vào mạch khuôn mà không gây trở ngại cho nhau và cần kéo dài thời gian trong chu kỳ luân nhiệt để có thể sao chép hoàn toàn tất cả các vùng DNA mục tiêu. Trình tự và nồng độ mồi cùng với Magnesium thường đóng vai trò quan trọng trong phản ứng multiplex PCR.
Ngoài ra cần đạt sự cân bằng giữa các sản phẩm PCR tạo ra do việc khuếch đại từ những vùng khác nhau trên DNA đích [22], [25]. Để thu được phản ứng đồng khuếch đại có mức cân bằng tốt các sản phẩm PCR tạo thành đôi khi phải thiết kế lại mồi và lặp lại thử nghiệm nhiều lần với các nồng độ mồi khác nhau. Để tạo được phản ứng multiplex PCR tối ưu có sản phẩm khuếch đại đạt mức cân bằng tốt là một thách thức. Các phòng thí nghiệm pháp y hiếm khi thực hiện lại tối ưu hóa PCR bởi hiện nay các kit thương mại khả dụng vốn rất dồi dào.
Những thuận lợi và bất lợi của ứng dụng kỹ thuật PCR trong giám định mẫu pháp y Tốc độ phát triển các ứng dụng dùng PCR hiện nay đã tạo ra những thuận lợi nhất định cho việc phân tích DNA trong pháp y như là: (i) Khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt thành hàng tỷ bản sao nhờ vào phản ứng multiplex. (ii) Chỉ cần dùng lượng cực nhỏ DNA thậm chí một tế bào. (iii) DNA bị thoái hóa thành những đoạn ngắn chỉ vài trăm cặp base cũng có thể làm mạch khuôn. (iv) DNA bị tạp nhiễm chẳng hạn từ vi khuẩn và nấm sẽ không được khuếch đại.
Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng gặp phải những vấn đề trở ngại nhất định. Chẳng hạn (i) DNA mạch khuôn sẽ không được khuếch đại nếu có chất ức chế PCR trong dung dịch ly trích. (ii) Phản ứng PCR sẽ không xảy ra nếu vùng gắn của mồi bị thay đổi. Trang 13 Chương 1.
Tổng quan tài liệu 1. Một số STR thường dùng hiện nay 1. Những đặc tính mong muốn của STR dùng trong pháp y Trình tự lặp STR cũng được phân loại theo chiều dài của đơn vị lặp lại. Đơn vị lặp dinucleotide gồm 2 nucleotide lặp lại liên tục nhau thành một vùng nhất định.
Trinucleotide có 3, tetranucleotide có 4, pentanucleotide có 5 và hexanucleotide có 6 nucleotide trong một nhóm lặp lại. Tuy nhiên, đơn vị lặp loại tetranucleotide trở thành marker STR phổ biến nhất dùng trong xác định cá thể nhờ những thuận lợi nhất định như sau: + Phổ kích thước alen hẹp cho phép multiplex + Phổ kích thước alen hẹp giảm hiện tượng mất alen do ưu thế khuếch đại alen kích thước nhỏ + Khả năng tạo thành các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ nên rất thuận lợi cho những mẫu DNA bị thoái hóa + Giảm hiện tượng tạo thành các sản phẩm stutter so với đơn vị lặp 2 nucleotide. Điều này tạo điều kiện thuận lợi trong việc đọc kết quả mẫu tạp. Trong những thập niên trước, người ta đã khám phá và ứng dụng tetranucleotide vào xác định cá thể [4].
Những vùng marker này phù hợp cho việc định kiểu gen cho những mẫu DNA thoái hóa, đặc tính tạo stutter thấp và STR nhiễm sắc thể Y để có thể phân tích hỗn hợp mẫu nam-nữ trong trường hợp xâm hại tình dục [8]. Chuẩn chọn vùng STR thích hợp cho ứng dụng xác định cá thể được Gill và cộng sự 1996, Carracedo và Lareu 1998 mô tả như sau: + Khả năng phân biệt tốt, thường >0,9 và dị hợp tử >0.7 + Tách biệt vị trí trên nhiễm sắc thể tránh trường hợp liên kết vùng gen.