CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương này trình bày những kiến thức về thực khuẩn thể, liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản, bàn luận tại sao liệu pháp phage lại được quan tâm cùng với cơ hội, thách thức của liệu pháp này. Bên cạnh đó cũng bàn luận về cá tra, các bệnh trên cá và nguyên nhân gây bệnh.1 Tổng quan về thực khuẩn thể 1.1 Đặc điểm hình thái Thực khuẩn thể: Bacteriophages (còn được gọi là phage) được định nghĩa là virus lây nhiễm vi khuẩn. Thực khuẩn thể được phát hiện một cách độc lập bởi Frederick Twort và Felix d’Hérelle vào đầu thế kỉ XX [1],[2].
Các phage đã được thiết kế trong điều trị, tuy nhiên do sự phổ biến của kháng sinh lúc bấy giờ nên liệu pháp phage dần trở nên bị quên lãng, mặc dù nghiên cứu về thực khuẩn thể vẫn được tiếp tục ở Liên Xô cũ ( Georgia và Nga) và Ba Lan [3]. Dưới kính hiển vi phage có cấu trúc đa dạng và phức tạp. Phần lớn các phage đã biết là virus có đuôi thuộc bộ Caudovirales. Chúng được cấu tạo bởi lớp vỏ capsid bao gồm các protein hoặc lipoprotein bảo vệ vật liệu di truyền là DNA hay RNA cùng với đuôi.
Đuôi có thể nhận dạng vật chủ thông qua các thụ thể ở sợi đuôi (Hình 1. 1 Mô phỏng thực khuẩn thể thuộc bộ Caudovirales 1.2 Chu kỳ xâm nhiễm của phage 1 Đồ án thiết kế công nghệ sinh học Phage có hai chu trình sao chép riêng biệt: chu trình tan (lytic cycle) và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle). Chu trình tan: Các bacteriophage làm chết tế bào vật chủ ngay lập tức gọi là phage độc và chúng sinh sản theo chu trình tan. Phage sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt vật chủ thông qua một thụ thể (receptors sites) và sau đó tiêm vật liệu di truyền của nó vào tế bào vật chủ.
Capsid rỗng của phage còn lại ở bên ngoài. Tế bào vật chủ sẽ cung cấp vật liệu và enzyme để sao chép, phiên mã, dịch mã vật chất di truyền của phage. Khi DNA (Deoxyribonucleic acid) của tế bào chủ bị phân huỷ, bộ gen của phage kiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo các cấu phần của nó. Các protein của capsid được tổng hợp thành 3 phần riêng: đầu đa diện, ống đuôi và các sợi đuôi rồi chúng lắp ráp thành các phage mới.
Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme được tạo ra để tiêu hóa vách tế bào. Tế bào vi khuẩn bị vỡ, hàng trăm phage mới thoát ra ngoài và tiếp tục chu kì tiếp theo. Chu trình tiềm tan: Trong chu trình này phage ôn đới không ly giải ngay tế bào chủ thay vào đó bộ gen của chúng được đưa vào nhiễm sắc thể của vật chủ tại các vị trí cụ thể. DNA này trong bộ gen vật chủ được gọi là prophage.
Prophage sẽ được sao chép cùng với bộ gen của vật chủ vi khuẩn, thiết lập một mối quan hệ ổn định. Chu kì tiềm tan có thể kéo dài vô hạn trừ khi vi khuẩn tiếp xúc với căng thẳng hay môi trường sống bất lợi. Khi đó chu trình tiềm tan kết thúc và chu trình tan bắt đầu [3]. 2 Chu trình tan và tiềm tan 2 Đồ án thiết kế công nghệ sinh học Các phage ôn đới (những phage biểu hiện vòng đời lysogenic) được coi là những thể tham gia vào quá trình chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) giữa các tế bào vi khuẩn.
Chúng có thể chuyển những độc lực sang gen kháng thuốc kháng sinh do đó không thích hợp để sử dụng trong liệu pháp. Ngược lại các phage độc lực trực tiếp ngăn chặn các tế bào chủ và khả năng chuyển bất kỳ gen nào của chúng bị hạn chế điều này khiến chúng được mong muốn trong mục đích điều trị. Điều này có nghĩa là phage độc có chu trình tan sẽ được ưu tiên phát triển trong liệu pháp phage [4], [5].2 Tổng quan về liệu pháp phage 1.1 Liệu pháp phage là gì? Liệu pháp phage là một liệu pháp sử dụng thực khuẩn thể để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Các phage sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn qua chu trình tan.
Do cơ chế hoạt động khác với kháng sinh và các phage cũng có khả năng đồng tiến hóa với vi khuẩn nên đây là một giải pháp tiềm năng thay thế cho thuốc kháng sinh trong tình trạng xuất hiện nhiều vi khuẩn kháng thuốc như hiện nay.2 Tại sao liệu pháp phage lại được quan tâm trong ngành nuôi trồng thủy sản? Ngày nay tình trạng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trở nên trầm trọng, gây ảnh hưởng trầm trọng đến sức khỏe con người, động thực vật, môi trường và các lĩnh vực khác trong đó phải kể đến là lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Dân số trên thế giới đang tăng lên với tốc độ nhanh chóng là 75 triệu người mỗi năm từ năm 1971 đến năm 2016 và ước tính đạt 9,2 tỷ người vào năm 2050 [6]. Nuôi trồng thủy sản là ngành sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thức ăn cho dân số trong tương lai. Năm 2016, nuôi trồng thủy sản chiếm 45% sản lượng cá toàn cầu và số lượng này tăng lên 52% vào năm 2025.
Nuôi trồng thủy sản diễn ra chủ yếu ở châu Á, với số lượng 77 triệu tấn năm 2016 cung ứng 90% sản lượng cá cho toàn cầu. Trung Quốc là quốc gia quan trọng trong nuôi trồng thủy sản vì nước này cung cấp 62% sản lượng cá của thế giới năm 2018. Để đáp ứng nhu cầu protein dự kiến sản lượng thủy sản sẽ tăng gần gấp đôi từ 80 triệu tấn vào năm 2016 lên khoảng 140 triệu tấn vào năm 2050 [7]. 3 Đồ án thiết kế công nghệ sinh học Tuy nhiên các bệnh gây ra do vi khuẩn tác động lớn đến yếu tố kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản.
Người ta đã ước tính rằng khoảng 34% nhiễm trùng có nguồn gốc từ vi khuẩn [8]. Không chỉ tác động lên kinh tế, những dịch bệnh tấn công thủy sản có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng vì mầm bệnh này có thể lây lan qua tiếp xúc trực tiếp với động vật ốm và thức ăn có nguồn gốc từ động vật [9]. Một mối đe dọa khác đến từ khả năng kháng thuốc của mầm bệnh. Người ta ước tính rằng vật nuôi tiêu thụ 73% tổng lượng kháng sinh trên thế giới [10].
Ngày nay, chúng không chỉ được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng mà còn được sử dụng như tác nhân phòng ngừa hoặc chất thúc đẩy tăng trưởng. Vì vậy có nhiều bệnh mà trước đây dễ chữa bây giờ lại trở thành một vấn đề lớn [11]. Trong một số trường hợp ngay cả khi liệu pháp kháng sinh có hiệu quả trong phòng thí nghiệm thì hiệu quả trong thực tế của nó rất thấp [12]. Vào năm 2006, chính quyền EU (European Union) đã ban hành lệnh cấm sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi.
Dự kiến năm 2022 sẽ cấm sử dụng các loại kháng sinh quan trọng đối với y học của con người và cấm sử dụng bất kỳ loại kháng sinh nào mà không có đơn của bác sĩ chăn nuôi. Do đó có thể trong tương lai kháng sinh sẽ không được sử dụng rộng rãi như trước nữa. Các nhà khoa học trên thế giới đang nổ lực nghiên cứu những liệu pháp có thể thay thế kháng sinh đặc biệt trong ngành nuôi trồng thủy sản [13]. Nếu giải quyết được bài toán trên, khả năng sẽ tiêu diệt được những vi khuẩn kháng thuốc, giúp cho thủy sản phát triển tốt, nâng cao năng suất và lợi nhuận.
Liệu pháp phage một lần nữa được gọi tên là một trong nhũng ứng cử viên sáng giá cho lời giải này. Ngày nay ngoài kháng sinh ra cũng có một số biện pháp khác cho việc kháng khuẩn trong nuôi trồng thủy sản, các biện pháp có thể kể đến như là vaccine, phytogenics, probiotic và phage. Mỗi liệu pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và cần cân nhắc để phát triển ra một liệu pháp kháng khuẩn trong tương lai. 4 Đồ án thiết kế công nghệ sinh học Nói về kháng sinh, kháng sinh có tác dụng nhanh, dễ sử dụng tuy nhiên nó ảnh hưởng nhiều đến hệ vi sinh vật đường ruột của động vật, ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng cũng như là khả năng kháng bệnh [14].
Ngoài ra một số chất hoạt như oxytetracycline cũng hoạt động như chất ức chế miễn dịch và do đó làm tăng nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh để hỗ trợ hệ thống miễn dịch [14]–[16]. Kháng sinh ngày càng mất tác dụng do việc các phân tử kháng sinh giải phóng ra môi trường quá nhiều với ước tính khoảng 75%, thậm chí được bổ sung trực tiếp vào nước [17]. Bởi vì kháng sinh có hiệu quả đáng tin cậy với những chủng vi khuẩn nhạy cảm nên cũng được xem là một giải pháp đáng chú ý, song không bền vững. Vaccine cũng là liệu pháp được sử dụng thành công trong ngành nuôi trồng thủy sản: vaccine giảm được lượng đáng kể kháng sinh trong sản xuất cá hồi.
Tuy nhiên vaccine không thể dùng bảo vệ những con cá thiếu hệ thống miễn dịch. Bên cạnh đó không thể bảo vệ động vật được tiêm một cách toàn vẹn và sẽ khó có thể tiêm cho một lượng lớn vật nuôi [18]. Ngoài ra còn một liệu pháp rất được quan tâm là Phytogenics. Phytogenics là những chất được chiết xuất từ tự nhiên, phần lớn trong số đó thật sự là tinh dầu [19].
Đây cũng là một biên pháp đầy hứa hẹn trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh ở lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Liệu pháp này đã cho hiệu quả tích cực trong điều kiện in vitro. Tuy nhiên để hiểu rõ cơ chế hoạt động cần phải thực hiện một lượng lớn thí nghiệm in vivo [14]. Bản chất của phytogenic đang là một lời giải cùng với việc tìm kiếm nguồn cung ứng cũng có thể rắc rối vì một số nguyên liệu thô chứa phytogenic dường như không có sẵn.
Probiotic cũng là một giải pháp thay thế hợp lý cho thuốc kháng sinh. Tuy nhiên tác động của chúng không được hiểu rõ [14], [20]. Năm 2016, trong các trại nuôi tôm người ta bổ sung probiotic theo từng thời kì sinh trưởng của tôm. Kết quả là hiệu quả của probiotic chỉ xuất hiện ở một số giai đoạn nhất định khiến probiotic dường như không có định hướng [21].
Ngoài ra cũng rất khó kết hợp probiotic với các dung dịch kháng khuẩn vì cả vi khuẩn có lợi và hại đôi khi cũng ở trong cùng một loài [22]–[24].