MỞ ĐẦU Xét nghiệm quan hệ huyết thống hay còn gọi đơn giản là xét nghiệm DNA không còn quá xa lạ trong xã hội hiện nay. Xét nghiệm này phục vụ một lượng lớn nhu cầu dân sự là kiểm tra quan hệ huyết thống giữa hai hay nhiều cá thể, tìm thân nhân, giải quyết các thủ tục pháp lý, điều tra pháp y. Công nghệ xét nghiệm DNA liên tục được cải tiến, từ những cơ sở ban đầu là dựa trên nhóm máu, hệ kháng nguyên bạch cầu, hiện nay xét nghiệm này được thực hiện trên cơ sở chạy phản ứng PCR multiplex khuếch đại và tiến hành so sánh từ 16 đến 24 vị trí đoạn lặp đa hình STR cho độ chính xác của xét nghiệm gần như là tuyệt đối [1]. Nguồn DNA đầu vào là yếu tố quyết định đến kết quả của phản ứng PCR.
DNA không tinh sạch làm giảm hiệu suất hoạt động của taq polymerase hoặc ức chế phản ứng PCR. Các quy trình ly trích DNA truyền thống như quy trình ly trích bằng phenol, Boom và cả các bộ ly trích đã được thương mại hiện nay phục vụ riêng cho xét nghiệm DNA của Qiagen (QIAamp DNA investigator kit), Promega (DNA IQ system), Omega (E.A Forensic DNA kit) đều có nhiều bước thực hiện phức tạp nhằm giúp sản phẩm DNA thu được cuối cùng có độ tinh sạch đủ để tham gia phản ứng PCR. Tuy nhiên các quy trình trên đều có nhược điểm lớn là quá trình ly trích càng nhiều bước thực hiện càng làm người kỹ thuật viên dễ gây sai sót, nhầm lẫn, kéo dài thời gian xét nghiệm. Trong khi đó với xét nghiệm DNA chúng tôi yêu cầu một quy trình ly trích mẫu đơn giản (một đến hai bước thao tác) giúp kết quả xét nghiệm cuối cùng là chính xác nhất [2].
Đã có các quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác được báo cáo trước đây. Tuy nhiên sản phẩm DNA thu được từ các quy trình này chỉ tham gia được một số phản ứng PCR đơn giản [3]. Vì vậy, vào thời điểm đó, các báo cáo này không được ứng dụng trong thực tiễn. Hiện nay công nghệ sinh học đã có những bước tiến đáng kể trong kỹ thuật enzyme tái tổ hợp, các nhà sản xuất như Qiagen, Promega lần lượt cho ra các sản phẩm taq polymerase kháng ức chế.
Nghĩa là phản ứng PCR phức tạp nhất vẫn có thể được thực hiện trên đối tượng DNA không đạt yêu cầu về độ tinh sạch [3]. 1 PowerPlex ®Fusion System là bộ kit được sử dụng trong hầu hết các phòng xét nghiệm huyết thống hiện nay cho phép kiểm tra 24 vị trí STR trong một phản ứng multiplex PCR. Bộ kit được nhà sản xuất khuyến cáo hoạt tính kháng ức chế của taq polymerase tốt hơn so với các thế hệ taq polymerase cũ. Tận dụng ưu điểm này, ta hoàn toàn có thể thay thế quy trình ly trích nhiều bước phức tạp bằng quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác đơn giản giúp tiết kiệm thời gian, chủ động về mặt kỹ thuật, giảm chi phí và giảm thiểu tối đa rủi ro, nhầm lẫn có thể xảy ra trong quá trình xử lý mẫu [4].
Đối tượng mẫu mà chúng tôi cân nhắc cho quy trình ly trích thô DNA là niêm mạc miệng vì đây là dạng mẫu được ưu tiên thu nhận tại cái phòng xét nghiệm do đặc tính dễ thu nhận, dễ bảo quản, không xâm lấn, lượng DNA dồi dào. Thêm vào đó, cũng đã có một số ly trình ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng được công bố trước đây bởi Daniel (1995), Brenda (1992) [5]. Dựa trên các quy trình ly trích đã có, tính năng kháng ức chế của bộ kit đang sử dụng, đề tài: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng - Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống” được thực hiện nhằm đạt được mục tiêu và các nội dung sau: Mục tiêu đề tài: - Đề xuất được quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống, rút ngắn thời gian ly trích, giảm rủi ro, giảm giá thành xét nghiệm. Nội dung đề tài: - Khảo sát hiệu quả của một số quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng đã được công bố, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống.
- Cải tiến quy trình được chọn. - Ly trích so sánh với bộ kit ly trích thương mại. - Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu đại diện, từ đó đánh giá tính khả thi của quy trình đề xuất. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.
Xét nghiệm quan hệ huyết thống Trong xã hội ngày nay, nhu cầu tìm hiểu, xác nhận mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể người ngày càng tăng cao. Không chỉ phục vụ cho giải đáp nghi vấn của cá nhân, xét nghiệm này còn phục vụ cho các mục tiêu pháp lý như làm giấy khai sinh, nhập quốc tịch, bảo lãnh, định cư. Ngoài ra, trong điều tra hình sự, xét nghiệm này là công cụ hỗ trợ đắc lực giúp nhận diện cá thể truy lùng dấu vết. Để giải quyết cho các nhu cầu trên, phương pháp xác định quan hệ huyết thống đã sớm ra đời từ đầu những năm 1920 dựa trên các hiểu biết về di truyền.
Một số chỉ thị sinh học được sử dụng trong nhận dạng và xác định mối quan hệ huyết thống bao gồm: Nhóm máu; Kháng nguyên bạch cầu- HLA; Các đoạn lặp đa hình. Xét nghiệm dựa trên nhóm máu Đầu những năm 1900 các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu cơ bản của con người là A, B, AB và O dựa trên một số chất cacbohydrat và protein đặc thù trên hồng cầu. Đến những năm 1920, các nghiên cứu cho thấy nhóm máu được quyết định do gen. Gen này quy định bởi 2 alen trội là IA, IB và 1 alen lặn iO, di truyền theo quy luật của Mendel [6].
Do đó các nhà khoa học có thể dự đoán được nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ. Tuy nhiên việc sử dụng nhóm máu có những hạn chế nhất định do nó chỉ chính xác 30% và nó không phải là một công cụ hữu hiệu cho việc xác định mối quan hệ huyết thống. Dựa trên nhóm máu này ta chỉ có thể khẳng định được một số trường hợp chắc chắn không phải là cha con. Ví dụ: Cha giả định có nhóm máu O (có cấu trúc gen iO iO), mẹ ruột nhóm máu O (có cấu trúc gen iO iO) nếu con có nhóm máu A, B thì chắc chắn không phải là con của người cha giả định.
Tuy nhiên nếu con có nhóm máu O thì vẫn chưa đủ cơ sở để kết luận cha con vì vẫn có rất nhiều người đàn ông máu O. Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA) Năm 1970, các nhà khoa học khám phá ra các kháng nguyên bạch cầu (Human Leucocyte Antigen - HLA) của con người là các protein hiện diện trên tất cả các tế bào của cơ thể trừ hồng cầu, đặc biệt HLA tập trung trên tế bào bạch cầu. Kháng 3 nguyên bạch cầu là các protein kháng nguyên hiện diện trên bề mặt tế bào, đóng vai trò quan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như những cơ chế giao tiếp giữa các tế bào. HLA được xác định bằng cách sử dụng các test huyết thanh và kháng thể đơn dòng (anticorps monoclonaux) có mặt trên các tế bào bạch cầu lympho [7].
Có nhiều dạng HLA khác nhau và có sự hiện diện khác nhau ở từng người, tuy các gen quy định cho HLA cũng di truyền theo quy luật Menden. Đứa trẻ khi được sinh ra sẽ có một nửa kháng nguyên bạch cầu di truyền từ bố và một nửa từ mẹ. Do đó xét nghiệm HLA trở thành một công cụ cho phép xác định mối quan hệ huyết thống cha con. Nếu chỉ sử dụng riêng xét nghiệm HLA có thể xác định được mối quan hệ cha con với độ chính xác là 80%, nếu kết hơp với xét nghiệm nhóm máu và xét nghiệm huyết thanh thì kết quả có độ chính xác lên tới 90% [8].
Tuy nhiên xét nghiệm HLA cũng không phải là một công cụ lý tưởng để xác định mối quan hệ huyết thống do xét nghiệm đòi hỏi lượng máu thu ban đầu khá lớn, quá trình lấy máu gây khó chịu và nguy hiểm cho các trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi. Một số yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như: mẫu máu bị vỡ hồng cầu, người làm xét nghiệm được truyền máu trước đó. Do đó, hiện nay xét nghiệm HLA chủ yếu sử dụng để xác định tính tương hợp mô trước khi ghép tạng, tìm kiếm các HLA liên quan đến một số bệnh lý. Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình 1.
Khái niệm đoạn lặp đa hình DNA được tạo thành từ 4 loại nucleotide, chính sự sắp xếp đa dạng của các nucleotide này làm cho DNA mỗi người trở nên độc nhất vô nhị. Cơ thể mỗi người có tới 3.2 tỉ cặp base, việc xác định, tìm thấy sự khác biệt về trình tự base giữa các cá nhân là không hề đơn giản. Năm 1984, Alec Jeffeya và các cộng sự trong khi nghiên cứu DNA mã hóa cho hemoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp lại 10-15 base, các đoạn lặp lại này được gọi là các Tandem Repeat Sequence – đoạn lặp lại đa hình [9]. Các Tandem Repeat Sequence có tính đa hình về số lượng rất lớn, chúng khác nhau về 4 số base trong một đơn vị, số lượng đơn vị lặp.
Chính sự đa hình này giúp cho sự phân biệt giữa các cá thể trong loài cũng như phân biệt giữa các loài với nhau [10]. Dựa vào số lượng base trong một đơn vị lặp, Tandem Repeat Sequence được chia làm 3 nhóm: - DNA vệ tinh (DNA satellite): đơn vị lặp lại từ một đến vài trăm base. Độ dài vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb. DNA satellite thường được tìm thấy ở xung quanh vùng tâm động nhiễm sắc thể.
Sự phân bố của chúng đóng vai trò nhất định trong sự phân chia tế bào, được biết chúng liên quan đến sự liên kết các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể về cực của tế bào. DNA satellite ít khi được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhận dạng cá thể, mà thường dùng làm chỉ thị cho lập bản đồ gen vùng gần tâm động. - DNA tiểu vệ tinh (DNA minisatellite): còn gọi là DNA lặp lại ngẫu nhiên, đa hình (variable number tandem repeat-VNTR). Số lượng base trong một đơn vị dao động từ 10-100 base, lặp lại từ 1-30 lần, chiếm đoạn DNA từ 1- 5kb, thậm chí có thể lên tới 20 kb [11][12].
