Tổng quan luận án

Nuôi trồng thủy sản đóng vai trò là một ngành kinh tế có quy mô và tỷ suất hàng hóa lớn, tham gia vào chuỗi cung ứng toàn cầu. Theo Quyết định số 339/QĐ-TTg ngày 11 tháng 3 năm 2021 của Thủ tướng Chính phủ về việc phê duyệt Chiến lược phát triển thủy sản Việt Nam đến năm 2030, tầm nhìn đến năm 2045, mục tiêu đặt ra đến năm 2030 là tốc độ tăng trưởng giá trị sản xuất thủy sản đạt 3,0 - 4,0%/năm; tổng sản lượng thủy sản sản xuất trong nước đạt 9,8 triệu tấn (trong đó sản lượng nuôi trồng đạt 7,0 triệu tấn, khai thác đạt 2,8 triệu tấn); giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 14 - 16 tỷ USD. Tuy nhiên, so với các ngành chăn nuôi hay thú y, nuôi trồng thủy sản vẫn gặp nhiều hạn chế trong lĩnh vực nghiên cứu sinh sản nhân tạo và nâng cao chất lượng con giống do chưa có nhiều công trình cải tạo nguồn gen và khả năng kiểm soát sinh sản trong môi trường nuôi nhốt còn thấp.

Trong điều kiện nuôi nhốt, nhiều loài cá biển không thể đẻ tự nhiên do cá cái không đạt đến trạng thái thành thục hoàn toàn (dẫn đến không thể chín và rụng trứng), còn cá đực tạo ra lượng tinh dịch ít hoặc chất lượng tinh dịch không đảm bảo cho quá trình thụ tinh. Đối với đối tượng cá dìa Siganus guttatus (Bloch, 1787)—loài cá biển có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, phân bố nhiệt đới từ Đông Ấn Độ Dương đến Tây Thái Bình Dương—nguồn giống hiện nay tại Việt Nam vẫn chủ yếu phụ thuộc vào việc khai thác tự nhiên hoặc nuôi ghép với tỷ lệ sống ở giai đoạn ấu trùng rất thấp (chưa đến 1% đến 2%). Khoảng trống nghiên cứu then chốt được xác định là: các nghiên cứu cơ bản về sinh học sinh sản, sinh lý học và nội tiết học sinh sản cá dìa trong điều kiện nuôi nhốt chưa được giải quyết đầy đủ, đặc biệt là sự thiếu hụt dữ liệu về sự biến động của các hormone steroid huyết tương trong chu kỳ sinh sản và dưới tác động của các kích thích tố ngoại sinh.

Đề tài “Nghiên cứu sự biến động hàm lượng hormone steroid huyết tương trong chu kỳ sinh sản cá dìa Siganus guttatus (Bloch, 1787)” được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về nội tiết học, phục vụ việc hoàn thiện quy trình công nghệ sinh sản nhân tạo.

Mục tiêu nghiên cứu:

  • Mục tiêu tổng quát: Làm rõ sự biến động hàm lượng hormone steroid trong huyết tương cá dìa Siganus guttatus trong chu kỳ sinh sản làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinh sản nhân tạo.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Làm rõ sự biến động hàm lượng Estradiol 17-β (E2), Testosterone (T) và 11 – Keto Testosterone (11-KT) trong huyết tương cá dìa và mối quan hệ của chúng với quá trình phát triển tuyến sinh dục trong chu kỳ sinh sản.
    2. Làm rõ sự biến động hàm lượng E2 và T dưới ảnh hưởng của kích dục tố màng đệm nhau thai người (hCG) và LHRH – A.
    3. Làm rõ sự thay đổi về đặc điểm sinh lý sinh sản và thành phần sinh hóa của tinh sào và buồng trứng của cá dìa dưới ảnh hưởng của hCG, LHRH – A.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Cá dìa bố mẹ Siganus guttatus (Bloch, 1787), tuổi 1+, khỏe mạnh, không dị tật hay có dấu hiệu bệnh lý.
  • Phạm vi không gian: Các thí nghiệm nuôi giữ, lấy mẫu cá được thực hiện tại các ao đất và bể xi măng ở Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa (tọa độ 12°52'15''N, 108°40'33''E); các phân tích mô học và hóa sinh được tiến hành tại Viện Nuôi trồng Thủy sản và Trung tâm Thí nghiệm Thực hành thuộc Trường Đại học Nha Trang.
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ tháng 5 năm 2017 đến tháng 5 năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam xoay quanh đặc tính sinh học, sinh sản và nội tiết học cá xương, cụ thể trên đối tượng giống cá dìa (Siganus):

  • Đặc điểm sinh học, dinh dưỡng và sinh trưởng cá dìa: Phân tích của Penis và cộng sự (1972) chỉ ra hàm lượng protein trong cơ thịt của cá họ Siganidae ở mức cao. Các nghiên cứu hình thái và thức ăn cho thấy cá dìa con non và trưởng thành ăn thực vật thủy sinh (rong tảo như Enteromorpha, Chaetomorpha, Gracilaria...), cấu trúc ruột dài và thành bao tử dày, nhưng trong nuôi nhốt có thể thích ứng với thức ăn công nghiệp chứa 42% protein. Quá trình phát triển phôi được Kohno và cộng sự (1986) mô tả gồm các pha: 8 tế bào (30 phút sau thụ tinh), 32 tế bào (70 phút), túi phôi (85 phút), lá phôi (2 giờ), bì phôi (5 giờ 45 phút), thân phôi (7 giờ), 6 đốt sống (7 giờ 40 phút), 16 đốt sống (11 giờ 20 phút), và 24 đốt sống (13 giờ) ở nhiệt độ 26 - 28°C.
  • Nghiên cứu sinh sản nhân tạo và kích thích hormone trên thế giới: Juario và cộng sự (1985) tại Trung tâm Phát triển Nghề cá Đông Nam Á (SEAFDEC - Philippines) báo cáo tỷ lệ sống khi ương ấu trùng từ khi nở đến hết biến thái dao động từ 1,9% đến 12,8% nhưng kết quả không ổn định. Nghiên cứu của Ayson (1991) chỉ ra kích thước noãn bào tối thiểu để cá dìa cái tự đẻ không cần can thiệp hormone là 0,46 mm; với noãn bào ≤ 0,45 mm, cần sử dụng hCG để gây cảm ứng sinh sản (cho tỷ lệ thụ tinh 96% và tỷ lệ nở 59%). Garcia (1989) chứng minh tiêm LHRH-A hàng tuần có tác dụng kích thích và duy trì khả năng sinh tinh ở cá dìa đực.
  • Tình hình nghiên cứu cá dìa tại Việt Nam: Lê Văn Dân và Lê Đức Ngoan (2006) khảo sát cá dìa ở đầm phá Tam Giang - Cầu Hai (Thừa Thiên Huế), ghi nhận trong nuôi nhốt buồng trứng chỉ thành thục vào tháng 3 và tháng 5 với tỷ lệ rất thấp (8,3%), cá đực thành thục từ tháng 3 đến tháng 7 (tỷ lệ thành thục đạt 72,7% vào tháng 3 và 61,5% vào tháng 6); cá thành thục lần đầu ở 1 năm tuổi (khối lượng cá cái 488,57 g; cá đực 432,85 g). Võ Thị Ngọc Giàu (2014) khảo sát sinh lý tinh dịch cá dìa, ghi nhận mật độ tinh trùng đạt 9,60 ± 1,45 × 10^9 tế bào/ml, độ quánh 91,71 ± 3,35%, hoạt lực kéo dài 362,14 ± 37,8 giây ở độ pha loãng 1:50, pH 8,0 - 8,25 và áp suất thẩm thấu 400 mOsm/kg. Phan Văn Út và cộng sự (2009 - 2013) thử nghiệm kích thích sinh sản bằng hCG (2.000 IU/kg) hoặc LHRH-A (40 µg/kg), thời gian hiệu ứng 40 - 72 giờ, tỷ lệ thụ tinh trên 80%, tỷ lệ nở 85,9%, tỷ lệ sống ấu trùng lên cá 3 cm đạt 0,35%, và tỷ lệ sống giai đoạn 5 - 7 cm đạt 40,70%.
  • Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Các công trình trước đây tại Việt Nam và khu vực chủ yếu tập trung vào thử nghiệm kỹ thuật kích thích sinh sản bằng kinh nghiệm liều lượng hoặc mô tả hình thái học cơ bản. Cơ chế biến động nồng độ các hormone steroid sinh dục nội sinh (Estradiol 17-β, Testosterone, 11-Ketotestosterone) theo chu kỳ sinh sản tự nhiên trong điều kiện nuôi nhốt, cũng như động học tiết steroid và biến đổi sinh hóa buồng trứng, tinh sào sau khi tiêm kích dục tố ngoại sinh (hCG, LHRH-A kết hợp DOM) chưa từng được công bố trên đối tượng cá dìa Siganus guttatus.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết điều hòa nội tiết sinh sản theo trục Não bộ – Tuyến yên – Tuyến sinh dục (Hypothalamus – Pituitary – Gonad) ở cá xương:

  • Não bộ tổng hợp hormone giải phóng kích dục tố (GnRH), kích thích tuyến yên sản xuất hai kích dục tố (Gonadotropins): GTH-I (tương đương FSH) và GTH-II (tương đương LH).
  • FSH tham gia điều hòa giai đoạn đầu của sự phát triển giao tử: ở cá đực kích thích tế bào Sertoli và sinh tổng hợp 11-Ketotestosterone (11-KT) để điều khiển quá trình tạo tinh; ở cá cái kích thích sự tích lũy noãn hoàng (vitellogenesis) thông qua việc sản sinh Estradiol 17-β (E2).
  • Sự sinh tổng hợp E2 ở buồng trứng diễn ra theo mô hình hai kiểu tế bào: dưới tác động của kích dục tố tuyến yên, lớp tế bào vỏ tổng hợp Testosterone (T) từ cholesterol, sau đó T khuếch tán sang lớp tế bào hạt và được chuyển hóa thành E2 nhờ xúc tác của enzyme aromatase. E2 theo máu đến gan kích thích tổng hợp vitellogenin (VTG).
  • LH điều hòa quá trình thành thục cuối cùng và rụng trứng/tiết tinh: thúc đẩy chuyển dịch con đường tổng hợp từ E2/T sang hormone gây chín (MIS như 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one hoặc 20β-S).
  • Hệ thống phân loại sự phát triển tuyến sinh dục dựa theo bậc thang 6 giai đoạn phát triển mô học của buồng trứng và tinh sào cá xương (áp dụng tài liệu Sakun và Butskaia, 1968), chia noãn bào thành 6 phase (từ phase 1 biến đổi nhân đến phase 6 cực hóa, chín và rụng) và tế bào sinh dục đực qua 4 thời kỳ (sinh sản, sinh trưởng, thành thục, biệt hóa tinh trùng).

Thiết kế thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Đàn cá bố mẹ tuổi 1+ được nuôi giữ trong ao đất 100 m² (độ sâu 1,2 m; tỷ lệ đực:cái là 1:1; mật độ 3 con/m²; nhiệt độ mùa xuân 24 ± 2°C, mùa hè 29 ± 3°C; độ mặn 29 ± 3‰; pH 7,8 – 8,6; DO 4 ± 0,5 mg/L; thức ăn viên công nghiệp chứa 42% protein với tỷ lệ 2 – 3% khối lượng thân). Nghiên cứu bố trí 3 nội dung thí nghiệm:

  1. Thí nghiệm 1 (Biến động hormone trong chu kỳ sinh sản tự nhiên): Định kỳ mỗi tháng thu ngẫu nhiên ít nhất 10 cá đực và 10 cá cái (chiều dài 24 ± 2 cm; khối lượng 520 ± 60 g). Cá được gây mê bằng nước đá, thu 3 ml máu qua tĩnh mạch cuống đuôi, ly tâm tách huyết tương và bảo quản ở -80°C để phân tích E2 (cá cái), T và 11-KT (cá đực). Giải phẫu thu tuyến sinh dục và gan để tính hệ số thành thục (GSI), hệ số gan (HSI) và làm tiêu bản mô học.
  2. Thí nghiệm 2 (Biến động E2 và T dưới ảnh hưởng của hCG và LHRH-A): Sử dụng 120 cá thể tuổi 1+ (chiều dài 30 ± 4 cm; khối lượng 550 ± 80 g) chia thành các lô tiêm:
    • Lô tiêm hCG: liều 1.500 IU/kg cá cái.
    • Lô tiêm LHRH-A + DOM: liều 50 µg LHRH-A + 5 mg Domperidone/kg cá cái.
    • Cá được nuôi trong bể 4 m³ (nhiệt độ 30 ± 2°C, độ mặn 32 ± 2‰, pH 7,8 – 8,6, DO 5 ± 0,5 mg/L, ngừng cho ăn). Thu mẫu máu tại các thời điểm 6, 12, 24 và 48 giờ sau tiêm để đo nồng độ E2 và T huyết tương.
  3. Thí nghiệm 3 (Ảnh hưởng lên sinh lý sinh sản và thành phần sinh hóa tuyến sinh dục): Cá đực (30,64 ± 1,03 cm; 524,55 ± 84,54 g) và cá cái (31,22 ± 2,28 cm; 606,67 ± 104,04 g) được thuần dưỡng 10 ngày trong bể xi măng 4 m³ (mật độ 6 con/m³, tương đương 3 kg/m³). Bố trí 3 nghiệm thức (20 cá thể/nghiệm thức):
    • Nghiệm thức 1: Tiêm 1.500 IU hCG/kg cá.
    • Nghiệm thức 2: Tiêm 50 µg LHRH-A + 5 mg DOM/kg cá.
    • Nghiệm thức 3 (đối chứng): Tiêm 1 ml dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%/kg cá.
    • Giải phẫu kiểm tra mô học và thành phần sinh hóa (protein, lipid, tro, carbohydrate, độ ẩm) của tuyến sinh dục tại các thời điểm: trước khi tiêm, 12 giờ sau tiêm và 24 giờ sau tiêm.

Kỹ thuật thu mẫu, mô học và phân tích hóa sinh

  • Chỉ số sinh học:
    • Hệ số thành thục: $GSI = (GW / BW) \times 100%$ (với $GW$ là khối lượng tuyến sinh dục tính bằng gam, $BW$ là khối lượng thân không nội quan tính bằng gam, theo Qasim 1973 và King 2001).
    • Hệ số gan: $HSI = (HW / BW) \times 100%$ (với $HW$ là khối lượng gan tính bằng gam).
    • Sức sinh sản tuyệt đối (AF, tính theo Laurence & Briand, 1990) và tương đối ($RF = AF / BW$, tính theo King, 2001).
  • Kỹ thuật mô học tuyến sinh dục: Mẫu mô cố định trong dung dịch formaldehyde 10%, rửa nước, rút nước qua chuỗi cồn tăng dần, ngâm methyl salicylate 12 - 24 giờ, đúc trong khối parafin ở 65°C. Cắt lát dày 5 - 7 µm bằng máy cắt vi thể (microtome), dàn lát cắt trong nước ấm 40 - 45°C, sấy khô ở 45 - 60°C trong 1 - 4 giờ. Nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin - Mayer và Eosin (nhuộm HE), làm trong bằng Xylen và gắn lamen bằng keo Baume dán kính. Quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus vật kính 10; đường kính noãn bào được đo bằng trắc vi thị kính trên 15 noãn bào mỗi pha theo công thức $L = 0,1 \times (A / n)$ (với $A$ là số vạch đếm, $n$ là bội giác vật kính).
  • Phương pháp định lượng hormone bằng ELISA: Sử dụng bộ hóa chất EIA Kit của hãng Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, Hoa Kỳ). Mẫu huyết tương (0,5 ml) được chiết tách hai lần bằng diethyl ether (2,5 ml), làm bay hơi dung môi và hoàn nguyên bằng dung dịch đệm EIA. Phản ứng cạnh tranh miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu và chất đánh dấu enzyme acetylcholinesterase (AChE Tracer). Đĩa 96 giếng được ủ, rửa sạch và bổ sung cơ chất Ellman’s Reagent, sau đó đọc mật độ quang ở bước sóng 405 nm trên máy quang phổ Thermo Multiskan EX (Hà Lan).
Thứ tự nồng độ chuẩn Estradiol (pg/ml) Testosterone (pg/ml) 11-KT (pg/ml)
1 4000,0 500,0 250,00
2 1600,0 250,0 125,00
3 640,0 125,0 62,50
4 256,0 62,5 31,30
5 102,4 31,3 15,60
6 41,0 15,6 7,80
7 16,4 7,8 3,90
8 6,6 3,9 1,95
Loại giếng Thể tích đệm ELISA Mẫu chuẩn / Mẫu đo Thể tích Tracer Thể tích Kháng huyết thanh
Blank (Mẫu trắng) - - - -
Total Activity (Hoạt độ tổng) - - 5 µl (bước hiện màu) -
Non-Specific Binding (NSB) 100 µl - 50 µl -
Maximum Binding (Bo) 50 µl - 50 µl 50 µl
Mẫu chuẩn / Mẫu thử - 50 µl 50 µl 50 µl

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh kinh tế - kỹ thuật của ngành nuôi trồng thủy sản theo định hướng Chiến lược phát triển thủy sản đến năm 2030 (Quyết định 339/QĐ-TTg). Nêu rõ những hạn chế trong việc làm chủ sinh sản nhân tạo cá biển nói chung và cá dìa Siganus guttatus nói riêng. Xác định mục tiêu nghiên cứu làm rõ cơ chế biến động hormone steroid huyết tương (E2, T, 11-KT) trong chu kỳ sinh sản và dưới tác động của các kích dục tố tổng hợp làm luận cứ cho sản xuất giống nhân tạo.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các kiến thức nền tảng và lịch sử nghiên cứu liên quan đến đề tài:

  • Sinh học cá dìa: Phân loại, phân bố địa lý nhiệt đới (vĩ độ 30°Bắc đến 30°Nam), khả năng chịu mặn rộng (từ 5‰ đến nước biển khơi), biên độ nhiệt 24 - 34°C, ngưỡng oxy hòa tan > 2 mg/l. Dinh dưỡng từ ăn động vật phù du ở giai đoạn ấu trùng chuyển dần sang ăn thực vật thủy sinh ở giai đoạn cá con và trưởng thành. Quá trình phát triển phôi trải qua 9 pha chính với đường kính trứng thụ tinh 0,56 ± 0,008 mm.
  • Sinh lý và giải phẫu mô học tuyến sinh dục: Chi tiết hóa cấu trúc buồng trứng qua 6 giai đoạn thành thục và 6 phase phát triển của noãn bào (từ phase 1 biến đổi nhân, phase 2 tiền ngoại vi nhân, phase 3 ngoại vi nhân với hạch nhân 5 - 7,5 µm, phase 4 không bào hóa kích thước 5 - 38 µm, phase 5 tích lũy hạt noãn hoàng, đến phase 6 cực hóa và rụng trứng). Tinh sào và tinh bào được phân loại qua 6 giai đoạn phát triển và 4 thời kỳ phân chia (sinh sản, sinh trưởng, thành thục, biệt hóa tạo tinh thể).
  • Cơ chế nội tiết sinh sản và các chế phẩm kích dục tố: Vai trò của trục thần kinh thể dịch GnRH – Tuyến yên (FSH, LH) – Tuyến sinh dục; vai trò của thụ thể màng, men aromatase và men cathepsin D trong quá trình phân giải VTG ở cá. Tổng kết việc sử dụng kích dục tố ngoại sinh: lịch sử từ Giáo sư Houssay (1930); đặc tính sinh học của hCG (peptide phân tử lớn, tác dụng nhanh nhưng có khả năng sinh kháng thể sau tiêm lặp lại); cơ chế tác dụng của GnRH-A kết hợp chất kháng dopamine (phương pháp LinPe) như Ovaprim (sGnRH-A + Domperidone) hoặc Ovopel (LHRH-A + Metoclopramide); và khả năng ứng dụng các steroid C21 trong kích thích rụng trứng.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày thiết kế nghiên cứu thực nghiệm tại Cam Ranh (Khánh Hòa) và các phòng thí nghiệm thuộc Trường Đại học Nha Trang từ 5/2017 đến 5/2021:

  • Mô tả chi tiết đặc điểm đàn cá bố mẹ tuổi 1+, điều kiện môi trường ao nuôi đất 100 m² và bể xi măng 4 m³.
  • Trình bày giao thức bố trí 3 nội dung thí nghiệm kiểm tra biến động tự nhiên của steroid theo tháng và động học tiết steroid tại 6, 12, 24, 48 giờ sau khi tiêm hCG (1.500 IU/kg) và LHRH-A + DOM (50 µg + 5 mg/kg).
  • Mô tả quy trình giải phẫu xác định chỉ số GSI, HSI, sức sinh sản tuyệt đối và tương đối.
  • Quy trình kỹ thuật 5 bước làm tiêu bản mô học nhuộm Hematoxylin - Mayer và Eosin (cố định formol 10%, đúc sáp parafin ở 65°C, cắt lát 5 - 7 µm, nhuộm và gắn keo Baume).
  • Quy trình phân tích định lượng E2, T, 11-KT bằng phương pháp ELISA cạnh tranh với bộ kit Cayman Chemical, chiết tách bằng dung môi diethyl ether và đọc mật độ quang tại 405 nm trên thiết bị Thermo Multiskan EX.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương kết quả tập trung giải quyết 3 nội dung khoa học chính đã đề ra:

  • Nội dung 1: Biến động hormone steroid tự nhiên và sự phát triển tuyến sinh dục: Phân tích tương quan giữa nồng độ E2 ở cá cái, nồng độ T và 11-KT ở cá đực trong huyết tương với sự thay đổi của hệ số thành thục GSI, hệ số gan HSI và các giai đoạn phát triển mô học buồng trứng, tinh sào qua các tháng trong chu kỳ sinh sản.
  • Nội dung 2: Ảnh hưởng của kích dục tố ngoại sinh lên hàm lượng E2 và T: Ghi nhận động lực học biến thiên nồng độ E2 và T huyết tương ở cá dìa cái tại các mốc thời gian 6, 12, 24 và 48 giờ sau khi can thiệp bằng hCG liều 1.500 IU/kg hoặc LHRH-A (50 µg/kg) kết hợp Domperidone (5 mg/kg) so với lô đối chứng.
  • Nội dung 3: Thay đổi sinh lý sinh sản và thành phần hóa sinh tuyến sinh dục: Xác định những biến đổi về tỷ lệ thành thục, cấu trúc mô học buồng trứng, tinh sào cùng sự biến thiên hàm lượng protein, lipid, tro, carbohydrate và độ ẩm của tuyến sinh dục trước khi tiêm và tại các thời điểm 12 giờ, 24 giờ sau khi tiêm kích dục tố.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống về quy luật biến động hàm lượng các hormone steroid sinh dục chính (Estradiol 17-β, Testosterone, 11-Ketotestosterone) trong huyết tương cá dìa Siganus guttatus theo chu kỳ sinh sản tự nhiên trong điều kiện nuôi giữ nhân tạo tại vùng biển Nam Trung Bộ.
  • Xác lập mối tương quan giữa sự thay đổi nồng độ hormone steroid huyết tương với chu kỳ phát triển mô học tuyến sinh dục, hệ số thành thục (GSI) và hệ số gan (HSI).
  • Làm sáng tỏ động học tiết hormone steroid (E2, T) và sự biến đổi các thành phần sinh hóa (protein, lipid, carbohydrate, khoáng, ẩm) của buồng trứng và tinh sào cá dìa dưới tác động của hai loại kích thích tố ngoại sinh phổ biến là hCG và LHRH-A kết hợp chất kháng dopamine (DOM).

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

  • Cung cấp cơ sở khoa học để xác định thời điểm thành thục sinh dục tối ưu, phục vụ việc tuyển chọn đàn cá bố mẹ đưa vào kích thích sinh sản.
  • Cung cấp dữ liệu định lượng về liều lượng và thời gian đáp ứng nội tiết của kích dục tố ngoại sinh: hỗ trợ xây dựng và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật kích thích sinh sản nhân tạo cá dìa bằng liệu pháp tiêm 1.500 IU hCG/kg hoặc phối hợp 50 µg LHRH-A + 5 mg DOM/kg cá.
  • Kết quả nghiên cứu cung cấp tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu sinh lý sinh sản cá biển và tài liệu giảng dạy chuyên ngành Nuôi trồng Thủy sản ở bậc đại học và sau đại học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Các thí nghiệm được tiến hành trên đàn cá nuôi nhốt tại một vùng địa lý cụ thể (Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa) trong điều kiện ao đất và bể xi măng, do đó các chỉ số sinh lý nội tiết phản ánh điều kiện môi trường nhân tạo tại khu vực nghiên cứu.
    • Việc theo dõi phản ứng nội tiết sau tiêm hormone ngoại sinh được giới hạn ở các mốc thời gian gián đoạn (6, 12, 24 và 48 giờ) và tập trung vào hai chỉ tiêu steroid E2, T cùng biến đổi sinh hóa buồng trứng, tinh sào ở mốc 12 và 24 giờ.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục mở rộng đánh giá sự biến động của các hormone gây chín (MIS như 17α,20β-P hoặc 20β-S) tại thời điểm sát thời điểm rụng trứng và đẻ trứng thực tế.
    • Nghiên cứu ứng dụng các kết quả nội tiết học sinh sản để nâng cao tỷ lệ sống và chất lượng ấu trùng cá dìa ở quy mô sản xuất giống hàng hóa công nghiệp.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo:
    • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Nuôi trồng Thủy sản, Sinh học biển, Sinh lý học động vật.
    • Cán bộ nghiên cứu tại các viện, trường chuyên ngành thủy sản.
    • Kỹ thuật viên, cán bộ quản lý trại sản xuất giống hải sản tại các tỉnh ven biển.
  • Nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn:
    • Quy trình chiết tách steroid bằng dung môi diethyl ether và phương pháp định lượng nồng độ hormone E2, T, 11-KT bằng kỹ thuật ELISA cạnh tranh trên máy đọc đĩa quang học 96 giếng.
    • Quy trình kỹ thuật xử lý mô học tuyến sinh dục (cố định formol, đúc parafin ở 65°C, cắt lát 5 - 7 µm, nhuộm HE) và bảng phân loại 6 giai đoạn buồng trứng, tinh sào cá dìa.
    • Số liệu thực nghiệm về phản ứng của cá dìa đối với liều tiêm hCG và LHRH-A kết hợp DOM, phục vụ việc thiết kế phác đồ kích thích sinh sản thực tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước noãn bào cá dìa tối thiểu để đáp ứng với kích thích sinh sản được ghi nhận là bao nhiêu?

Theo công trình của Ayson (1991) được tổng quan trong luận án, kích thước noãn bào tối thiểu để cá dìa cái có thể tự đẻ mà không cần tiêm hormone là 0,46 mm. Đối với những cá cái có noãn bào nhỏ hơn hoặc bằng 0,45 mm (hoặc ≤ 0,43 mm), việc can thiệp bằng hormone kích thích (như hCG liều 2.000 IU/kg) là cần thiết để cảm ứng quá trình thành thục và rụng trứng.

2. Liều lượng hCG và LHRH-A được sử dụng trong các thí nghiệm của luận án là bao nhiêu?

Trong các thí nghiệm kiểm tra biến động hormone và sinh lý sinh hóa tuyến sinh dục, luận án thiết lập liều tiêm:

  • Nghiệm thức hCG: 1.500 IU/kg cá.
  • Nghiệm thức LHRH-A: 50 µg LHRH-A kết hợp 5 mg Domperidone (DOM)/kg cá.
  • Nghiệm thức đối chứng: Tiêm 1 ml dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%/kg cá.

3. Phương pháp định lượng các hormone steroid trong huyết tương cá dìa được tiến hành như thế nào?

Hàm lượng các hormone Estradiol 17-β (E2), Testosterone (T) và 11-Ketotestosterone (11-KT) được xác định bằng phương pháp miễn dịch liên kết enzyme (ELISA cạnh tranh), sử dụng bộ EIA Kit của hãng Cayman Chemical Company. Mẫu huyết tương (0,5 ml) được chiết tách hai lần bằng diethyl ether (2,5 ml), làm bay hơi dung môi, hoàn nguyên với dung dịch đệm EIA, phản ứng với kháng huyết thanh và chất đánh dấu enzyme acetylcholinesterase (AChE Tracer), phát hiện bằng cơ chất Ellman’s Reagent và đo mật độ quang ở bước sóng 405 nm trên máy Thermo Multiskan EX.

4. Quá trình phát triển phôi cá dìa trải qua các giai đoạn nào và kéo dài bao lâu?

Theo dẫn liệu của Kohno và cộng sự (1986), thời gian phát triển phôi cá dìa kéo dài 18 - 20 giờ ở nhiệt độ 26 - 28°C với trứng thụ tinh có đường kính 0,56 ± 0,008 mm. Quá trình phát triển gồm các mốc: giai đoạn 8 tế bào (sau 30 phút), giai đoạn 32 tế bào (sau 70 phút), giai đoạn túi phôi (sau 85 phút), giai đoạn lá phôi (sau 2 giờ), giai đoạn bì phôi (sau 5 giờ 45 phút), giai đoạn thân phôi (sau 7 giờ), giai đoạn 6 đốt sống (sau 7 giờ 40 phút), giai đoạn 16 đốt sống (sau 11 giờ 20 phút), và giai đoạn 24 đốt sống (sau 13 giờ).

Kết luận

Luận án đã giải quyết mục tiêu làm rõ sự biến động hàm lượng các hormone steroid sinh dục chính (E2, T, 11-KT) trong huyết tương cá dìa Siganus guttatus theo chu kỳ sinh sản tự nhiên và dưới tác động của các chế phẩm kích dục tố ngoại sinh (hCG, LHRH-A kết hợp DOM). Công trình kết hợp giữa phân tích nội tiết học bằng kỹ thuật ELISA, giám sát mô thái học tuyến sinh dục qua các giai đoạn phát triển và định lượng các biến đổi sinh hóa buồng trứng, tinh sào trong điều kiện nuôi nhốt tại Cam Ranh, Khánh Hòa. Các kết quả thu được cung cấp hệ thống dữ liệu sinh học sinh sản quan trọng, đóng góp cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc kiểm soát quá trình thành thục và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất giống nhân tạo loài cá này tại Việt Nam.