Luận văn thạc sĩ toxicological effect and histopathological alterations on fish after insecticide active compound contamination

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu toxicological effect and histopathological alterations on fish after insecticide active compound, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Đồng Thị Linh Chi
• Người hướng dẫn: Dr. Ho Ngọc Sơn
• Trường học: Thai Nguyen University
• Chuyên ngành: Environmental Science and Management
• Đề tài: Ảnh Hưởng Độc Học Và Thay Đổi Mô Bệnh Học Trên Cá Sau Nhiễm Hợp Chất Hoạt Tính Thuốc Trừ Sâu
• Loại tài liệu: bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• ABSTRACT
• TABLE OF CONTENTS
• 1. BACKGROUND AND RATIONALE
• 2. RESEARCH QUESTIONS AND HYPOTHESES
• 2.1. Research questions
• 2.2. Hypotheses
• 3. LIMITATIONS
• 4. PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF DELTAMETHRIN
• 5. TOXIC EFFECTS OF DELTAMETHRIN ON ORGANISMS
• 5.1. Toxicity
• 5.2. Histopathological Effects
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES

Tóm tắt

I. Ảnh hưởng độc học của deltamethrin trên cá

Ảnh hưởng độc học của deltamethrin, một hợp chất hoạt tính thuộc nhóm thuốc trừ sâu pyrethroid, đã được nghiên cứu trên cá Clarias batrachus. Cá được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của deltamethrin (1 ml/L, 1.75 ml/L, 2 ml/L, và 2.5 ml/L) trong 96 giờ. Kết quả cho thấy độc tính của deltamethrin gây ra các thay đổi đáng kể trong cấu trúc mô của mang, gan và tim. Các biểu hiện bao gồm viêm các lá mang chính, bong tróc các lá mang thứ cấp, xâm nhập mỡ vào gan, thoái hóa tế bào gan, và phù nề cơ tim. Những thay đổi này phụ thuộc vào nồng độ deltamethrin, với nồng độ càng cao, tổn thương càng nghiêm trọng.

1.1. Tác động lên mang cá

Mang cá là cơ quan chịu ảnh hưởng nặng nề nhất từ độc tính của deltamethrin. Các thay đổi mô bệnh học bao gồm viêm các lá mang chính và bong tróc các lá mang thứ cấp. Những tổn thương này làm giảm khả năng hô hấp của cá, dẫn đến suy giảm sức khỏe cá và tăng nguy cơ tử vong.

1.2. Tác động lên gan cá

Gan cá cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi deltamethrin. Các biểu hiện mô bệnh học bao gồm xâm nhập mỡ, thoái hóa tế bào gan và giãn nở xoang gan. Những thay đổi này làm suy giảm chức năng gan, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và giải độc của cá.

II. Thay đổi mô bệnh học trên cá sau nhiễm độc

Thay đổi mô bệnh học trên cá Clarias batrachus sau khi tiếp xúc với deltamethrin đã được ghi nhận rõ ràng. Các tổn thương mô học được quan sát thấy ở mang, gan và tim cá. Những thay đổi này không chỉ phản ánh độc tính của deltamethrin mà còn là dấu hiệu cảnh báo sớm về tác động của hóa chất độc hại lên sinh thái và môi trường nước.

2.1. Tác động lên tim cá

Tim cá cũng không ngoại lệ khi bị ảnh hưởng bởi deltamethrin. Các biểu hiện mô bệnh học bao gồm phù nề cơ tim, tách sợi cơ và xâm nhập tế bào máu. Những thay đổi này làm suy giảm chức năng tim, ảnh hưởng đến tuần hoàn và sức khỏe tổng thể của cá.

2.2. Ứng dụng trong nghiên cứu độc tính

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở quan trọng cho việc sử dụng phân tích độc học và mô bệnh học như các công cụ giám sát sinh học. Những thay đổi mô học có thể được sử dụng như các biomarker để đánh giá tác động của hóa chất độc hại lên cá nước ngọt và cá nước mặn.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về ảnh hưởng độc học và thay đổi mô bệnh học trên cá sau nhiễm hợp chất hoạt tính thuốc trừ sâu có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá tác động của hóa chất độc hại lên môi trường nước và sinh thái. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng để phát triển các biện pháp quản lý và giảm thiểu tác động của thuốc trừ sâu lên hệ sinh thái thủy sinh.

3.1. Giám sát môi trường nước

Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc giám sát môi trường nước để phát hiện sớm các hóa chất độc hại như deltamethrin. Việc sử dụng các biomarker mô học có thể giúp đánh giá nhanh chóng và chính xác tác động của các chất độc lên cá nước ngọt và cá nước mặn.

3.2. Ứng dụng trong quản lý nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu cũng có thể được áp dụng trong quản lý nông nghiệp, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu có độc tính cao như deltamethrin. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe cá mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho con người.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong những năm gần đây, thuốc trừ sâu được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, lâm nghiệp, thú y và y tế công cộng, dẫn đến sự gia tăng nồng độ các hóa chất độc hại trong môi trường nước. Cá là nguồn thực phẩm thiết yếu của con người nhưng lại dễ bị phơi nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp qua nguồn nước ô nhiễm. Sự tích tụ hóa chất trong mô cá không chỉ gây chết hàng loạt và làm suy giảm năng suất thủy sản mà còn đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc.

Deltamethrin là một loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm pyrethroid tổng hợp loại II có phổ tác dụng rộng, được ứng dụng phổ biến để kiểm soát sâu bệnh hại cây trồng và côn trùng truyền bệnh. Hoạt chất này xâm nhập vào hệ sinh thái nước qua dòng chảy tràn bề mặt, xói mòn đất và sự trôi dạt từ các đợt phun thuốc trên không. Mặc dù pyrethroid ít độc hơn đối với động vật có vú do thân nhiệt cao, kích thước cơ thể lớn và độ nhạy cảm của các vị trí kênh ion thấp hơn, nhưng deltamethrin lại thể hiện độc tính rất cao đối với các loài thủy sinh, đặc biệt là cá và động vật không xương sống đáy. Sự phơi nhiễm deltamethrin gây ra các tổn thương vi cấu trúc tại các cơ quan đích, dẫn đến căng thẳng sinh lý và rối loạn chức năng trao đổi chất.

Đề tài khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá ảnh hưởng độc học của hoạt chất deltamethrin lên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở giai đoạn cá con, đồng thời xác định các biến đổi mô bệnh học trên ba cơ quan đích gồm mang, gan và tim ở các nồng độ phơi nhiễm khác nhau.
2. Câu hỏi nghiên cứu:
   • Deltamethrin tác động như thế nào đến vi cấu trúc mang của cá trê trắng (Clarias batrachus)?
   • Deltamethrin tác động như thế nào đến cấu trúc mô học gan của cá trê trắng (Clarias batrachus)?
   • Deltamethrin tác động như thế nào đến cấu trúc mô học tim của cá trê trắng (Clarias batrachus)?
3. Giả thuyết nghiên cứu:
   • Giả thuyết 1: $H_0$ (Không có biến đổi mô bệnh học ở mang sau phơi nhiễm) đối nghịch với $H_A$ (Sự phơi nhiễm deltamethrin gây biến đổi mô bệnh học ở mang cá Clarias batrachus).
   • Giả thuyết 2: $H_0$ (Không có biến đổi mô bệnh học ở gan sau phơi nhiễm) đối nghịch với $H_A$ (Sự phơi nhiễm deltamethrin gây biến đổi mô bệnh học ở gan cá Clarias batrachus).
   • Giả thuyết 3: $H_0$ (Không có biến đổi mô bệnh học ở tim sau phơi nhiễm) đối nghịch với $H_A$ (Sự phơi nhiễm deltamethrin gây biến đổi mô bệnh học ở tim cá Clarias batrachus).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cá trê trắng con (Clarias batrachus fingerlings) và dung dịch thuốc trừ sâu chứa hoạt chất deltamethrin (chế phẩm thương mại Decis®).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được triển khai tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Giải phẫu bệnh học (Bệnh viện Công Dr. Mohammad Hoesin), Phòng thí nghiệm Nuôi trồng Thủy sản và Phòng thí nghiệm Độc học Thuốc trừ sâu thuộc Đại học Sriwijaya (Indralaya và Palembang, Indonesia).
• Phạm vi thời gian: Thực nghiệm được tiến hành trong thời gian 3 tháng, từ tháng 03/2015 đến tháng 06/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và đặc tính hóa lý của hoạt chất

Deltamethrin có tên hóa học theo IUPAC là (1R,3R) [$\alpha$-cyano(3-phenoxyphenyl)methyl] 3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate, công thức phân tử $\text{C}{22}\text{H}{19}\text{Br}_2\text{NO}_3$, khối lượng phân tử 505.053 g/mol, số đăng ký CAS 52918-63-5. Đây là hoạt chất bền quang học thuộc nhóm pyrethroid loại II mang nhóm thế $\alpha$-cyano-3-phenoxybenzyl. Cơ chế gây độc thần kinh của deltamethrin là can thiệp và làm chậm quá trình đóng cổng kích hoạt của kênh ion natri ($\text{Na}^+$) trên màng sợi trục thần kinh, kéo dài pha khử cực và tác động lên các thụ thể GABA.

Thông số đặc tính	Giá trị / Đặc tính chi tiết
Tên thương mại	Butoflin®, Butox®, Decis®, K-Othrin®, K-Othrine® Dust, Striker®
Trạng thái vật lý	Bột tinh thể màu trắng đến be
Khối lượng riêng	$0.5\text{ g/mL}$ ở $20^\circ\text{C}$ (nguyên chất kỹ thuật); Decis®: dung dịch lỏng
Độ tan	Hòa tan trong acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, toluene ($23\text{--}39%$); hầu như không tan trong nước ($< 0.2\text{ ppb}$ trong 24 giờ)
Áp suất hơi	$1.5 \times 10^{-8}\text{ mmHg}$ ở $25^\circ\text{C}$ ($>90%$ hoạt chất)
Hệ số phân bố Octanol/Nước ($\log K_{ow}$)	$2.7 \times 10^5$ ở $25^\circ\text{C}$ (tính ưa lipid cao)
Hằng số Định luật Henry	$2.7 \times 10^{-6}\text{ atm}\cdot\text{m}^3/\text{mole}$
Độ pH	5.9 (trong hệ phân tán nước 1%)

Theo thang phân loại độc tính cấp tính của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA), deltamethrin đối với cá và động vật không xương sống thủy sinh có giá trị $\text{LC}_{50} < 0.1\text{ mg/L}$, thuộc nhóm có độc tính cực cao (Very highly toxic).

Phương pháp bố trí thực nghiệm độc học

• Quy mô mẫu: Tổng cộng 60 cá thể cá trê trắng (Clarias batrachus) được chọn ngẫu nhiên, chia đều vào 12 bể thí nghiệm chứa 15 lít nước (mật độ 5 con/bể).
• Thiết kế thí nghiệm: Phương pháp nhúng phơi nhiễm cấp tính (immersion test). Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 2 lần (duplicate). Trong suốt quá trình thử nghiệm độc tính cấp tính, cá hoàn toàn không được cho ăn.
• Dải nồng độ thử nghiệm: Nhóm đối chứng ($0.0\text{ mL/L}$) và 5 nhóm nồng độ deltamethrin gồm $1.0\text{ mL/L}$, $1.5\text{ mL/L}$, $1.75\text{ mL/L}$, $2.0\text{ mL/L}$ và $2.5\text{ mL/L}$.
• Thu thập mẫu mô: Cá sau khi chết do nhiễm độc được vớt ra ngay lập tức, tiến hành giải phẫu tách lấy toàn bộ mang, tim và gan để chuyển sang quy trình xử lý mô học.

Quy trình kỹ thuật xử lý mô học và nhuộm bệnh học

Quy trình chuẩn bị tiêu bản vi thể phục vụ kính hiển vi quang học tuân thủ kỹ thuật mô học chuẩn:

1. Cố định mẫu (Fixation): Mẫu mô mang, gan, tim của cá nhóm đối chứng và nhóm phơi nhiễm được cố định ngay trong dung dịch đệm formaldehyde trung tính 10% ($\text{pH} = 7.0$). Thể tích mô lấy không vượt quá 1/10 thể tích dung dịch cố định.
2. Khử nước và đúc khuôn (Tissue Processing): Mô được khử nước qua chuỗi cồn ethanol tăng dần ($30%$, $50%$, $70%$, $80%$, $90%$, $95%$, cồn tuyệt đối, mỗi nồng độ 1 giờ), chuyển qua hỗn hợp cồn tuyệt đối - xylene (tỉ lệ 1:1 trong 30 phút), ngâm trong acetone 1 giờ để khử nước hoàn toàn, làm trong bằng xylene, sau đó ngâm qua đêm trong hỗn hợp xylene và sáp paraffin. Cuối cùng, mẫu được đúc khối trong sáp paraffin có nhiệt độ nóng chảy $60\text{--}62^\circ\text{C}$.
3. Cắt lát mô (Sectioning): Sử dụng máy cắt vi thể quay (Rotary Microtome - Shandon Finesse 325) cắt khối mô thành các lát cắt có độ dày $5\ \mu\text{m}$. Các lát cắt được làm phẳng trên bể nước ấm (Tissue floating bath), gắn lên lam kính sạch đã phết lòng trắng trứng Mayer và sấy khô trên bàn sấy tiêu bản (Slide Warmer - LAB Line Barnstead 26025) ở $50^\circ\text{C}$ trong 30 phút.
4. Nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E): Tiêu bản được hòa tan paraffin bằng xylene, bù nước qua chuỗi cồn giảm dần ($95% \to 30%$), rửa nước chảy, nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxylin trong 10 phút (nhân bắt màu xanh lam), rửa nước và nhuộm bào tương bằng Eosin từ 15 giây đến 5 phút (bào tương bắt màu hồng). Sau đó, tiêu bản được khử nước qua cồn tăng dần, làm trong qua xylene và gắn lamen bằng chất gắn Dibutyl Phthalate Xylene (DPX).
5. Quan sát và chụp ảnh: Tiêu bản được soi dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS BX51 có gắn camera chuyên dụng ở các độ phóng đại x200 và x400.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu (Introduction)

Chương này thiết lập cơ sở lý luận về tác động tiêu cực của hóa chất bảo vệ thực vật đối với hệ sinh thái thủy vực, phân tích đường xâm nhập của deltamethrin vào nước và sự nhạy cảm của cá. Tác giả xác định rõ mục tiêu nghiên cứu là làm sáng tỏ độc tính và các thương tổn mô bệnh học của ba cơ quan quan trọng (mang, gan, tim) trên loài cá trê đi bộ (Clarias batrachus). Hệ thống 3 câu hỏi nghiên cứu và 3 cặp giả thuyết kiểm định thống kê ($H_0/H_A$) được xây dựng làm kim chỉ nam cho thực nghiệm. Ngoài ra, tác giả nêu rõ hạn chế hiện tại của y văn là sự thiếu hụt các nghiên cứu thực nghiệm về tổn thương mô cơ tim cá dưới tác động của deltamethrin.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 tổng hợp toàn diện các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến:

• Đặc tính lý hóa và cơ chế tác động: Deltamethrin có tính ưa mỡ cao ($\log K_{ow} = 2.7 \times 10^5$), không phân ly trong nước, độ bay hơi thấp, bền vững trong môi trường axit hơn môi trường kiềm (chu kỳ bán rã 2.5 ngày ở pH 9). Cơ chế tác động lên thụ thể thần kinh và sự cố định kênh natri.
• Độc tính trên các nhóm sinh vật: Đánh giá độc tính trên động vật có vú (chuột cống có $\text{LD}{50}$ qua miệng từ trung bình đến cao), chim ($\text{LD}{50} > 4640\text{ mg/kg}$ trên vịt trời, ít độc), ong mật ($\text{LD}_{50} = 51\text{ ng/con}$, cực độc trong phòng thí nghiệm), và động vật thủy sinh.
• Độc tính cấp tính trên các loài cá: So sánh giá trị $48\text{h-LC}{50}$ hoặc $96\text{h-LC}{50}$ giữa các loài: cá hồi vân Oncorhynchus mykiss ($0.5\ \mu\text{g/L}$), cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idella ($96.0\ \mu\text{g/L}$), cá trê phi Clarias gariepinus ($40.0\ \mu\text{g/L}$), cá bảy màu Poecilia reticulata ($5.13\ \mu\text{g/L}$), cá Cryptoheros nigrofasciatus ($0.39\text{ ppm}$).
• Các nghiên cứu mô bệnh học tiền nhiệm: Phân tích các phát hiện mô bệnh học của Cengiz (2006) trên cá chép Cyprinus carpio; Yildirim (2006) trên cá rô phi Oreochromis niloticus; Hedayati & Tarkhani (2014) trên cá tra Pangasius hypophthalmus; Chargui et al. (2012) trên chuột Wistar; Al-Ghanbousi et al. (2012) trên cá Aphanius dispar; Cengiz & Unlu (2006) trên cá ăn muỗi Gambusia affinis.
• Đặc điểm sinh học loài kiểm định: Hệ thống phân loại, phân bố, hình thái giải phẫu của cá trê trắng (Clarias batrachus), loài cá nước ngọt bản địa Đông Nam Á có cơ quan hô hấp phụ và khả năng di chuyển trên cạn.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp (Materials and Methods)

Trình bày chi tiết không gian, thời gian, thiết bị và hóa chất sử dụng. Mô tả tường tận các bước thao tác thực nghiệm từ chuẩn bị dung dịch hóa chất Decis®, quy trình phân chia bể nuôi, kiểm soát điều kiện nhúng phơi nhiễm cấp tính cho 60 cá thể cá trê con, kỹ thuật giải phẫu tách mô đích, quy trình xử lý mô, đúc khối sáp, cắt lát vi thể $5\ \mu\text{m}$ và quy trình nhuộm H&E.

Chương 4: Kết quả nghiên cứu (Results)

Chương này mô tả chi tiết các kết quả quan sát cấu trúc mô học bình thường và biến đổi bệnh lý dưới kính hiển vi quang học:

• Biến đổi mô học ở mang:
  • Đối chứng: Cấu trúc mang bình thường gồm phiến mang sơ cấp (primary lamellae - PL), phiến mang thứ cấp (secondary lamellae - SL), tế bào biểu mô (epithelial cell - EC) và tế bào tiết nhầy (mucous cell - MC).
  • Nhiễm $1.0\text{ mL/L}$: Xuất hiện viêm (inflammation - In) ở cả phiến sơ cấp và thứ cấp, bong tróc biểu mô (desquamation - Des) ở phiến thứ cấp.
  • Nhiễm $1.5\text{ mL/L}$: Viêm, bong tróc biểu mô thứ cấp, kèm theo phân rã đứt gãy (disintegration - Dis) và xuất huyết (haemorrhage - Hr) ở phiến sơ cấp.
  • Nhiễm $1.75\text{ mL/L}$: Phân rã ở đỉnh phiến sơ cấp, viêm và bong tróc phiến thứ cấp diện rộng.
  • Nhiễm $2.0\text{ mL/L}$: Viêm, thoái hóa (degeneration - De), bong tróc biểu mô và xuất hiện hiện tượng uốn cong đầu phiến thứ cấp (curling bend - C).
  • Nhiễm $2.5\text{ mL/L}$: Tổn thương nghiêm trọng nhất với co rút phiến sơ cấp (shrinkage - Sk), tăng sinh biểu mô (hyperplasia - Hs), uốn cong phiến mang, lớp vách biểu mô bị phá hủy hoàn toàn, chỉ còn trơ lại các tế bào trụ (pillar cells).
• Biến đổi mô học ở gan:
  • Đối chứng: Khối tế bào gan (hepatocytes - H) liên tục xếp thành các dây tế bào quanh tĩnh mạch trung tâm (central vein - CV), xen kẽ bởi các xoang mạch (sinusoids - BS) và tế bào Kupffer (Küffer cells - KC).
  • Nhiễm $1.0\text{ mL/L}$: Xuất hiện các không bào mỡ nhỏ, thoái hóa mỡ (fatty degeneration - FD) và teo tế bào gan (atrophy - A).
  • Nhiễm $1.5\text{ mL/L}$: Giãn xoang tĩnh mạch gan (sinusoidal dilatation - SD), thoái hóa tế bào gan (D) và không bào hóa bào tương (vacuolization - V).
  • Nhiễm $1.75\text{ mL/L}$: Thoái hóa mỡ (FD) lan rộng và phân rã hoại tử tế bào (cellular degradation - CD).
  • Nhiễm $2.0\text{ mL/L}$: Tích tụ các giọt mỡ lớn trong tế bào gan, thoái hóa tế bào gan và giãn xoang mao mạch nặng.
  • Nhiễm $2.5\text{ mL/L}$: Thoái hóa mỡ nghiêm trọng, xung huyết mạch máu (vessel congestion - VC/CV) và teo đay tế bào gan diện rộng.
• Biến đổi mô học ở tim:
  • Đối chứng: Các bó cơ tim (cardiac muscle - CM) và nhân tế bào (nucleus - N) có cấu trúc đều đặn, nguyên vẹn.
  • Nhiễm $1.0\text{ mL/L}$: Bắt đầu xuất hiện thâm nhiễm tế bào máu (infiltration of blood cells - I), phù nề (edema - E) giữa các bó cơ và hiện tượng tách sợi cơ tim (splitting of muscle fibers - SF).
  • Nhiễm $1.5\text{ mL/L} \to 1.75\text{ mL/L}$: Khoảng cách giữa các bó cơ tim giãn rộng do phù nề nặng, tách sợi cơ và teo bó cơ tim (atrophy - A) biểu hiện rõ rệt.
  • Nhiễm $2.0\text{ mL/L} \to 2.5\text{ mL/L}$: Sự phân tách, đứt gãy và thoái hóa sợi cơ tim nghiêm trọng, kèm theo thâm nhiễm tế bào máu và teo cơ lan tỏa.

Chương 5: Thảo luận và kết luận (Discussion and Conclusion)

Tác giả thảo luận sâu về cơ chế sinh bệnh lý trên từng cơ quan:

• Tổn thương mang trực tiếp làm suy giảm diện tích tiếp xúc, cản trở quá trình trao đổi khí và rối loạn điều hòa áp suất thẩm thấu/ion.
• Gan là cơ quan khử độc chính, tính ưa mỡ của deltamethrin làm gián đoạn chuyển hóa lipid nội bào, gây ứ đọng mỡ (thoái hóa mỡ) và thiếu hụt oxy mô dẫn đến thoái hóa tế bào.
• Tổn thương cơ tim (phù nề, tách sợi) được giải thích thông qua cơ chế ức chế kênh natri phụ thuộc điện thế Nav1.5 trên cơ tim của pyrethroid nhóm II.
• Kết luận khẳng định độc tính nghiêm trọng của deltamethrin và đưa ra các khuyến nghị về quản lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các biến đổi mô bệnh học theo nồng độ phơi nhiễm

Cơ quan	Nồng độ ($0.0\text{ mL/L}$)	Nồng độ $1.0\text{--}1.5\text{ mL/L}$	Nồng độ $1.75\text{--}2.0\text{ mL/L}$	Nồng độ $2.5\text{ mL/L}$
Mang (Gills)	Cấu trúc phiến sơ cấp, thứ cấp và tế bào biểu mô nguyên vẹn	Viêm (In), bong tróc biểu mô thứ cấp (Des), phân rã (Dis), xuất huyết (Hr)	Viêm, phân rã đỉnh phiến sơ cấp, thoái hóa (De), uốn cong phiến mang (C)	Tăng sinh (Hs), co rút phiến sơ cấp (Sk), biểu mô bị phá hủy hoàn toàn, chỉ còn tế bào trụ
Gan (Liver)	Dây tế bào gan xếp đều quanh tĩnh mạch trung tâm, xoang mạch bình thường	Teo tế bào gan (A), thoái hóa mỡ (FD), giãn xoang mạch (SD), không bào hóa (V)	Tích tụ hạt mỡ, thoái hóa tế bào gan (D), phân rã tế bào (CD), giãn xoang mạch	Thoái hóa mỡ diện rộng (FD), xung huyết mạch máu nghiêm trọng (VC), teo tế bào gan
Tim (Heart)	Bó cơ tim và nhân tế bào bình thường, liên kết chặt chẽ	Phù nề (E), tách sợi cơ tim (SF), thâm nhiễm tế bào máu (I)	Khoảng cách cơ tim giãn rộng, tách sợi cơ rõ rệt, teo bó cơ tim (A)	Tách sợi cơ nghiêm trọng, thoái hóa sợi cơ, thâm nhiễm máu và teo cơ lan tỏa

Đóng góp khoa học của đề tài

1. Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về mô tim cá: Đề tài đã cung cấp các bằng chứng mô bệnh học vi thể đầu tiên về tác động phá hủy của deltamethrin đối với mô cơ tim của loài cá trê trắng (Clarias batrachus), một mảng dữ liệu còn thiếu hụt trong các nghiên cứu trước đó vốn chỉ tập trung vào mang, gan hoặc thận.
2. Khẳng định giá trị của chỉ thị sinh học mô bệnh học: Nghiên cứu chứng minh rằng phân tích mô bệnh học là công cụ nhạy bén, đáng tin cậy (biomarker) để cảnh báo sớm mức độ ô nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật trong môi trường nước.
3. Mối tương quan nồng độ - đáp ứng: Chứng minh mức độ tổn thương mô học tỷ lệ thuận trực tiếp với nồng độ phơi nhiễm deltamethrin; phơi nhiễm ở nồng độ cao gây chết nhanh chóng ở cá thử nghiệm.

Đề xuất và giải pháp của tác giả

• Cần xây dựng các quy chuẩn, quy định nghiêm ngặt hơn nhằm ngăn chặn tình trạng sử dụng thuốc trừ sâu bừa bãi trong nông nghiệp và y tế.
• Hạ thấp ngưỡng nồng độ cho phép của deltamethrin xả thải vào nguồn nước tự nhiên để đảm bảo an toàn cho hệ sinh thái thủy sinh.
• Thiết lập hệ thống quan trắc thường xuyên dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm thủy sản và trên cơ thể người nhằm đánh giá mức độ rủi ro sức khỏe cộng đồng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế được ghi nhận: Nghiên cứu gặp hạn chế về nguồn tài liệu đối chứng do sự thiếu hụt các công bố thực nghiệm trước đó về tác động mô bệnh học của deltamethrin trên mô tim cá trong y văn quốc tế. Đồng thời, nghiên cứu mới thực hiện thử nghiệm độc tính cấp tính trong điều kiện phòng thí nghiệm trong thời gian ngắn (3 tháng) trên đối tượng cá con.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Cần tiến hành thêm các thử nghiệm thực nghiệm để xác định chính xác ngưỡng nồng độ và khoảng thời gian phơi nhiễm không gây ra các tác động dưới mức gây chết (sub-lethal effects) trên cá.
  • Mở rộng thử nghiệm độc học trên nhiều loài thủy sản khác nhau nhằm đánh giá và so sánh độ nhạy cảm loài trước hoạt chất deltamethrin.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này có giá trị tham khảo hữu ích đối với:

• Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Khoa học Môi trường, Quản lý Môi trường, Độc học Môi trường, Bệnh học Thủy sản và Nuôi trồng Thủy sản cần tài liệu tham khảo về phương pháp luận nghiên cứu độc học thực nghiệm.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình kỹ thuật xử lý mô học chi tiết từng bước (từ cố định formalin, khử nước qua dãy cồn, tẩm sáp, cắt lát vi thể $5\ \mu\text{m}$ đến nhuộm H&E) và bộ tiêu chí nhận diện tổn thương vi thể (viêm, bong tróc biểu mô, thoái hóa mỡ, giãn xoang, tách sợi cơ tim) kèm thuật ngữ chuyên ngành giải phẫu bệnh học.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ phơi nhiễm deltamethrin trong nghiên cứu được thiết kế như thế nào?

Thí nghiệm sử dụng chế phẩm Decis® chứa hoạt chất deltamethrin, khảo sát trên 60 cá thể cá trê trắng chia thành 12 bể (15L nước, 5 con/bể, lặp lại 2 lần). Các mức nồng độ thử nghiệm gồm nhóm đối chứng ($0.0\text{ mL/L}$) và 5 mức nồng độ: $1.0\text{ mL/L}$, $1.5\text{ mL/L}$, $1.75\text{ mL/L}$, $2.0\text{ mL/L}$ và $2.5\text{ mL/L}$.

2. Những tổn thương vi thể điển hình nào xuất hiện ở mang cá sau khi nhiễm độc?

Các tổn thương chính gồm: viêm ở phiến mang sơ cấp và thứ cấp, bong tróc tế bào biểu mô phiến thứ cấp, đứt gãy phân rã và xuất huyết ở phiến sơ cấp, tăng sinh tế bào, uốn cong đầu phiến mang và co rút phiến sơ cấp. Ở nồng độ cao nhất ($2.5\text{ mL/L}$), vách biểu mô bị phá hủy hoàn toàn, chỉ còn lại các tế bào trụ.

3. Tại sao gan cá lại xuất hiện hiện tượng thoái hóa mỡ khi tiếp xúc với deltamethrin?

Deltamethrin là hợp chất chứa halogen có tính ưa mỡ rất cao ($\log K_{ow} = 2.7 \times 10^5$), dễ dàng xâm nhập và can thiệp vào bộ máy chuyển hóa lipid nội bào tại tế bào gan. Sự mất cân bằng giữa tốc độ tổng hợp chất béo trong nhu mô gan và tốc độ giải phóng chúng vào hệ tuần hoàn, kết hợp với tình trạng thiếu hụt oxy tế bào do tổn thương mang, dẫn đến sự tích tụ bất thường các giọt mỡ trong bào tương tế bào gan.

4. Cơ chế nào dẫn đến hiện tượng phù nề và phân tách sợi cơ tim ở cá phơi nhiễm deltamethrin?

Tổn thương cơ tim liên quan đến cơ chế ức chế kênh natri phụ thuộc điện thế. Deltamethrin liên kết và làm chậm quá trình đóng kênh natri (đặc biệt là kênh Nav1.5 biểu hiện cao trên màng tế bào cơ tim), gây rối loạn quá trình dẫn truyền xung động điện thế màng và mất cân bằng ion nội bào, dẫn đến phù nề mô kẽ giữa các bó cơ, tách sợi cơ tim và teo thoái hóa cơ tim.

5. Nghiên cứu này được thực hiện tại những cơ sở nào?

Nghiên cứu được hoàn thành bởi sinh viên Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thông qua chương trình thực tập và thực nghiệm tại Indonesia, phối hợp giữa Phòng thí nghiệm Bộ môn Giải phẫu bệnh học thuộc Bệnh viện Công Dr. Mohammad Hoesin cùng Phòng thí nghiệm Nuôi trồng Thủy sản và Phòng thí nghiệm Độc học Thuốc trừ sâu thuộc Đại học Sriwijaya.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đồng Thị Linh Chi đã đánh giá thành công độc tính cấp tính và các biến đổi bệnh lý vi thể trên mang, gan và tim của cá trê trắng (Clarias batrachus) sau khi phơi nhiễm hoạt chất deltamethrin. Kết quả thực nghiệm cho thấy mức độ tổn thương cấu trúc mô tỷ lệ thuận với nồng độ phơi nhiễm, đặc biệt ghi nhận rõ các tổn thương nghiêm trọng ở mô cơ tim bên cạnh mang và gan. Công trình đóng góp thêm dẫn liệu thực nghiệm về mô bệnh học tim cá dưới tác động của thuốc trừ sâu pyrethroid, đồng thời nhấn mạnh sự cần thiết của việc giám sát chặt chẽ dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhằm bảo vệ hệ sinh thái thủy vực và sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY DONG THI LINH CHI TOPIC TITLE: TOXICOLOGICAL EFFECT AND HISTOPATHOLOGICAL ALTERATIONS ON FISH AFTER INSECTICIDE ACTIVE COMPOUND CONTAMINATION BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Environmental Science and Management Faculty : International Training and Development Center Batch : 2011-2015 Thai Nguyen, September 2015 n DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program : Bachelor of Environmental Science and Management Student name : Dong Thi Linh Chi Student ID : DTN 1153110007 Thesis Title : Toxicological Effect and Histopathological Alterations on Fish after Insecticide Active Compound Contamination Supervisor (s): Dr. Ho Ngoc Son Abstract: Deltamethrin, a pyrethroid insecticide which is both very widely used and has a very wide range of applications in agriculture, animal health and public health, was investigated in the present study for histopathological studies in walking catfish fingerlings (Clarias batrachus). Fish were exposed to 1 ml/L, 1.75 ml/L, 2 ml/L and 2. The histopathological changes were studied in the gill, liver, and heart of the deltamethrin treated fish Clarias batrachus.

The results showed tissue specific alterations in the tissues. Inflammation of the gill primary lamellae and desquamation of secondary lamellae were observed. In the liver, there were an intrusion of fat, degradation of hepatocytes and sinusoidal dilatation. Edema in cardiac muscles, splitting of muscle fibers and infiltration of blood cells were an interesting observation in heart tissue.

In conclusion, exposure to deltamethrin will result in histological changes in gills, liver and heart of Clarias batrachus. The i n damages in histology of heart, liver and gills depend on the exposure concentrations to deltamethrin. As the exposure concentrations increased, the more adverse damage occurred. Keywords: Deltamethrin, histopathology, Clarias batrachus … Number of Pages: 43 pages Date of Submission: 30th September, 2015 Supervisor’s signature ii n ACKNOWLEDGEMENT From bottom of my heart, I would like to express my deepest appreciation to all those who provided me the opportunity to complete this research.

First and foremost, I would like to express my sincere gratitude and deep regards to my supervisor: Dr. Arinafril of Sriwijaya University, Indralaya, Indonesia, who guided me wholeheartedly when I implemented this research. I also want to express my thanks to Dr. Ho Ngoc Son, the second supervisor, for his supervision, encouragement, advice, and guidance in writing this thesis.

Besides my supervisors, I would like to thank Ph. Krisna MURTI in Department of Anatomical Pathology, who kindly assisted me with the histopathological detection in this dissertation and was very patient with my knowledge gaps. In addition, formal thanks should be offered to the Rector of Sriwijaya University, Prof. Badia Perizade, for granting my internship acceptance.

I would also like to acknowledge with much appreciation to the Dean of Faculty of Medicine in Sriwijaya University, Dr. Mohammad Zulkarnain, who gave the permission to use all required equipment and the necessary materials to conduct my research in Laboratory of Department of Anatomical Pathology, Dr. Mohammad Hoesin Public Hospital. Special thanks to Ms Mirna Fitrani, Mrs Ana, Mr Abi, and other staffs in Laboratory of Aquacuture, Sriwijaya University and Ms Hafsah in Pesticide Toxicology Laboratory for helping and providing me necessary equipment as well as knowledge for fish anatomy.

iii n I wish to thank the technicians who work in Immunohistochemistry Laboratory of Anatomical Pathology Department for their help in tissue preparation and Mrs. Zakinah Arlina who provided me fish for free. Without them, this research could not be accomplished on time. My sincere thanks also go to Ha, Thao, Linh, and Marisa for helping me finish this study.

Of course, I would like to thank to my Indonesian friends - Ria, Abdul, Veby, Ren, and others for their invaluable support and encouragement when I stayed in Palembang. Finally, special thanks to my family, my friends for their love and moral support throughout my study. Thai Nguyen, 30th September, 2015 Student Dong Thi Linh Chi iv n TABLE OF CONTENTS LIST OF FIGURES .1 LIST OF TABLES. Background and rationale.

Research questions and hypotheses. Toxic effects of deltamethrin on organisms. Test species - Clarias batrachus. MATERIALS AND METHODS.

Time and Place. Histopathological observation of gills. Histopathological observations of liver. Histopathological observations of heart.

DISCUSSION AND CONCLUSION .37 v n LIST OF FIGURES Figure 1. Stock solution of deltamethrin - Decis. Normal histological structure of gills. Histopathological Changes observed in gills (H&E x200).

Normal histological structure of liver. Histopathological changes in liver of fish exposed to 1. Histopathological changes in liver of fish exposed to 1. Histopathological changes in liver of fish exposed to 1.

Histopathological changes in liver of fish exposed to 2.0ml/L deltamethrin 27 Figure 9. Histopathological changes in liver of fish exposed to 2.5ml/L deltamethrin 28 Figure 10. Normal histological structure of heart. Histopathological changes observed in heart of experimental fish (H&E x200).

Histopathological changes in heart of fish exposed to a) 1.5ml/L of deltamethrin.31 1 n LIST OF TABLES Table 1.Physical and Chemical Properties of Deltamethrin. Toxicity classification of Deltamethrin. Categories of Acute Toxicity for Fish and Aquatic Invertebrates. Equipment used in laboratory.

Background and rationale In the recent years, pesticides, in general, are used very widely in agriculture, forestry, public health and in veterinary practices which have resulted in the increased levels of toxic chemicals in the aquatic environment. As a matter of fact, fish - a part of human diet, is contaminated either directly or indirectly by pesticide-related water pollution, it can lead to fish kills, reduce fish productivity, or even elevate concentrations of undesirable chemicals in edible fish tissue which can affect the health of humans consuming these fish (Velisek et al. Pyrethroids are synthetic analogues of pyrethrins, insecticidal substances obtained from the flowers of a species of chrysanthemum (Chrysanthemum cinerariaefolium) and exposure in insects is predominately through the insect cuticle (Casida, 1980). It can be rapidly absorbed, especially with pyrethroids containing halogen, insect neurotransmission can be disrupted and then can cause knockdown and possibly death within seconds to minutes (Wakeling et al.

Pyrethroids are less noxious to mammals compared to insects by reason of mammals higher body temperature, larger body size, and reduced sensitivity of the ion channel sites (Bradberry et al, 2005; Ray et al, 2006). Deltamethrin is a broad-spectrum pyrethroid insecticide which is both very extensively used and has a broad range of applications in agriculture, animal health and public health (US EPA, 2004). Deltamethrin is a pyrethroid insecticide which kills insects on contact and through ingestion, with a mechanism of disrupting their normal nervous system function and therefore giving a quick knock-down effect (NPIC, 2010). 3 n In laboratory conditions, deltamethrin is highly toxic for fish, aquatic arthropods, and honeybees, whereas, in field conditions, lasting adverse effects are not likely to occur under recommended conditions of use (WHO, 1990).

As a member of pyrethroids, deltamethrin is most commonly introduced into aquatic systems via runoff and erosion as well as the drift from aerial sprays, consequently, it could be potentially dangerous to benthic and epi-benthic species, as well as fish and other organisms feeding on benthos (You et al. Due to high toxicity to aquatic organisms, deltamethrin must be used with extreme caution around water (Sharma et al. In addition, the lethal concentrations of most of the pesticides cause varying degrees of histopathological injuries to different organs in fish. Therefore, histology and histopathology could be used as bio-monitoring tools or indicators of health in toxicity studies as they provide early warning signs of disease (Meyers & Hendricks, 1985).

Due to being exposed to pollutants, major structural damages may occur in their target organs, histological structure may change and physiological stress may occur. This stress causes some changes in the metabolic functions. The changes in the functions are initiated with the changes in the tissue and cellular level. The response of biomarkers can be regarded as biological and biochemical effects after a certain toxicant exposure, hence, histopathological examinations have been recognized to be reliable biomarkers of stress in fish (Van der Oost et al.

Objectives This study was designed to assess the toxicological effects of deltamethrin on Clarias batrachus (Walking catfish) as well as to reveal the histopathological alterations on its gills, heart and liver under different concentrations of deltamethrin. Research questions and hypotheses 1. Research questions - How does deltamethrin affect the gills of walking catfish? - How does deltamethrin affect the liver of walking catfish? - How does deltamethrin affect the heart of walking catfish? 1. Hypotheses Hypothesis 1: HO (Null Hypothesis): Exposure to deltamethrin will not result in changes in gills histology of Clarias batrachus.

HA (Alternative Hypothesis): Exposure to deltamethrin will result in changes in gills histology of Clarias batrachus. Hypothesis 2: HO: Exposure to Deltamethrin will not result in changes in liver histology of Clarias batrachus. 5 n HA: Exposure to deltamethrin will result in changes in liver histology of Clarias batrachus. Hypothesis 3: HO: Exposure to Deltamethrin will not result in changes in heart histology of Clarias batrachus.

HA: Exposure to deltamethrin will result in changes in heart histology of Clarias batrachus. Limitations As far as deltamethrin is considered, there is a lack of experimental results about the histopathological effects on heart tissues of fish of deltamethrin in the literature.Physical and Chemical Properties of Deltamethrin (1R,3R) [ α-cyano(3-phenoxyphenyl)methyl] 3-(2,2-dibrom Chemical Name o-ethenyl)-2,2-dim e thylcyclopropanecarboxylate (IUPAC) Common Name Deltam ethrin Butoflin®; Butox ®; Decis ®; K-Othrin®; K-Othrine ® Trade Names Dust; Striker® IEC insecticide Structural Formula Chemical Formula C22H19Br2NO3 CAS Registry 52918-63-5 Number Molecular Weight 505.053 gm per m L at 20° C (Decis®) Specific Gravity 0.5 gm per m L at 20° C (Technical Grade of AI, TGAI) Physical State White to beige crystalline powder (TGAI) Boiling Point Not applicable Soluble in acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl Solubility acetate, and toluene (all 23 - 39%), relatively insoluble in water (i.2 ppb in 24 hours) Vapor Pressure 1.5 x 10-8 mmHg at 25 ° C (> 90% AI) Octanol/Water 2.7 x 105 at 25° C Partition Coefficient Henry's Law 2.7 x 10-6 atm / m3 per m ole Constant pH 5.9 (in a 1% aqueous dispersion) (Source: ATSDR, 2003; MacBean, 2010) 7 n Deltamethrin [(S)-a-cyano-3-phenoxybenzyl(1R,3R)-3-(2,2-dibromvinyl)-2,2- dimethylcyclo propan-carboxylate], one of Type II synthetic pyrethroid insecticides, is similar in structure to natural pyrethrins derived from the chrysanthemum flowers. Deltamethrin was synthesised in 1974 and first marketed in 1977. Deltamethrin is considered the most powerful and therefore the most toxic of the pyrethroids, up to three orders of magnitude more so than some (ETN, 1995).

Deltamethrin causes neurotoxicity in insects and mammals by a similar mechanism of action, the modulation of nerve axon sodium channels. Generally, pyrethroids affect normal production and conduction of nerve signals in the nervous system and act on nerve membranes by delaying the closing of the activation gate for the sodium ion channel. It is commonly used to control caterpillars on apples, pears, and hops, and for the control of aphids, mealy bugs, scale insects, and whiteflies on greenhouse cucumbers, tomatoes, potted plants, and ornamentals (ETN, 1995). Deltamethrin is the active ingredient in Butoflin, Butoss, Butox, Cislin, Crackdown, Cresus, Decis, Decis- Prime, K-Othrin, and K-Otek and it is the first potent and photostable insecticide belonging to the type II pyrethroid group (ATSDR, 2003).

Worthing (1983) found that deltamethrin is extremely stable on exposure to air and temperature, and it is more stable in acidic as compared to alkaline media. All pyrethroids have at least four stereoisomers, with different orientation of the substituents on the cyclopropane ring (or the equivalent part of the phenylacetate) despite the fact that deltamethrin is marketed as a single isomer cis (WHO, 1990). The isomers have different biological activities. In the summers of 1991 and 1995, the pesticide caused massive eel (Anguilla anguilla) kills in Lake Balaton, Hungary 8 n following application for mosquito control.

In 1995, the presence of deltamethrin was demonstrated in several other fish species and in sediment samples taken from the lake (Balint et al.