Construction of overexpress vector promoter vector and crispr cas9 vector for osgdpd13 gene editing in rice

Lúa gạo là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò then chốt… 58 trang · Vietnam National University of Agriculture · 2022.

• Tác giả: Kieu Trinh Van An
• Người hướng dẫn: To Thi Mai Huong, PhD
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Xây Dựng Vector Overexpress, Vector Promoter và Vector CRISPR/Cas9 cho Chỉnh Sửa Gien OsGDPD13 trong Lúa
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATION
• ABSTRACT
• 1. CHAPTER I: INTRODUCTION
• 1.1. Introduction
• 2. CHAPTER II: LITERATURE OVERVIEW
• 2.1. Role of phosphorus fertilizers for rice and its impact on the environment
• 2.2. Role of phosphorus fertilizers for rice
• 2.3. Impact of phosphorus fertilizers on the environment
• 2.4. Genes related to the tolerance of rice to low-Pi condition
• 2.5. Family of GDPDs
• 3. CHAPTER V: CONCLUSION AND RECOMMENDATION

Tóm tắt

I. Tổng Quan Xây Dựng Vector Chỉnh Sửa Gene OsGDPD13 ở Lúa

Lúa gạo là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò then chốt trong an ninh lương thực toàn cầu. Tuy nhiên, năng suất lúa chịu ảnh hưởng lớn bởi nhiều yếu tố, trong đó có sự thiếu hụt phospho (P) trong đất. Việc sử dụng phân bón phospho để cải thiện năng suất lúa gây ra nhiều vấn đề về môi trường và kinh tế. Do đó, việc phát triển các giống lúa chịu được điều kiện thiếu phospho là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu về các gene liên quan đến khả năng chịu hạn của lúa, đặc biệt là gene OsGDPD13, mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện năng suất và khả năng thích ứng của lúa. Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng các vector overexpression, vector promoter và vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gene OsGDPD13 trong lúa, từ đó hiểu rõ hơn về chức năng của gene này và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa.

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu gene OsGDPD13 ở lúa

Gene OsGDPD13 thuộc họ GDPD (Glycerophosphodiester phosphodiesterases), được cho là có vai trò quan trọng trong cân bằng nội môi phospho ở thực vật. Các nghiên cứu trước đây đã xác định 13 gene OsGDPD ở lúa, nhưng biểu hiện và chức năng của gene OsGDPD13 chưa được mô tả đầy đủ. Việc nghiên cứu gene này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế chịu hạn của lúa và phát triển các giống lúa mới có khả năng sử dụng phospho hiệu quả hơn.

1.2. Mục tiêu và yêu cầu của việc xây dựng vector chỉnh sửa gene

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tạo ra các vector cần thiết để nghiên cứu chức năng của gene OsGDPD13. Điều này bao gồm việc nhân dòng gene OsGDPD13 và vùng promoter của nó vào các vector phù hợp, cũng như thiết kế và xây dựng vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gene này. Yêu cầu cụ thể bao gồm khuếch đại vùng promoter OsGDPD13, biến nạp các vector vào vi khuẩn E. coli, và chọn lọc các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp.

II. Thách Thức Thiếu Phospho và Ứng Dụng Công Nghệ CRISPR Cas9

Tình trạng thiếu phospho trong đất là một thách thức lớn đối với sản xuất lúa gạo trên toàn thế giới. Việc sử dụng phân bón phospho không chỉ gây tốn kém mà còn ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp bền vững để cải thiện khả năng hấp thụ và sử dụng phospho của lúa là vô cùng quan trọng. Công nghệ CRISPR/Cas9 là một công cụ mạnh mẽ trong chỉnh sửa gene, cho phép các nhà khoa học can thiệp chính xác vào hệ gene của cây trồng. Việc ứng dụng CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gene OsGDPD13 có thể giúp tạo ra các giống lúa có khả năng chịu hạn tốt hơn và sử dụng phospho hiệu quả hơn.

2.1. Ảnh hưởng của thiếu phospho đến năng suất và chất lượng lúa

Thiếu phospho ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cây lúa, bao gồm sự phát triển của rễ, quá trình quang hợp và vận chuyển năng lượng. Điều này dẫn đến giảm năng suất và chất lượng gạo. Theo FAO (2022), lúa là một trong bốn loại cây trồng chiếm một nửa sản lượng cây trồng chính toàn cầu năm 2020. Do đó, việc giải quyết vấn đề thiếu phospho có ý nghĩa to lớn đối với an ninh lương thực.

2.2. Tiềm năng của công nghệ CRISPR Cas9 trong cải thiện giống lúa

Công nghệ CRISPR/Cas9 cho phép chỉnh sửa gene một cách chính xác và hiệu quả, mở ra nhiều cơ hội trong việc cải thiện các đặc tính của cây lúa, bao gồm khả năng chịu hạn, kháng bệnh và năng suất. Việc sử dụng CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gene OsGDPD13 có thể giúp tạo ra các giống lúa có khả năng sử dụng phospho hiệu quả hơn, giảm sự phụ thuộc vào phân bón phospho và bảo vệ môi trường.

2.3. Các yếu tố cần xem xét khi thiết kế vector CRISPR Cas9 cho lúa

Thiết kế vector CRISPR/Cas9 hiệu quả đòi hỏi sự cân nhắc kỹ lưỡng về nhiều yếu tố, bao gồm lựa chọn trình tự sgRNA (single guide RNA) phù hợp, đảm bảo tính đặc hiệu của CRISPR/Cas9 để tránh các tác động ngoài ý muốn (off-target effects), và tối ưu hóa hiệu quả chỉnh sửa gene. Việc phân tích off-target là rất quan trọng để đảm bảo an toàn và hiệu quả của công nghệ CRISPR/Cas9.

III. Phương Pháp Xây Dựng Vector Overexpression OsGDPD13 ở Lúa

Để nghiên cứu chức năng của gene OsGDPD13, việc xây dựng vector overexpression là một bước quan trọng. Vector overexpression cho phép tăng cường biểu hiện của gene OsGDPD13 trong cây lúa, từ đó giúp các nhà khoa học quan sát và đánh giá tác động của gene này đến các đặc tính của cây. Quá trình xây dựng vector overexpression bao gồm việc nhân dòng gene OsGDPD13 vào vector biểu hiện phù hợp, sau đó chuyển vector này vào cây lúa thông qua các phương pháp biến nạp gene.

3.1. Quy trình nhân dòng gene OsGDPD13 vào vector pC5300

Gene OsGDPD13 được khuếch đại từ cDNA của lúa bằng kỹ thuật PCR sử dụng các primer đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được cắt bằng enzyme giới hạn và gắn vào vector pC5300 đã được chuẩn bị sẵn. Phản ứng gắn được thực hiện bằng enzyme ligase, và sản phẩm được biến nạp vào vi khuẩn E. coli để nhân dòng.

3.2. Kiểm tra và xác nhận vector overexpression OsGDPD13

Các khuẩn lạc E. coli chứa plasmid tái tổ hợp được chọn lọc bằng kháng sinh. Plasmid từ các khuẩn lạc này được chiết tách và kiểm tra bằng enzyme giới hạn và PCR để xác nhận sự hiện diện của gene OsGDPD13. Giải trình tự gene cũng được thực hiện để đảm bảo tính chính xác của trình tự gene OsGDPD13 trong vector.

3.3. Biến nạp vector overexpression vào cây lúa Oryza sativa

Sau khi xác nhận, vector overexpression chứa gene OsGDPD13 được biến nạp vào cây lúa thông qua phương pháp Agrobacterium tumefaciens hoặc phương pháp bắn gene. Các cây lúa chuyển gene được chọn lọc bằng kháng sinh hoặc các marker chọn lọc khác. Sự biểu hiện của gene OsGDPD13 trong các cây chuyển gene được kiểm tra bằng các kỹ thuật phân tích RNA và protein.

IV. Phương Pháp Xây Dựng Vector Promoter OsGDPD13 cho Lúa

Nghiên cứu về vùng promoter của gene OsGDPD13 giúp hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa biểu hiện của gene này. Vector promoter được sử dụng để phân tích hoạt động của vùng promoter trong các điều kiện khác nhau, từ đó xác định các yếu tố điều hòa biểu hiện gene. Quá trình xây dựng vector promoter bao gồm việc nhân dòng vùng promoter của gene OsGDPD13 vào vector báo cáo (reporter vector), sau đó chuyển vector này vào cây lúa và đánh giá hoạt động của promoter.

4.1. Phân lập và khuếch đại vùng promoter OsGDPD13 từ DNA bộ gene

Vùng promoter của gene OsGDPD13 được khuếch đại từ DNA bộ gene của lúa bằng kỹ thuật PCR sử dụng các primer đặc hiệu. Các primer được thiết kế dựa trên trình tự DNA đã biết của vùng promoter.

4.2. Gắn vùng promoter vào vector pJET1.2 blunt và kiểm tra

Sản phẩm PCR chứa vùng promoter được gắn vào vector pJET1.2/blunt bằng enzyme ligase. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E. coli, và các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp được chọn lọc bằng kháng sinh. Plasmid từ các khuẩn lạc này được chiết tách và kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự để xác nhận sự hiện diện và tính chính xác của vùng promoter.

4.3. Phân tích hoạt động của promoter OsGDPD13 trong cây lúa

Vector promoter chứa vùng promoter của gene OsGDPD13 được chuyển vào cây lúa thông qua các phương pháp biến nạp gene. Hoạt động của promoter được đánh giá bằng cách đo lường biểu hiện của gene báo cáo (ví dụ: GUS, GFP) dưới sự kiểm soát của promoter trong các điều kiện khác nhau (ví dụ: thiếu phospho, stress môi trường).

V. Ứng Dụng Chỉnh Sửa Gene OsGDPD13 Bằng Vector CRISPR Cas9 ở Lúa

Việc sử dụng vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gene OsGDPD13 cho phép tạo ra các đột biến trong gene này, từ đó giúp các nhà khoa học xác định chức năng của gene và vai trò của nó trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Vector CRISPR/Cas9 chứa enzyme Cas9 và sgRNA (single guide RNA) hướng dẫn Cas9 đến vị trí mục tiêu trong gene OsGDPD13 để cắt DNA.

5.1. Thiết kế sgRNA đặc hiệu cho gene OsGDPD13

sgRNA được thiết kế để hướng dẫn enzyme Cas9 đến vị trí mục tiêu trong gene OsGDPD13. Trình tự sgRNA phải đặc hiệu cho gene OsGDPD13 và tránh các trình tự tương đồng trong các gene khác để giảm thiểu các tác động ngoài ý muốn (off-target effects).

5.2. Xây dựng vector pOs Cas9 sgRNA và kiểm tra hiệu quả chỉnh sửa

sgRNA được gắn vào vector pOs-Cas9, và vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Plasmid từ các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp được chiết tách và kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự để xác nhận sự hiện diện và tính chính xác của sgRNA. Hiệu quả chỉnh sửa gene được kiểm tra bằng cách chuyển vector CRISPR/Cas9 vào cây lúa và phân tích DNA của các cây chuyển gene để xác định các đột biến trong gene OsGDPD13.

5.3. Đánh giá tác động của việc chỉnh sửa gene OsGDPD13 đến cây lúa

Các cây lúa có gene OsGDPD13 đã được chỉnh sửa được đánh giá về các đặc tính sinh trưởng và phát triển, bao gồm khả năng chịu hạn, năng suất và chất lượng gạo. Các phân tích sinh hóa và phân tử cũng được thực hiện để xác định tác động của việc chỉnh sửa gene đến biểu hiện của các gene khác và các quá trình trao đổi chất trong cây.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Ứng Dụng và Hướng Nghiên Cứu Gene OsGDPD13

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng các vector overexpression, vector promoter và vector CRISPR/Cas9 cho gene OsGDPD13 ở lúa. Các vector này sẽ là công cụ quan trọng để nghiên cứu chức năng của gene OsGDPD13 và ứng dụng trong việc cải thiện khả năng chịu hạn và sử dụng phospho hiệu quả của lúa. Các kết quả nghiên cứu này có thể đóng góp vào việc phát triển các giống lúa mới có năng suất cao và thích ứng tốt với các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

6.1. Tóm tắt kết quả và ý nghĩa của việc xây dựng các vector

Việc xây dựng thành công các vector overexpression, vector promoter và vector CRISPR/Cas9 cho gene OsGDPD13 là một bước tiến quan trọng trong việc nghiên cứu chức năng của gene này. Các vector này cung cấp các công cụ cần thiết để điều chỉnh biểu hiện của gene OsGDPD13 và tạo ra các đột biến trong gene này, từ đó giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về vai trò của gene trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo về gene OsGDPD13 và ứng dụng

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phân tích chi tiết chức năng của gene OsGDPD13 trong các điều kiện khác nhau, đặc biệt là trong điều kiện thiếu phospho. Việc xác định các yếu tố điều hòa biểu hiện của gene OsGDPD13 và các gene khác liên quan đến khả năng chịu hạn cũng là một hướng nghiên cứu quan trọng. Các kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các giống lúa mới có khả năng chịu hạn tốt hơn và sử dụng phospho hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lúa (Oryza sativa) là loại nông sản có sản lượng toàn cầu đứng hàng thứ ba, chỉ sau ngô và mía đường, đóng vai trò bảo đảm an ninh lương thực và kinh tế cho gần một nửa dân số thế giới. Phốt pho (P - Lân) là một trong những nguyên tố khoáng đa lượng thiết yếu đối với cấu trúc tế bào và sự trao đổi chất của thực vật, tham gia vào thành phần các hợp chất hữu cơ quan trọng, kích thích bộ rễ phát triển và cải thiện năng suất cây lúa. Tuy nhiên, hàm lượng phốt pho hữu dụng (Pi) trong hầu hết các loại đất canh tác đều ở mức thấp, đòi hỏi việc bổ sung liên tục phân bón lân thương mại. Nguồn cung cấp phốt pho chính hiện nay là đá quặng phốt phát – một dạng tài nguyên không thể tái tạo đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt cùng với sự gia tăng giá thành phân bón.

Bên cạnh đó, hiệu suất sử dụng lân của cây trồng còn thấp khi chỉ có khoảng 10% đến 20% lượng lân trong phân bón được hấp thụ trong năm đầu canh tác; phần lớn lượng phốt pho thất thoát vào môi trường đất cát gây tích tụ, rửa trôi, phát sinh nguy cơ ô nhiễm nguồn nước và tích lũy kim loại nặng độc hại (như cadmium và uranium). Để đáp ứng nhu cầu gia tăng sản lượng lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu, việc nghiên cứu phát triển các giống lúa có hiệu suất sử dụng lân cao (P-efficient rice) là một yêu cầu cấp thiết.

Họ gen mã hóa enzyme Glycerophosphodiester phosphodiesterase (GDPD) giữ vai trò trung tâm trong quá trình duy trì cân bằng nội môi phosphate tế bào thông qua con đường thủy phân các phân tử glycerophosphodiester (GPDs) thành glycerol-3-phosphate (G-3-P), giải phóng ion phosphate phục vụ tái sử dụng nội bào khi cây bị đói lân. Ở cây lúa, có 13 gen thuộc họ OsGDPD đã được xác định. Thông qua các phân tích liên kết toàn hệ gen (GWAS) trên tập đoàn lúa Việt Nam nhằm đánh giá tính mềm dẻo hình thái rễ, thân và hiệu suất sử dụng lân dưới điều kiện thiếu Pi (To et al., 2020; Mai et al., 2021), gen OsGDPD13 (mã locus: LOC_Os09g17000) đã được định danh là gen ứng viên then chốt. Mặc dù Mehra và Giri (2016) đã phân loại OsGDPD13 vào nhóm protein GDPD loại B, cơ sở dữ liệu cDNA của lúa trước đây vẫn thiếu trình tự cDNA đầy đủ (full-length cDNA), dẫn đến việc hồ sơ biểu hiện của gen này chưa được làm sáng tỏ.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Xây dựng vector biểu hiện vượt mức, vector promoter và vector CRISPR/Cas9 phục vụ chỉnh sửa gen OsGDPD13 ở cây lúa" được thực hiện nhằm mục tiêu:

• Nhân bản thành công gen OsGDPD13 và promoter của gen OsGDPD13 để tạo lập 3 cấu trúc vector tái tổ hợp: vector biểu hiện vượt mức pC5300-OsGDPD13OE, vector promoter pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter và vector chỉnh sửa hệ gen pOs-Cas9-sgRNA.

Các nhiệm vụ/yêu cầu cụ thể gồm:

1. Khuếch đại vùng promoter của gen OsGDPD13 từ DNA tổng số (gDNA) của giống lúa Kitaake.
2. Biến nạp các vector tái tổ hợp pC5300-OsGDPD13OE, pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter và pOs-Cas9-sgRNA vào các dòng tế bào khả biến Escherichia coli thích hợp.
3. Tuyển chọn và thẩm định các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn, phản ứng PCR và giải trình tự Sanger.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Trình tự mã hóa (CDS) và vùng promoter của gen OsGDPD13 (LOC_Os09g17000 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 từ vị trí 10403688 đến 10405803, chiều dài CDS 975 bp); mẫu gDNA giống lúa Kitaake; các vector cloning và biểu hiện (pCAMBIA5300 Overexpress, pJET1.2/blunt, pOs-Cas9); các chủng vi khuẩn E. coli (DH5α, DB3.1).
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật, Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội (USTH).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và các khái niệm chuyên ngành

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử thực vật và kỹ thuật di truyền:

• Cơ chế phân giải phospholipid và vai trò của GDPD: Khi cây lúa bị thiếu hụt lân, màng phospholipid bị phân hủy theo nhiều lộ trình khác nhau. Trong đó, enzyme phospholipase A (PLA) hoặc lipid acyl hydrolase (LAH) thoái hóa phospholipid tạo ra glycerophosphodiester (GPDs). Enzyme GDPD tiếp tục xúc tác thủy phân GPDs tạo ra sn-glycerol-3-phosphate (G-3-P). G-3-P sau đó được enzyme acid phosphatase phân giải giải phóng ion Pi hoặc bị chuyển hóa thành dihydroxyacetone phosphate (DHAP) phục vụ quá trình đường phân, giúp cây tái huy động nguồn lân nội sinh.
• Các gen điều hòa đáp ứng thiếu lân ở lúa: Gồm có gen OsPSTOL1 (mã hóa protein kinase họ serine/threonine liên quan đến khả năng tăng cường hấp thu Pi qua rễ), các yếu tố điều hòa OsPHR1, OsPHR2, protein điều hòa cân bằng nội môi OsSPX1 và các chất vận chuyển OsPHO1;2.
• Kỹ thuật nhân bản Gateway (Gateway Cloning): Phương pháp dựa trên cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của thực khuẩn thể Lambda (phage λ). Phản ứng BP sử dụng enzyme BP Clonase để tái tổ hợp giữa vị trí attB trên đoạn chèn và vị trí attP trên vector nhận (donor vector), tạo ra dòng mang vector entry chứa vị trí attL và loại bỏ gen chỉ thị âm tính ccdB (mã hóa protein độc làm bất hoạt DNA gyrase gây chết tế bào vi khuẩn). Phản ứng LR sử dụng enzyme LR Clonase xúc tác tái tổ hợp giữa vị trí attL của vector entry và vị trí attR của vector đích (destination vector) để tạo vector biểu hiện cuối cùng.
• Hệ thống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9: Hệ thống gồm endonuclease Cas9 kết hợp với một phân tử RNA dẫn đường đơn (sgRNA). Phức hệ này nhận diện chuỗi đích bổ sung 20 nucleotide nằm liền kề phía trước mô-típ nhận diện PAM (5'-NGG-3'), kích hoạt Cas9 cắt đứt chuỗi đôi DNA (DSB) tại vị trí cách PAM 3 cặp base về phía đầu 5'.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật thao tác phân tử in vitro và biến nạp vi khuẩn:

• Khuếch đại chuỗi DNA (PCR và Gradient PCR): Thiết lập gradient nhiệt độ bắt cặp từ 52°C đến 62°C (57 ± 5°C) để tối ưu hóa quá trình khuếch đại vùng promoter kích thước lớn (~2 kb) từ gDNA lúa Kitaake; sử dụng colony PCR để sàng lọc nhanh các thể tái tổ hợp.
• Tách dòng đầu bằng (Blunt-end cloning): Sử dụng hệ thống vector pJET1.2/blunt (chứa gen độc lực bị bất hoạt khi có đoạn chèn gắn vào) để nhân bản trung gian đoạn sgRNA scaffold và vùng promoter.
• Phản ứng tái tổ hợp Gateway BP và LR: Tiến hành phản ứng enzyme đặc hiệu vị trí qua đêm ở 25°C, sau đó dừng phản ứng bằng enzyme Proteinase K ở 37°C trong 10 phút.
• Biến nạp tế bào khả biến bằng sốc nhiệt (Heat-shock transformation): Biến nạp sản phẩm nối/tái tổ hợp vào chủng E. coli DH5α hoặc DB3.1 thông qua ủ đá 30 phút, sốc nhiệt ở 42°C (45 giây đối với DH5α, 30 giây đối với DB3.1), phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C rung lắc 200 rpm trong 1 giờ, sau đó cấy gạt lên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh chọn lọc tương ứng.
• Thẩm định cấu trúc tái tổ hợp: Tách chiết plasmid bằng bộ kit cột quay silica (EZ-10 Spin Column), kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn (EcoRI, BamHI, HindIII), điện di trên gel agarose 1% và kiểm chứng trình tự bằng giải trình tự Sanger.

Dữ liệu mẫu và danh mục mồi khuếch đại

TT	Tên mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Chiều dài (bp)	Mục đích sử dụng
1	cdsGDPD13_F	ATGCGCCTCTTTACAGCCAAA	21	Khuếch đại/kiểm tra CDS gen OsGDPD13
2	cdsGDPD13_R	TTACACTAGTACGGAAACTAAAT	23	Khuếch đại/kiểm tra CDS gen OsGDPD13
3	promGPDP13F_HindIII	CAAGTTTTGGACCTACACTGGA	22	Nhân bản promoter OsGDPD13 (gắn vị trí HindIII)
4	promGPDP13R_BamHI	GAACGAACAGAACGGAGCAG	20	Nhân bản promoter OsGDPD13 (gắn vị trí BamHI)
5	pJET1.2 sequencing F_primer	CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC	23	Giải trình tự vector pJET1.2
6	pJET1.2 sequencing R_primer	AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG	24	Giải trình tự vector pJET1.2
7	GDPD13-750F_primer	TCGCATTGTTTGGTGTGTTT	20	Giải trình tự vùng giữa promoter OsGDPD13
8	pOs-Cas9-839	AGGCGGGAAACGACAATCTG	20	Kiểm tra colony PCR / Giải trình tự vector pOs-Cas9
9	pOs-Cas9-840	AGACATGCAATGCTCATTAT	19	Kiểm tra colony PCR / Giải trình tự vector pOs-Cas9

Trình tự gRNA chỉnh sửa gen OsGDPD13 được thiết kế bằng công cụ CRISPR Guides trên nền tảng Blenching:

• Vị trí: 1314 (-1), Trình tự: GAAGTTGGAGTCGAACCTCG, Mô-típ PAM: GGG, Điểm On-target: 75.3. Thiết kế nhắm vào exon 3 và exon 4 để loại bỏ intron mang đa hình đơn nucleotide (SNP).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Giới thiệu (Introduction)

Chương này nêu rõ vai trò chiến lược của cây lúa đối với an ninh lương thực toàn cầu và nền nông nghiệp Việt Nam (diện tích lúa năm 2021 đạt 7,24 triệu ha, năng suất 60,6 tạ/ha). Tác giả phân tích sự cạn kiệt tài nguyên quặng phốt phát, sự lãng phí phân bón lân và các hệ lụy môi trường do quá trình canh tác thâm canh.

Chương I tổng thuật các phát hiện từ các nghiên cứu GWAS gần đây trên nguồn gen lúa bản địa Việt Nam, chỉ ra gen ứng viên OsGDPD13 nhưng chưa có dữ liệu biểu hiện hoàn chỉnh. Từ đó, xác lập mục tiêu thiết kế 3 cấu trúc vector gồm vector biểu hiện vượt mức (overexpression), vector promoter gắn chỉ thị và vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 làm công cụ phục vụ nghiên cứu chức năng gen sau này.

Chương II: Tổng quan tài liệu (Literature Overview)

Chương II hệ thống hóa cơ sở lý luận học thuật chuyên sâu về:

• Tác động của phân bón lân đối với sinh lý cây lúa và áp lực môi trường (tích lũy kim loại nặng, hiện tượng phú dưỡng, thất thoát dòng chảy).
• Cơ chế phân tử và các gen tham gia vào mạng lưới chống chịu thiếu hụt Pi ở thực vật (OsPSTOL1, PHR1, OsPHR1, OsPHR2, OsSPX1, OsPHO1;2).
• Cấu trúc, phân loại và con đường chuyển hóa lipid liên quan đến họ enzyme GDPD ở thực vật (Arabidopsis, cà rốt, lúa), phân định rõ type A (chứa 1 domain GDPD) và type B (chứa 2 domain GDPD giả định, đặc thù ở thực vật).
• Nguyên lý cơ bản và cơ chế phân tử của công nghệ Gateway Cloning (phản ứng BP, phản ứng LR, cơ chế chọn lọc âm tính của gen độc lực ccdB).
• Cấu trúc và cơ chế sửa sai hệ gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9 lớp 2 loại II, vai trò của sgRNA và trình tự nhận diện PAM.

Chương III: Vật liệu và phương pháp (Materials and Methods)

Chương III mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện thực nghiệm, địa điểm (PTN Công nghệ sinh học Thực vật - USTH), vật liệu sinh học, hóa chất, bộ kit chuẩn và trang thiết bị (hệ thống ProFlex PCR 3x32-well, hệ thống chụp gel UVP GelStudio, NanoDrop, máy ly tâm Eppendorf 5424R/5810R). Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành 3 nhánh độc lập:

1. Nhánh 1 - Xây dựng vector biểu hiện vượt mức pC5300-OsGDPD13OE: Tách plasmid chứa đoạn CDS OsGDPD13, cắt giải phóng bằng EcoRI và BamHI, thu nhận đoạn gen ~1 kb qua cột tách gel; thực hiện phản ứng Gateway BP với vector pCAMBIA5300 Overexpress (chứa promoter Ubiquitin - Ubi mạnh và gen kháng Kanamycin KanaR); biến nạp tế bào DH5α; kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn và phản ứng PCR.
2. Nhánh 2 - Xây dựng vector promoter pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter: Khuếch đại vùng promoter từ gDNA Kitaake bằng PCR gradient nhiệt độ (52–62°C) với cặp mồi gắn vị trí nhận diện HindIII/BamHI; tinh sạch phân đoạn PCR ~2 kb; thực hiện phản ứng nối đầu bằng (blunt-end ligation) vào vector pJET1.2/blunt (mang gen kháng Ampicillin AmpR); biến nạp DH5α; thẩm định dòng bằng cắt enzyme BamHI/HindIII và giải trình tự Sanger.
3. Nhánh 3 - Xây dựng vector CRISPR/Cas9 pOs-Cas9-sgRNA: Lắp ráp đoạn chèn sgRNA scaffold vào vector trung gian pJET1.2/blunt bằng nhân bản đầu bằng; biến nạp DH5α để tách plasmid pJET1.2/blunt-sgRNA; thực hiện phản ứng Gateway LR giữa vector entry này với vector đích pOs-Cas9 (kích thước 17516 bp, mang gen kháng Spectinomycin Spect50); biến nạp vào dòng vi khuẩn DB3.1; sàng lọc khuẩn lạc bằng colony PCR với cặp mồi pOs-Cas9-839/pOs-Cas9-840 và giải trình tự Sanger.

Chương IV: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương IV trình bày chi tiết các dẫn liệu thực nghiệm thu được:

Nhánh cấu trúc	Thao tác thực nghiệm	Kết quả quan sát & Dẫn liệu định lượng
pC5300-OsGDPD13OE	Cắt plasmid mang CDS gen bằng EcoRI + BamHI	Xuất hiện phân đoạn giải phóng đúng kích thước lý thuyết ~1 kb (975 bp).
	Biến nạp sản phẩm BP vào DH5α	Hình thành các khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, nhẵn bóng trên môi trường chọn lọc LB + Kanamycin 50 µg/ml.
	Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI + BamHI	Xuất hiện 3 phân đoạn rõ nét: băng lớn ~10,2 kb (khung vector pC5300), băng trung bình ~1,8 kb (từ vị trí 9012 đến 11734) và băng nhỏ ~613 bp (từ vị trí 8399 đến 9012).
	Kiểm tra bằng PCR với mồi cdsGDPD13	Khuếch đại thành công phân đoạn đặc hiệu kích thước ~1 kb trên cả 4 thể truyền kiểm tra (dòng 4, 5, 6, 7).
pJET1.2/blunt-OsGDPD13prom	PCR gradient promoter từ gDNA Kitaake	Tạo sản phẩm đơn băng, đậm nét ở mọi mức nhiệt độ bắt cặp (52–62°C), kích thước đúng 2033 bp.
	Biến nạp sản phẩm nối đầu bằng vào DH5α	Thu nhận các khuẩn lạc tái tổ hợp trên môi trường LB + Ampicillin 100 µg/ml.
	Cắt kiểm tra bằng BamHI + HindIII	Plasmid tái tổ hợp tổng kích thước ~5 kb bị cắt thành 3 đoạn: 2,7 kb (vector), 2,0 kb (promoter OsGDPD13) và đoạn nhỏ 200 bp (mờ).
	Giải trình tự Sanger vùng promoter	Phân đoạn đọc bằng mồi pJET1.2F (899 bp, sai khác 4 nucleotide), pJET1.2R (898 bp, sai khác 11 nucleotide), GDPD13-750F (1193 bp); ghi nhận biến dị lặp lại tại các vị trí 865 và 884 so với trình tự chuẩn.
pOs-Cas9-sgRNA	Biến nạp sản phẩm phản ứng LR vào DB3.1	Thu nhận các khuẩn lạc mang cấu trúc trên môi trường LB + Spectinomycin 50 µg/ml.
	Sàng lọc bằng Colony PCR	4 khuẩn lạc (số 4, 6, 7, 8) cho băng khuếch đại rõ nét kích thước xấp xỉ lý thuyết (~1,2 kb).
	Giải trình tự Sanger khuẩn lạc số 7	Đọc bằng mồi pOs-Cas9-840 (923 bp, sai khác tại vị trí 100 và 868) và pOs-Cas9-839 (919 bp, sai khác tại 109, 672 và 868); độ tương đồng đạt 99% so với thiết kế chuẩn; xác định vị trí 868 là biến dị thực sự.

Chương V: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Recommendation)

Chương V đúc kết toàn bộ kết quả tạo dòng, khẳng định đã xây dựng thành công 3 cấu trúc vector và tạo lập được 3 chủng vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp tương ứng. Tác giả đề xuất kiến nghị sử dụng trực tiếp các chủng vi khuẩn này để phục vụ quy trình chuyển gen vào giống lúa Kitaake nhằm đánh giá kiểu hình đáp ứng điều kiện thiếu lân.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính của nghiên cứu

• Tạo dòng thành công vector biểu hiện vượt mức pC5300-OsGDPD13OE: Đoạn mã hóa CDS của gen OsGDPD13 (kích thước ~1 kb) được chèn chính xác vào khung vector pCAMBIA5300 dưới sự điều khiển của promoter Ubiquitin, được xác nhận thông qua phân tích bản đồ cắt hạn chế (EcoRI và BamHI cho 3 băng 10,2 kb; 1,8 kb; 613 bp) và phản ứng PCR đặc hiệu.
• Tạo dòng thành công vector promoter pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter: Vùng promoter có chiều dài 2033 bp được khuếch đại thành công từ gDNA lúa Kitaake và gắn vào vector pJET1.2/blunt, đóng vai trò là vector trung gian chuẩn bị cho việc gắn vào cấu trúc chỉ thị pC5300-GUS-Tnos.
• Tạo dòng thành công vector chỉnh sửa gen pOs-Cas9-sgRNA: Hoàn thành phản ứng Gateway LR để gắn cấu trúc sgRNA scaffold đa vị trí (exon 3 và exon 4) vào vector đích pOs-Cas9, sàng lọc thành công thể mang plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc số 7) với độ tương đồng trình tự giải mã đạt 99%.
• Lưu trữ chủng vi sinh vật phục vụ nghiên cứu: Thiết lập và bảo quản thành công ở điều kiện -80°C (glycerol 50%) hai dòng E. coli DH5α mang vector pC5300-OsGDPD13OE, pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter và một dòng E. coli DB3.1 mang vector pOs-Cas9-sgRNA.

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

• Đề tài đã hoàn thiện hệ thống công cụ vector phân tử đồng bộ cho gen OsGDPD13 gồm cả ba hướng tiếp cận: tăng cường chức năng (gain-of-function thông qua overexpression), phân tích không gian/thời gian biểu hiện mô (expression pattern thông qua promoter-reporter) và loại bỏ chức năng (loss-of-function thông qua đột biến định hướng bằng CRISPR/Cas9).
• Bổ khuyết khoảng trống nghiên cứu trong các công bố trước đây (như nghiên cứu của Mehra và Giri, 2016) vốn chưa thể khảo sát chi tiết gen OsGDPD13 do thiếu nguồn vật liệu và công cụ vector chuyên biệt.
• Cung cấp dữ liệu trình tự thực nghiệm về các điểm biến dị nucleotide trên vùng promoter và vùng đích của gen OsGDPD13 ở giống lúa Kitaake so với cơ sở dữ liệu hệ gen tham chiếu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của đề tài:
  • Quá trình giải trình tự kiểm tra toàn bộ đoạn mã hóa OsGDPD13 trên vector pC5300-OsGDPD13OE vẫn đang trong tiến trình hoàn thiện tại thời điểm hoàn thành văn bản khóa luận.
  • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở phạm vi tạo dòng phân tử in vitro và tạo chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp, chưa tiến hành chuyển gen trực tiếp vào mô thực vật để đánh giá chức năng in planta.
  • Đoạn promoter sau khi gắn vào pJET1.2/blunt chưa được chuyển tiếp vào vector biểu hiện chỉ thị pC5300-GUS-Tnos trong khuôn khổ thời gian thực hiện.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Hoàn tất giải trình tự kiểm tra toàn diện đoạn chèn CDS trên vector biểu hiện vượt mức.
  • Chuyển promoter OsGDPD13 từ vector trung gian sang vector pC5300-GUS-Tnos để tạo dòng lúa chuyển gen biểu hiện GUS.
  • Sử dụng các chủng vi khuẩn tái tổ hợp đã tạo ra để tiến hành chuyển gen vào giống lúa mô hình Kitaake thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, tạo các dòng lúa đột biến (knockout), biểu hiện vượt mức (overexpression) và đánh giá khả năng sinh trưởng, hình thái rễ cùng hiệu suất sử dụng lân dưới các mức xử lý dinh dưỡng Pi khác nhau.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật, Bảo vệ thực vật và Khoa học cây trồng.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình chi tiết ứng dụng hệ thống tái tổ hợp Gateway BP và LR trong thao tác với các plasmid kích thước lớn (>13–17 kb) như pCAMBIA5300 và pOs-Cas9.
  • Phương pháp thiết kế sgRNA kép nhắm đến nhiều exon để loại bỏ đoạn intron mang đa hình SNP bằng công nghệ CRISPR/Cas9.
  • Kỹ thuật tối ưu hóa phản ứng PCR gradient nhiệt độ để nhân bản các phân đoạn promoter có độ dài trên 2 kb từ mẫu gDNA thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao vector pCAMBIA5300 Overexpress được lựa chọn để xây dựng cấu trúc biểu hiện vượt mức gen OsGDPD13?

Vector pCAMBIA5300 Overexpress mang promoter Ubiquitin (Ubi) từ ngô. Theo nghiên cứu của Cornejo et al. (1993), promoter Ubi có khả năng điều khiển mức độ biểu hiện gen chuyển ngoại lai mạnh mẽ và liên tục ở các loài thực vật một lá mầm (như lúa) cao hơn đáng kể so với các tổ hợp promoter/intron khác. Ngoài ra, vector này tích hợp hệ thống Gateway với gen chọn lọc âm tính ccdB, giúp nâng cao hiệu quả tái tổ hợp và giảm thiểu tỷ lệ khuẩn lạc dương tính giả.

2. Thiết kế sgRNA trong nghiên cứu này nhắm đến những vị trí nào trên gen OsGDPD13 và nhằm mục đích gì?

Sản phẩm sgRNA scaffold được thiết kế mang 2 gRNA định vị tại hai vị trí cắt đặc hiệu thuộc exon 3 và exon 4 của gen OsGDPD13. Mục đích của thiết kế này là tạo ra hai vết cắt đứt chuỗi đôi DNA đồng thời nhằm loại bỏ hoàn toàn (knock-out) đoạn intron nằm xen giữa có chứa các đa hình đơn nucleotide (SNP) liên quan đến tính trạng đáp ứng thiếu lân đã được phát hiện qua các nghiên cứu GWAS trước đó.

3. Tại sao phản ứng biến nạp vector pOs-Cas9-sgRNA lại sử dụng chủng vi khuẩn E. coli DB3.1 thay vì DH5α?

Trong quá trình thao tác Gateway LR, vector đích ban đầu hoặc các sản phẩm trung gian có thể còn chứa gen độc lực ccdB. Chủng E. coli DB3.1 mang đột biến kháng lại protein độc CcdB (DNA gyrase không bị bất hoạt), cho phép tế bào sống sót và nhân bản các plasmid mang gen này một cách ổn định trong quá trình thao tác di truyền phức tạp.

4. Kết quả kiểm tra enzyme cắt giới hạn vector pC5300-OsGDPD13OE bằng EcoRI và BamHI cho thấy những phân đoạn nào?

Sau khi phản ứng Gateway BP diễn ra thành công (thay thế đoạn mang gen ccdB bằng đoạn mã hóa gen OsGDPD13), việc cắt đồng thời bằng enzyme EcoRI (cắt tại các vị trí 8399 và 11734 bp) và BamHI (cắt tại vị trí 9012 bp) tạo ra 3 phân đoạn DNA trên gel điện di agarose 1%: phân đoạn khung vector lớn nhất khoảng 10,2 kb, phân đoạn trung bình khoảng 1,8 kb (từ vị trí 9012 đến 11734 bp) và phân đoạn nhỏ khoảng 613 bp (từ vị trí 8399 đến 9012 bp).

5. Kết quả giải trình tự Sanger vùng promoter OsGDPD13 và vùng chèn sgRNA ghi nhận những sai khác nào so với cơ sở dữ liệu?

Giải trình tự vùng promoter bằng các mồi pJET1.2F, pJET1.2R và GDPD13-750F cho thấy một số nucleotide không trùng khớp, trong đó sai khác tại vị trí 865 và 884 lặp lại ở các lần đọc, khẳng định đây là biến dị tự nhiên của vùng promoter ở giống lúa Kitaake. Đối với vector pOs-Cas9-sgRNA, giải trình tự khuẩn lạc số 7 đạt độ tương đồng 99%, trong đó vị trí 868 được xác định là biến dị thực sự trên phân đoạn chèn.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Kiều Trịnh Vân An đã thực hiện thành công việc thiết kế và tạo dòng 3 cấu trúc vector phân tử chuyên biệt gồm pC5300-OsGDPD13OE, pJET1.2/blunt-OsGDPD13promoter và pOs-Cas9-sgRNA phục vụ nghiên cứu chức năng gen OsGDPD13 liên quan đến tính chống chịu thiếu lân ở cây lúa. Các cấu trúc tái tổ hợp đã được thẩm định độ chính xác thông qua phân tích cắt enzyme giới hạn, PCR và giải trình tự Sanger, đồng thời được lưu giữ ổn định trong các dòng tế bào vi khuẩn E. coli DH5α và DB3.1. Công trình cung cấp bộ công cụ di truyền hoàn chỉnh, đặt nền móng kỹ thuật trực tiếp cho các nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa Kitaake nhằm giải mã cơ chế đáp ứng stress dinh dưỡng và hỗ trợ công tác chọn tạo giống lúa sử dụng lân hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------- GRADUATION THESIS TITLE: CONSTRUCTION OF OVEREXPRESS VECTOR, PROMOTER VECTOR AND CRISPR/CAS9 VECTOR FOR OsGDPD13 GENE EDITING IN RICE HANOI – 2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------- GRADUATION THESIS TITLE: CONSTRUCTION OF OVEREXPRESS VECTOR, PROMOTER VECTOR AND CRISPR/CAS9 VECTOR FOR OsGDPD13 GENE EDITING IN RICE Student : KIEU TRINH VAN AN Student code : 637402 Faculty : BIOTECHNOLOGY Supervisor : TO THI MAI HUONG, PhD (USTH) NGUYEN THI THUY HANH, PhD (VNUA) HANOI - 2022 COMMITMENT I hereby declare that this is my research project under the guidance of To Thi Mai Huong, PhD and Nguyen Thi Thuy Hanh, PhD. The results and data in this thesis are truthful have not been published by anyone in any way. I confirm that all information and data from articles and sources of other authors contain full citations and references from official sources. I take full responsibility for this guarantee.

Hanoi, November 24th, 2022 Student Kieu Trinh Van An i ACKNOWLEDGEMENTS First and foremost, I would like to express my deep thanks to To Thi Mai Huong, PhD and Nguyen Thi Thuy Hanh, PhD, who helped and gave me many advices for my graduation thesis. I appreciate the dedicated instruction of To Thi Mai Huong, PhD, she and always made it easy for me to conduct the experiments I needed to finish this graduation thesis. I would like to express my sincere thanks to the Vietnam National University of Agriculture, the Faculty Board and lecturers in the Faculty of Biotechnology for creating an interesting learning environment and supplying me with priceless knowledge and experiences over the past four years. During the course of the thesis at the Plant Biotechnology Laboratory, University of Science and Technology of Hanoi (USTH), To Thi Mai Huong, PhD and lecturers of Life Science Faculty helped me complete my thesis and draw me a lot of experiences.

They are really dedicated to the profession, devote their best and have inspired me great inspiration in scientific research. I want to thank the administration of the University of Science and Technology of Hanoi for making it possible for me to work here once more and everyone who helped me finish my thesis. Finally, I would like to thank my family for always being supportive of me while I wrote my thesis and for always listening to me and offering me wise counsel. Hanoi, November 24th, 2022 Student Kieu Trinh Van An ii TABLE OF CONTENTS COMMITMENT .ii TABLE OF CONTENTS.

iii LIST OF TABLES. v LIST OF FIGURES .vi LIST OF ABBREVIATION. The role of phosphorus fertilizers for rice and its impact on the environment. The role of phosphorus fertilizers for rice.

Impact of phosphorus fertilizers on the environment. Genes related to the tolerance of rice to low-Pi condition. Family of GDPDs. Gateway cloning technique.

MATERIALS AND METHODS. Time and place of study. Genomic DNA, sgRNA. Vectors and primers.

Chemicals and reagents. OsGDPD13 Overexpress Cloning. OsGDPD13 Promoter Cloning. OsGDPD13 Cloning using CRISPR/Cas9 technology.

RESULTS AND DISCUSSION. OsGDPD13 overexpress cloning. coli OsGDPD13 plasmid. BP reaction and transformation in DH5α.

Check Gateway BP cloning by digestion and PCR method. OsGDPD13 promoter cloning. Amplify the promoter of the OsGDPD13 gene from gDNA of Kitaake. Ligation reaction and transformation in DH5α.

Check OsGDPD13 promoter cloning by digestion. Sequencing result of OsGDPD13 promoter region. OsGDPD13 Cloning using CRISPR/Cas9 technology. Check Gateway LR cloning by colony PCR.

Sequencing result of OsGDPD13 Cloning using CRISPR/Cas9 technology. 33 CHAPTER V: CONCLUSION AND RECOMMENDATION. 39 iv LIST OF TABLES Table 3. List of two gRNAs.

List of primers. Component of BP Clonase reaction. Composition of digestion for checking Gateway BP cloning. Composition of PCR reaction for checking Gateway BP cloning.

Composition for gradient PCR. PCR program for gradient PCR. Composition of blunt-end cloning. Composition of digestion for checking blunt-end cloning.

Composition of blunt-end cloning for pJET1.2/blunt- OsGDPD13 vector construction. Composition of LR Clonase reaction .