CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Định luật Lambert-Beer, hay Beer-Lambert, Beer–Lambert–Bouguer, là một định luật có nhiều ứng dụng trong hoá học và vật lý. Định luật này được dựa trên hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ của một dung dịch, và được sử dụng nhiều trong hoá phân tích hữu cơ và vật lý quang học. Định luật Lambert-Beer được tìm ra lần đầu bởi nhà khoa học người Pháp Pierre Bouguer, tuy nhiên những đóng góp quan trọng lại thuộc về Johann Heinrich Lambert và August Beer. Trước khi đi vào tìm hiểu về định luật Lambert Beer, ta cần hiểu thêm về một số những khái niệm cơ bản như: sự hấp thụ bức xạ, độ truyền quang, độ hấp thụ quang của mẫu và mối quan hệ giữa chúng để nắm được các biến số trong phương trình định luật Lambert-Beer.
Trong chương này, ta chứng minh định luật Lambert Beer, đồng thời nêu một số đặc điểm của phương trình định luật Lambert Beer khi ứng dụng trong thực tiễn với mỗi loại phương pháp phân tích khác nhau. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH XÉT NGHIỆM Nhờ sự phát triển của các ngành kĩ thuật quang học, vi điện tử, công nghệ vật liệu, công nghệ hóa học, kĩ thuật máy tính nên các máy sinh hóa đã đạt tự động hóa, độ chính xác và năng suất cao. Máy xét nghiệm sinh hóa sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, sau đây là một số phương pháp phân tích được sử dụng trong máy sinh hóa.1 Phương pháp phân tích theo phổ nguyên tử hấp thụ (AAS) Phương pháp AAS được viết tắt từ phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic Abrsorption Spectrophotometric). Các nguyên tử ở trạng thái bình thường thì chúng không hấp thụ hay bức xạ năng lương nhưng khi chúng ở trạng thái tự do dưới dạng những đám hơi nguyên tử thì chúng hấp thu và bức xạ năng lượng.
Mỗi nguyên tử chỉ hấp thu những bức xạ nhất định tương ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong quá trình phát xạ của 3 chúng. Khi nguyên tử nhận năng lượng chúng chuyển lên mức năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích. Quá trình đó gọi là quá trình hấp thu năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thu nguyên tử.
Chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình bức xạ. Mô tả quá trình như hình 1. 1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống máy AAS Trong đó: 1. Nguồn phát tia bức xạ đơn sắc.
Hệ thống nguyên tử hóa mẫu. Hệ thống đơn sắc và detector. Bộ khuếch đại và chỉ thị kết quả đo. Ưu nhược điểm của phép đo AAS Ưu điểm: - Độ nhạy và độ chọn lọc cao.
- Tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian và không phải sử dụng nhiều hóa chất tinh khiết cao khi làm giàu mẫu. Mặt khác tránh được sự nhiễm bẩn mẫu khi xử lý qua các giai đoạn phức tạp. - Có thể xác định đồng thời hay liên tiếp nhiều nguyên tố trong một mẫu. Các kết quả phân tích rất ổn định, sai số nhỏ.
Nhược điểm: - Hệ thống máy tương đối đắt tiền. 4 - Vì độ nhạy cao nên sự nhiễm bẩn có ý nghĩa tới kết quả phân tích, đòi hỏi môi trường phải rất sạch, dụng cụ và hóa chất có độ tinh khiết cao. - Máy móc khá phức tạp đòi hỏi kỹ sư phải có trình độ cao để bảo trì, bảo dưỡng, sữa chữa. - Nhược điểm chính là ta chỉ biết thành phần nguyên tố của chất ở trong mẫu phân tích mà không chỉ ra trạng thái liên kết của các nguyên tố ở trong mẫu 1.2 Phương pháp đo màu quang điện Phương pháp đo màu quang điện là một trong những phương pháp phân tích thành phần dung dịch dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ của dung dịch chuẩn(có nồng độ xác định).
Phương pháp này chủ yếu dùng để xác định lượng nhỏ của các chất có trong dung dịch, ít tốn thời gian phân tích hơn so với các phương pháp khác. Ngoài ra, trước khi phân tích đo màu thường không cần thiết tách riêng các chất phải xác định. * Định luật đo màu quang điện: Nếu rọi một dòng sáng (cường độ I0) vào một cuvet đựng dung dịch thì một phần của nó (cường độ Ir) bị phản xạ từ mặt cuvet, một phần khác (cường độ Ia) bị dung dịch hấp thụ, còn phần còn lại (cường độ It) đi qua cuvet. Giữa các đại lượng này có hệ thức sau: I0 = Ia + Ir + It (1.1) Trong thực tế, vì đối với một dung dịch phân tích ta chỉ sử dụng 1 cuvet nên cường độ dòng sáng phản xạ là không đổi, nó lại không tăng lên nên ta có thể bỏ qua.
Cho nên phương trình trên có thể đơn giản thành: I0 = Ia + It (1.2) Bằng cách đo lường trực tiếp ta có thể xác định được cường độ dòng sóng dọi vào (I0) và dòng sáng xuyên qua dung dịch nghiên cứu (It). Đại lượng Ia có thể tìm được theo hiệu số của đại lượng I0 và It chứ nó không đo được trực tiếp. * Cơ sở của phương pháp đo màu quang điện: là hiệu ứng quang điện. 5 Hiệu ứng quang điện là hiện tượng electron bị bật ra khỏi nguyên tử của chất dưới tác dụng của dòng sáng rọi vào chất đó.
Nếu các electron bị bật ra khỏi bề mặt của vật thể thì gọi là hiệu ứng quang điện ngoài. Còn nếu các electron bật ra khỏi các nguyên tử nằm sâu trong vật thể thì hiệu ứng đó gọi là hiệu ứng quang điện trong hay hiệu ứng quang điện thể tích. Hiệu ứng quang điện tuân theo những định luật sau: - Hiệu ứng quang điện tăng khi cường độ dòng sáng tăng. - Hiệu ứng quang điện chỉ phát sinh khi chiếu sáng bởi ánh sáng có bước sóng nhỏ hơn một giá trị xác định gọi là giới hạn đỏ của hiệu ứng quang điện.
* Tế bào quang điện: Tia sáng là một dòng các lượng tử năng lượng có năng lượng khác nhau. Khi tia sáng như vậy dọi vào bề mặt kim loại các lượng tử năng lượng bị các nguyên tử hấp thụ. Kết quả nội năng của các nguyên tử ấy tăng lên. Khi đó các electron của nguyên tử chuyển sang những mức năng lượng mới cao hơn.
Nếu lượng tử năng lượng đủ lớn thì electron sẽ đi ra khỏi trường lực hút của hạt nhân nguyên tử và rời khỏi bề mặt kim loại, đó là nguyên nhân của hiệu ứng quang điện ngoài. Tuỳ vào cấu trúc của các tế bào quang điện, có thể phân loại như sau: - Tế bào quang điện có hiệu ứng quang điện ngoài. - Tế bào quang điện có hiệu ứng quang điện trong. - Tế bào quang điện có lớp chắn.
Mỗi tế bào quang điện đặc trưng bởi: - Đặc tuyến quang phổ: đó là đường cong phụ thuộc của cường độ dòng quang điện vào bước sóng của ánh sáng rọi vào tế bào quang điện. - Độ nhạy: là cường độ dòng điện tính ra Micoroampe (10-6 A) phát sinh trong tế bào quang điện, khi rọi lên tế bào đó một dòng sáng cường độ 1lumen (1lumen (1/m) là dòng sáng phát ra bởi vật đen tuyệt đối tại nhiệt độ nóng chảy của platin (1772,30C) từ bề mặt có tiết diện 5,305. 6 - Ngưỡng quang điện: đó là bước sóng lớn nhất mà từ đó tế bào quang điện trở nên trơ với sự chiếu sáng. Tóm lại, với việc áp dụng định luật đo màu quang điện và ứng dụng tế bào quang điện trong quá trình đo ta hoàn toàn có thể xác định được nồng độ các chất ứng với các chỉ tiêu sinh hóa.3 Phương pháp sắc ký Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân tách, phân ly các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp thụ, tính tan). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình háp thụ và phản hấp thu.
Hệ quả là các chất có lực lớn hơn pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách được các chất qua quá trình sắc ký. Mô tả phương pháp sắc khí được trình bày trên hình 1. Cơ sở của phương pháp sắc ký: phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau giữa hai pha động và tĩnh.
Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại của hiện tượng hấp thụ- phản hấp thụ của các chất khi dòng pha động chyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. 2 Mô tả phương pháp sắc ký 1.2 SỰ HẤP THỤ BỨC XẠ ĐIỆN TỪ 1.1 Sự phân loại phổ Phân tích quang phổ là tên gọi chung cho một hệ các phương pháp phân tích quang học dựa trên cơ sở ứng dụng những tính chất quang học của nguyên tử, Ion, phân tử và nhóm phân tử. Ví dụ, tính chất phát xạ hay hấp thụ quang của nguyên tử, tinh chất hấp thụ quang của phân tử, v. Vì vậy tùy theo quan niệm, dựa theo những điều kiện kích thích phổ, phương tiện thu ghi và quan sát phổ, cũng như bản chất của quá trình sinh ra phổ mà người ta có một số cách phân chia thành những phép đo khác nhau, như phép đo phổ phát xạ nguyên tử, hấp thụ nguyên tử, phép đo phổ hồng ngoại,.
Tuy thế, nhưng có hai cách phân chia sau đây là phù hợp hơn: A. Sự phân chia theo đặc trưng của phổ: Theo cách này người ta có những phương pháp phân tích quang học sau: Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, gồm có: a) Phổ pháp xạ nguyên tử b) Phổ hấp thụ nguyên tử c) Phổ huỳnh quang nguyên tử Đây là phổ do sự chuyển mức năng lượng của các điện tử hóa trị của nguyên tử ởtrạng thái khí (hơi) tự do, khi bị kích thích mà sinh ra.