Đặt vấn đề Rau xanh là một món ăn không thể thiếu trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của con người do rau cung cấp nhiều chất khoáng, vitamin, chất xơ. rất tốt cho sức khỏe (Mai Thị Phương Anh và c.s, 1996; Phạm Thị Thùy, 2005). Nhưng rau lại là loại thực phẩm dễ bị ô nhiễm nhất so với các loại nông sản khác. Nguy cơ bị ngộ độc do ăn rau cao hơn các nông sản khác vì rau xanh được người tiêu dùng sử dụng ngay sau khi thu hoạch và rau còn được dùng ăn sống nên những yếu tố gây ô nhiễm trên rau dễ tác động làm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của người tiêu dùng.
Các nguyên nhân chính gây ô nhiễm rau bao gồm: dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, dư lượng nitrat, kim loại nặng và nhiễm các vi sinh vật có hại. Trong đó, ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây hại xảy ra rất phổ biến hiện nay đang là vấn đề được quan tâm đặc biệt. Hiện tại, phương pháp cơ bản được áp dụng trong các hộ gia đình để làm giảm mật độ vi sinh vật gây bệnh trên rau thường là ngâm kết hợp sử dụng nước rửa là dung dịch NaCl hay KMnO4. Những phương pháp trên cho kết quả không triệt để, đặc biệt là đối với nhóm rau được trồng theo thói quen canh tác truyền thống là sử dụng phân chuồng chưa được xử lý triệt để làm phân bón, nên rất mất vệ sinh và không sạch mầm bệnh có thể gây ô nhiễm trên đất và cây trồng sau khi được sử dụng, nhất là đối với loại rau ăn thân và ăn lá (Lương Đức Phẩm, 2001).
Rau lại là thức ăn không thể thiếu trong bữa cơm hàng ngày của mỗi gia đình nên cần có phương pháp xử lý triệt để các vi sinh vật gây bệnh trên rau để mang đến bữa ăn an toàn cho người tiêu dùng. Trong luận văn này chúng tôi đề cập đến bacteriocin là chất phụ gia thực phẩm có khả năng kháng khuẩn. Bacteriocin là những phân tử peptid do vi khuẩn, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic, sinh tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn gây hại trong thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển. 1 Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhóm vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB) vì LAB được xem là vi khuẩn an toàn khi sử dụng trong các thực phẩm.
Bacteriocin được sản sinh bởi vi khuẩn lactic là tác nhân sinh học an toàn trong bảo quản thực phẩm do có những đặc tính ưu việt như không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi protease trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người. Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền. Sobrino-Lo´ pez và c. Bacteriocin phổ biến nhất hiện nay là nisin, một bacteriocin duy nhất được Tổ chức nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm.
Để khảo sát những tác động của bacteriocin, cụ thể là chế phẩm nisin lên mật độ vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống, một loại thực phẩm phổ biến trong cuộc sống của con người, nhưng chứa nhiều ẩn họa khôn lường về các mầm bệnh, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng chế phẩm bacteriocin để kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống”. Mục tiêu nghiên cứu Ứng dụng chế phẩm bacteriocin, cụ thể là chế phẩm nisin, để kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống Nội dung nghiên cứu − Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chế phẩm nisin đối với một số vi sinh vật gây bệnh điển hình trên nhóm rau ăn sống. − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chế phẩm nisin với các nhóm vi sinh vật gây bệnh trên rau ăn sống. − Gây nhiễm và khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của chế phẩm nisin đối với một số vi sinh vật gây bệnh trên mô hình giá đỗ.
− Thí nghiệm ứng dụng thực tế trên rau xà lách. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bacteriocin 1. Khái niệm Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác.
Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chết vi sinh vật. Bacteriocin được tìm thấy lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, được sản xuất bởi một chủng E. coli để chống lại các chủng khác trong dịch nuôi cấy. Thuật ngữ “colicine” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), còn “bacteriocin” được sử dụng bởi Jacob và cộng sự (1953) như là thuật ngữ chung cho các protein có đặc tính kháng khuẩn cao.
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm : - Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. - Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương. - Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm là: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm.
Các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, nhất là có phổ kháng khuẩn rộng. Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định và được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II, lớp III và lớp IV. Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Nisin thuộc bacterioci nhóm này.
Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc. Phân lớp Ia Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm. Nisin là bacteriocin thuộc nhóm Ia, là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid như: lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), didehydroalanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb), với trọng lượng phân tử nhỏ, dưới 5 kDa (Gross và Morell, 1971). Nisin có hai biến thể của bacteriocin này là: nisin A và Z, chỉ khác nhau bởi axit amin 27.
Histidine trong Nisin A được thay thế bằng asparagin trong Zidin Z. Cấu trúc của nisin (Ruiz-Larrea và cs, 2005) Nisin được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng.
Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và 4 các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium. Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra.( Broadbent JR và c.s, 1989) Phân lớp Ib Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện.
Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan, gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn. Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như mersacidine , actagardin, cinnamycin, mutacin A. Riley và cs, 2007).
Lớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc. Lớp IIa Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1. Các sakacin A, sakacin P cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này.
Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cân bằng và thất thoát ion phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn (M. Riley và cs, 2007). Lớp IIb Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptide bổ sung. Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ, cũng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A, L50B) tạo lỗ trên màng tế bào, hoặc chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn (lactococcins Gα/Gβ, Lactococcins M/N và plantaricins EF, JK).
Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK. 5 Lớp IIc Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Nhóm IIc bao gồm tất cả các bacteriocin lớp II không rơi vào nhóm IIa, IIb. Trong phân lớp này tìm thấy có 2 dạng: - Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một và cystibiotics có 2 gốc cystein).
- Kháng khuẩn không có cystein (lactoccin A và acidocin B) 1. Lớp III Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa, không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus.
Đại diện cho nhóm này là halveticin J được sản xuất bởi vi khuẩn L. halveticus 481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin A, lactacin B được sản xuất bởi L.
