Đặt vấn đề Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sông ngòi chằng chịt và khí hậu nóng ẩm, diện tích trồng lúa lớn, và nguồn động thực vật thủy sinh phong phú; đây là những điều kiện thuận lợi để có thể chăn nuôi vịt quanh năm, đặc biệt là nuôi vịt chạy đồng. Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạy đồng ở ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm hơn 70% đàn vịt trong vùng và chiếm 40% trong tổng đàn vịt cả nước (Niên giám thống kê, 2019). Phương thức chăn nuôi này có ưu điểm là tận dụng được thức ăn tự nhiên có sẵn của vùng sông nước, lúa rơi vãi sau thu hoạch của nông dân nhằm giảm đáng kể chi phí trong chăn nuôi. Nhưng điều này cũng là một mối đe dọa lớn cho ngành thú y vì không thể kiểm soát được môi trường chăn thả dẫn đến nguy cơ xảy ra dịch bệnh rất cao.
Một trong những bệnh phổ biến trên đàn vịt chạy đồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long hiện nay là bệnh “limberneck” hay bệnh “cúm cần” theo cách đặt tên của địa phương. Bệnh cúm cần là bệnh trên thủy cầm do ngoại độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum gây ra; thế nên, bệnh còn được gọi là bệnh botulism. Vi khuẩn Clostridium botulinum là vi khuẩn kị khí tuyệt đối, sinh bào tử hình oval và có nha bào, thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng trầm tích, trong xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và dưới nước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin rất mạnh, phá huỷ hoàn toàn thần kinh trung ương (Todar, 2009). Vịt ăn phải độc tố này sẽ xuất hiện các triệu chứng là liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân và tử số cao, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998).
Hiện nay, những trong nhân y và thú y trên thế giới đã và đang nghiên cứu bệnh botulism trên con người và trên các loại gia cầm. Tuy nhiên, những nghiên cứu và thông tin về tình hình về bệnh botulism, yếu tố nguy cơ cũng như đặc điểm sinh học của vi khuẩn Clostridium botulinum tại Việt Nam nói chung, Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng còn khá hạn chế. Với mong muốn thông qua nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin khá toàn diện về vi khuẩn Clostridium botulinum và bệnh do vi khuẩn gây ra trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long. Từ đó, đề tài “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin 1 luan an của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Xác định sự hiện diện vi khuẩn C. botulinum và xác định type độc lực của botulin trên vịt mắc bệnh botulsim. - Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường chăn nuôi VCĐ ở ĐBSCL.
- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C. botulinum phân lập được.3 Những đóng góp mới về khoa học - Đã đưa ra những bằng chứng khoa học xác thực đầu tiên về bệnh liệt mềm cổ trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - Khẳng định sự hiện diện của bệnh nhiễm độc tố botulin trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long. - Xác định được các type độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum gây bệnh liệt cổ trên vịt.
- Kỹ thuật mouse bioassay lần đầu tiên được áp dụng để xác định bệnh nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt ở Việt Nam.4 Ý nghĩa khoa học của luận án Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản có hệ thống về bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long. Từ đó xây dựng được quy trình khoa học trong chẩn đoán xác định bệnh, đồng thời là cơ sở khoa học trong việc xây dựng qui trình phòng trị bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng, cả nước nói chung. 2 luan an Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum Botulism được báo cáo lần đầu ở gà năm 1917 (Dickson, 1917) còn ở vịt được phát hiện lần đầu ở Hoa Kỳ vào những năm 1900 và sau đó vào năm 1923, bệnh được phát hiện ở gà khi ăn giòi (ấu trùng ruồi xanh) và đây là lần đầu tiên C. botulinum type C được phân lập từ loài thân mềm này (Bengtson, 1922).
Đến năm 1930, nhiều tác giả như Giltner and Couch, Gunderson and Hobmairer đã phân lập được C. botulinum type C từ thủy cầm hoang dã bị bệnh tại Hoa Kỳ (Shaw and Simpson, 1936). Ở gia cầm, bệnh còn được gọi là bệnh liệt cổ (limberneck) và bệnh vịt phương Tây (Western duck sickness). Hầu hết gia cầm bị nhiễm C.
botulinum type C và trong ổ dịch thì vịt là loài cảm nhiễm nhất (Rosen, 1971). Bệnh xảy ra nhiều vào những tháng thời tiết nóng hơn là những tháng lạnh (Rocke and Bollinger, 2007). Người không bị ảnh hưởng bởi type C, tuy nhiên thí nghiệm cho thấy khỉ chết sau khi cho ăn gà nhiễm độc tố type C (Giltner and Couch, 1930). Đối với gia cầm, C.
botulinum type E và C được xem là tác nhân chính gây ra bệnh mặc dù một số type khác cũng có khả năng gây bệnh cho gia cầm (Dohms, 1987). Bình thường vi khuẩn sống cộng sinh trong đường ruột gia cầm và không gây bệnh nhưng khi con vật chết thì vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh độc tố. Khi xác động vật phân hủy, ruồi đẻ trứng vào nở ra những ấu trùng (giòi) mang độc tố. Trên mô xác gia cầm chết đã xác định được lượng độc tố type C lớn hơn 2000 liều gây chết tối thiểu (MLD) và trong con giòi chứa lượng độc tố lên đến 104 – 105 liều MLD.
Do đó khi gà, chim, vịt ăn giòi hoặc xác động vật chết sẽ dễ dàng bộc phát bệnh. Trong môi trường nước, các động vật giáp xác nhỏ và ấu trùng côn trùng có thể chứa Clostridium botulinum trong ruột. Khi các loài động vật này chết xác động vật phân hủy sẽ cung cấp một nguồn protein thúc đẩy việc sản xuất các loại độc tố botulin type C trong thịt, trầm tích hoặc vùng đất ngập nước (Bell et al. Botulism gây ra bởi type A và E ở 3 luan an gia cầm hiếm xảy ra và nó thường liên quan với việc sử dụng thức ăn hư hỏng của người để nuôi gà nhà.
Do đặc điểm trên, bệnh thường xảy ra ở những vùng ngập nước vừa rút cạn, nơi có điều kiện ấm áp, môi trường có nhiều xác động vật chết và phân hủy. Các nghiên cứu cho thấy bệnh là nguyên nhân gây chết chủ yếu đối với các loài chim di cư trên toàn thế giới (Wobeser, 1997).2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin Năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện người ngộ độc và chết do ăn dăm bông, gọi là bệnh ngộ độc thịt và năm 1896 tác giả đã xác định được nguyên nhân là Clostridium botulinum, một loại vi khuẩn kỵ khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt. Sau này, các nhà khoa học khác còn thấy chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người. Năm 1928, Tessmer Snipe & Hermann Sommer chiết tách được độc tố từ C.
Năm 1949, Arnold Burgen phát hiện độc tố của C. botulinum làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao. Năm 1960, Alan Scott & Edward Schantz sử dụng độc tố botulin cho các mục đích điều trị (Dressler, 2006) 2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C.1 Phân loại, đặc điểm hình thái Vi khuẩn Clostridium botulinum thuộc chi Clostridium, họ Clostridiaceae, bộ Clostridiales, lớp Clostridia, ngành Firmicutes. Clostridium botulinum cũng được gọi với nhiều tên là Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus, Bacillus botulinus, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus.
Clostridium botulinum có thể phân biệt với các Clostridium khác dựa vào các đặc trưng cấu trúc phân tử theo bảng 2. 4 luan an Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium Các loài Clostridium Đặc điểm botulinum difficile acetobutylicum perfringens tetani Kích thước(bp) 3.250 G+C (%) 28,24 29,06 30,93 28,60 28,75 Chuỗi mã hoá 3650 3774 3740 2660 2368 Mật độ mã hoá 0,93 0,87 0,93 0,87 0,85 Kích thước gen 875 943 920 946 1011 trung bình (bp) r ARN 9 11 11 10 6 t ARN 80 87 73 96 54 (Mohammed Sebaihial et al. botulinum là một trực khuẩn thẳng hai đầu tròn, dài từ 4–6 µm, rộng từ 0,9–1.2 µm, có thể đứng riêng lẻ hay tập trung thành song trực khuẩn, có khi thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn có đường glucose vi khuẩn có dạng sợi dài, vi khuẩn có nha bào.
Nha bào có tính đề kháng cao nhưng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200C trong 15 phút trong khi độc tố bị phá hủy ở nhiệt độ 1000C trong 20 phút. Nha bào có hình trứng nằm ở một đầu vi khuẩn. Vi khuẩn có 4 – 8 lông quanh thân, nhưng di động không mạnh (Quinn et al, 1994).1 Hình dạng vi khuẩn C. botulinum và nha bào (mũi tên) (Nguồn: Yeh et al.2 Đặc tính nuôi cấy C.
botulinum là loại vi khuẩn yếm khí tuyệt đối. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 28–30oC, độ pH 8,2–8,5. Trong nước thịt yếm khí có đường glucose: canh khuẩn mọc đều, sản sinh nhiều hơi, có cặn lắng dưới đáy, sau đó canh khuẩn trở nên trong và có mùi butyric. Thạch Vaillon hình thành những khuẩn lạc trong suốt, dần dần trở nên đục, màu nâu nhạt, vi khuẩn sản sinh nhiều hơi làm nứt thạch hoặc vỡ thạch, môi trường có mùi butyric.
Môi trường Gelatin có glucose: cấy chích sâu vi khuẩn mọc tốt theo đường cấy, sản sinh nhiều hơi và làm tan chảy chậm. Nước thịt yếm khí có óc: làm đen óc. Thạch máu: dung huyết sau khi nuôi cấy 3–4 ngày.3 Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn lên men có sinh hơi glucose, mantose, levulose, dextrin. Lên men không đều galactose, saccarose, lactose, raffinose, xylose, dunxit, maltose, arabinose, salixin.
Trực khuẩn hóa lỏng nhanh gelatin. Không sinh indole nhưng sinh H2S (Nguyễn Như Thanh et al.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium (Quinn et al., 1994) Thạch lòng Tiêu hóa Casein Sinh axit Sản sinh Indol đỏ trứng gà Loài Lecithinase Glucose Clostridium Maltose Sucrose Lactose Lipase C.