Chương 1: Tổng quan Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Canida albicans, Pichia sp. [14][29][44]; xạ khuẩn: Thermomonospora sp. [44] đều có khả năng tổng hợp nano kim loại. Thực vật Thực vật là sinh vật sản xuất, được xem là nhà máy quang dưỡng đầu tiên trong dây chuyền sản xuất, tạo ra lượng sinh khối lớn nhất.
Thực vật hấp thu gần 75% năng lượng mặt trời, sau đó chuyển hóa thành năng lượng hóa học và glucose. Một vài loại thực vật có khả năng tích lũy kim loại trong tế vào. Sinh khối hoặc dịch chiết thực vật (có thể dùng thân, rễ, lá, hoa, quả, vỏ, hạt, …) được dùng cho quá trình tổng hợp, ngoài ra nano kim loại có thể được tích lũy bên trong tế bào thực vật. Các báo cáo cho thấy các hợp chất thứ cấp, enzyme, protein hoặc những hợp chất có khả năng khử, tham gia chuỗi truyền điện tử đều có khả năng tham gia vào quá trình tổng hợp hạt nano kim loại [43].
Ngoài vi sinh và thực vật, tế bào dị dưỡng, tảo và tảo cát cũng được chứng minh có khả năng tích lũy các loại kim loại trong tế bào [43] 1.4 Một số nghiên cứu làm cơ sở lý thuyết trong tổng hợp nano bạc bằng phƣơng pháp sinh học Như đã trình bày, rất khó khăn cho việc xác định cụ thể phân tử hoặc quá trình nào chịu trách nhiệm trực tiếp cho sự hình thành hạt nano. Hiện nay có ba cơ sở chính giải thích cho quá trình tạo hạt nano ở vi sinh vật.1 Sự tham gia của các enzyme oxi hóa-khử Trong tổng hợp nano bạc bằng vi sinh vật nói chung, vi khuẩn nói riêng, nitrate reductase là enzyme được nghiên cứu nhiều nhất trong việc xác định cơ chế tổng hợp nano bạc. và cộng sự (2007) đã tinh sạch nitrate reductase từ chủng nấm mốc Fusarium oxysporum để tổng hợp nano bạc, enzyme mà nhóm tác giả tinh sạch được có trọng lượng phân tử 44,1 kDa. Quá trình tổng hợp nano bạc gồm có AgNO3 1 mM được pha trong đệm phosphate, phytochalein, 4-hydroxyquynoline 1 mM, - NADPH 1mM và nitrate reductase.
Dịch keo nano bạc tổng hợp được có đỉnh hấp -9- Chương 1: Tổng quan thu là 413 nm, hạt có kích thước từ 10 – 25 nm [35]. Quá trình được tóm tắt như sau: NO3- nitrate reductase Ag+ Ag0 NADH NAD+ Cơ chế có thể xảy ra như mô tả của Kalimuthu K. và cộng sự (2008) ở hình 1. và cộng sự (2010) cũng đã tiến hành tối ưu hóa môi trường nuôi vi khuẩn B.
licheniformis mục đích thu nhận nitrate reductase có hoạt tính cao để tổng hợp nano bạc [56].7: Cơ chế tạo bạc nguyên tử ở tế bào B. và cộng sự (2011) đã tinh sạch laccase từ nấm Paraconiothyrium variabile dùng trong tổng hợp nano vàng [19]. Từ đó cho thấy những enzyme này cũng có thể tham gia vào quá trình khử ion Ag+. Ngoài ra, trong nghiên cứu của Prathna và cộng sự (2010) cho thấy có sự tham gia của cysteine desulfhydrase (C-S lyase) trong quá trình tổng hợp nano CdS từ chủng Rhodopseudomonas palutris, enzyme phytochelatin synthase tạo hợp chất phytochelatin ở Schizosaccharomyces pombe trong tổng hợp nano CdS [44].
-10- Chương 1: Tổng quan 1.2 Sự tham gia của các acid amin có tính khử trong protein Saifuddin N. và cộng sự (2009) xác định trong quá trình tổng hợp nano bạc bằng canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi bằng môi trường LB có sự tham gia của nitrate reductase với hoạt tính 152 nmol/h/ml, hạt nano bạc tổng hợp có kích thước 5 Hình 1.8: Phản ứng tyrosine khử Ag+ thành Ag 0 [59] – 50 nm. Tuy nhiên tác giả cũng nhận định có sự có mặt của 2 acid amin trong protein là tyrosine và tryptophan tham gia vào quá trình khử ion Ag+ cũng như protein tăng cường khả năng ổn định dịch keo nano bạc [46]. Vai trò của tyrosine trong tổng hợp nano bạc cũng được Zaheer Z.
và Rafiuddin (2012) xác định, nhóm tác giả đã tổng hợp nano bạc bằng tyrosine với sự tham gia của cetyltrimethylammonium bromide, nhóm –OH trên phân tử tyrosine được cho là tham gia vào quá trình khử ion Ag+, được mô tả ở hình 1.3 Các chất có tính khử có mặt trong tế bào Trong tế bào chứa hàng ngàn phân tử, mỗi phân tử có thể đóng vai trò trong các bước tạo thành nano. Nghiên cứu của Singh B. và cộng sự (2011) thu nhận surfactin từ Bacillus amyloloquifaciens KSU-109 để tổng hợp nano CdS [49]. Hay nghiên cứu của Jha và cộng sự (2009) ngoài sự tham gia của các enzyme, tác giả cũng giải thích các hợp chất quinone tham gia vào quá trình khử [29].
Trong nghiên cứu của Hosseini-Abari A. và cộng sự (2014) cho thấy vai trò của dipicolinic acid được tiết từ bào tử Bacillus stratosphericus trong quá trình tổng hợp nano bạc, các enzyme nitrate reductase, laccase, catalase được xác nhận không hiện diện trong phản ứng [25]. -11- Chương 1: Tổng quan 1.5 Nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 1.1 Trên thế giới Sử dụng vi sinh vật trong tổng hợp nano bạc được nhiều nhà khoa học ở nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu theo hai hướng chính là tổng hợp ngoại bào và nội bào. Một số nghiên cứu gần đây như: Elbeshehy và cộng sự (2015) phân lập các chủng Bacillus pumilus, B.
licheniformis ở đại học King Abdulaziz, Saudi Arabia có khả năng tổng hợp nano bạc ngoại bào, dung dịch nano bạc có khả năng kháng khuẩn và kháng virus [17]. Năm 2014, mhóm tác giả Hassan K. (2014) tổng hợp nano bạc bên trong tế bào S. cerevisiae có bổ sung glucose làm chất cho điện tử, thời gian tổng hợp là 72 giờ, hạt có kích thước 2 – 20 nm [25].
Bằng sáng chế CN103555769 được cấp cho Zang Xin và cộng sự vào năm 2014 cho phương pháp tổng hợp ngoại bào nano bạc từ dịch lọc không tế bào Bacillus subtilis Jaas ed1. Dịch lọc không tế bào được trộn với dung dịch AgNO3 để tổng hợp nano bạc ở nhiệt độ phòng trong 24 – 72 giờ. Dịch keo nano bạc tổng hợp có đỉnh hấp thu khoảng 450 nm và có kích thước hạt 20 – 50 nm [62]. Công bố của Hosseini-Abari A.
và cộng sự (2014) cho thấy bào tử vi khuẩn Bacillus stratosphericus có khả năng tổng hợp nano bạc. Nhóm tác giả sử dụng môi trường làm giàu bào tử DSM để nuôi B. stratosphericus, tế bào và bảo tử được thu nhận dùng cho tổng hợp nano bạc. Phản ứng được thực hiện trong 5 – 20 giờ, hạt nano bạc hình thành bám vào bề mặt bào tử và bên ngoài có kích thước 2 – 20 nm, nhiều hình dạng, bước sóng hấp thu cực đại của dịch keo là 410 – 420 nm.
Nghiên cứu cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn của dịch keo nano bạc trên 5 chủng vi khuẩn khảo sát [25]., và cộng sự (2009), Kannan N. và cộng sự (2011), Kumar C. và cộng sự (2011) sử dụng E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa cho quá trình tổng hợp nano bạc [22],[31], [34].
-12- Chương 1: Tổng quan Khả năng kháng khuẩn của dịch keo nano bạc được nghiên cứu khoảng vào đầu thế kỷ 20, tuy nhiên ít được quan tâm vì những thành quả của thuốc kháng sinh. Những năm gần đây, công nghệ nano ngày càng phát triển và số lượng lớn vi khuẩn kháng kháng sinh tăng nhanh nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trong lĩnh vực y sinh học được quan tâm nhiều hơn và phát triển mạnh mẽ. Hiện nay nano bạc được biết đến với khả năng kháng khoảng 650 loài vi khuẩn [8]. Theo nghiên cứu của Li W.
và cộng sự (2010), ion Ag+ gấy ức chế quá trình trao đổi phosphate, làm thất thoát các phosphate được tích lũy, tạo phức với DNA, ức chế mạnh DNase từ nấm, làm bất hoạt các enzyme mà chất cho điện tử hoạt động có chứa lưu huỳnh, oxy hay nitơ, ức chế quá trình oxy hóa glucose, glycerol, fumarate, succinate trong E. Đó là tác động của ion Ag+, mặc dù tương tác của nano bạc đến vi khuẩn chưa được biết rõ, nhưng cơ chế hoạt động của nó có thể được miêu tả qua hình thái và cấu trúc những thay đổi bên trong tế bào vi khuẩn. Khi cho tế bào E. coli tiếp xúc với nano bạc trong thời gian ngắn, nano bạc tấn công màng tế bào, khi vào bên trong, nano bạc tấn công vào chuỗi hô hấp, cuối dùng dẫn đến cái chết tế bào [36].
Nghiên cứu của Mirzajani và cộng sự (2013) cũng cho kết quả tương tự đối với vi khuẩn B.9 cho thấy tác động của hạt nano bạc đến màng tế bào.9: Ảnh TEM cho thấy tác động của nano bạc đến tế bào vi khuẩn - a, d: trước khi tiếp xúc với nano bạc; b, c, e, và f: sau khi tiếp xúc với nano bạc 2 giờ [41] -13- Chương 1: Tổng quan Cơ chế kháng nấm của nano bạc cũng tương tự như kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu của Gopinath V. Do hạt nano bạc có khả năng cho proton nên chúng có thể phản ứng với các chất oxy hóa, bắt các gốc tự do. Ngoài ra khả năng này còn phụ thuộc vào hình dạng và kích thước của hạt nano bạc.
Nano bạc còn có khả năng kháng viêm vì nó có thể ức chế hoạt tính matrix metalloproteinase. Nghiên cứu của Jain J. và cộng sự (2009), với nồng độ 100 µg/ml, dịch keo nano bạc gần như ức chế hoàn toàn hoạt tính của matrix metalloproteinase-2 (gelatinase A) [27]. Nano bạc còn được dùng trong điều trị vết bỏng, tổn thương do bệnh tiểu đường.
Vì vậy nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm của hạt nano bạc là cần thiết. Một câu hỏi luôn được đề cập liệu nano bạc có gây độc hay không. và cộng sự (2010) đã tập hợp các nghiên cứu của nhiều nhà khoa học cho thấy: trong nghiên cứu in vitro, với một nồng độ nhất định, nano bạc gây độc với tế bào phổi, gan, não. Ngoài ra, nano bạc cũng có tác động đến các động vật khác như cá Danio rerio, ruồi Drosophila melanogaster, giun Caenorhabditis elegans [11].
Cơ chế tác động có thể bao gồm cảm ứng tạo các phản ứng ROS (reactive oxygen species – phản ứng chứa oxy), stress oxy hóa, làm hư hỏng DNA và quá trình apoptosis [11]. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Jain J. và cộng sự (2009) thì thời gian nano bạc gây stress oxy hóa tồn tại không đủ lâu để tổn thương đến tế bào, nồng độ gây apoptosis cũng được xác định là 250 µg/ml, và kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả cũng cho thấy nano bạc là một giải pháp thay thế an toàn cho thuốc kháng sinh [27]. Nano bạc cũng cho thấy có tiềm năng trong việc chữa các bệnh mà đòi hỏi duy trì sự tập trung của thuốc hoặc mục tiêu là những tế bào, cơ quan đặc biệt như ung thư, HIV [11].
Nghiên cứu của Elechiguerre J.