Luận văn: Tổng hợp alkyl cacboxylat của Naphtol AS nhuộm esterase bạch cầu mono

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tổng hợp alkyl cacboxylat của Naphtol AS làm cơ chất nhuộm esterase, ứng dụng xác định đặc hiệu tế bào bạch cầu dòng mono.

• Tác giả: Tran Thi Thanh Tam
• Người hướng dẫn: TS. Nguyen Thi Son Hie
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Tổng hợp các Alkyl Carboxylat của Naphthol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm Esterase đặc hiệu tế bào bạch cầu dòng Mono
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu bạch cầu mono

Cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu bạch cầu mono là những hợp chất hóa học được sử dụng trong chẩn đoán và phân loại các bệnh lý về máu, đặc biệt là bệnh bạch cầu cấp dòng mono. Các cơ chất này dựa trên nền tảng của naphtol AS và các誘dẫn chất của nó như naphtol AS-OL và naphtol AS-CA. Những hợp chất này có khả năng phản ứng với enzyme esterase có trong các tế bào bạch cầu, tạo ra màu sắc đặc trưng giúp nhận diện và phân biệt các loại tế bào khác nhau. Ứng dụng của nhuộm esterase rất quan trọng trong lâm sàng vì nó giúp xác định chính xác loại bệnh bạch cầu mà bệnh nhân đang mắc phải, từ đó hỗ trợ bác sĩ lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

1.1. Định nghĩa và tính chất cơ bản của naphtol AS carboxylat

Naphtol AS carboxylat là các dẫn xuất hữu cơ được tổng hợp từ naphtol AS thông qua phản ứng este hóa với các axit cacboxylic. Các alkyl carboxylat như butanoat, propanoat, hexanoat của naphtol AS, AS-OL và AS-CA đều có khả năng tan trong dung môi hữu cơ và tương tác mạnh với enzyme esterase. Tính chất vật lý và hóa học của những hợp chất này làm cho chúng trở thành chất nhuộm lý tưởng trong chẩn đoán hematology.

1.2. Vai trò trong chẩn đoán bệnh bạch cầu

Phương pháp nhuộm esterase đặc hiệu giúp phân biệt các dòng tế bào khác nhau thông qua mức độ hoạt tính enzyme. Bạch cầu mono thể hiện hoạt tính esterase cao, còn các loại bạch cầu khác có mức độ khác nhau. Kết quả nhuộm rõ ràng giúp xác định chính xác mô hình bệnh lý và hỗ trợ điều trị hiệu quả.

II. Quá trình tổng hợp các alkyl carboxylat của naphtol AS

Quá trình tổng hợp các alkyl carboxylat naphtol AS được thực hiện thông qua phản ứng este hóa truyền thống và các phương pháp cải tiến hiện đại. Đầu tiên, naphtol AS được làm phản ứng với các axit cacboxylic trong điều kiện kiểm soát nhiệt độ, dung môi, tỷ lệ chất tham gia và thời gian phản ứng cụ thể. Các nhân tố ảnh hưởng chính bao gồm lựa chọn dung môi hữu cơ (như DMF, DMSO), tỷ lệ mol giữa naphtol và axit, nhiệt độ phản ứng (thường 80-120°C) và thời gian phản ứng (4-8 giờ). Sử dụng mô hình thực nghiệm nhân tố giúp tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp, đạt được hiệu suất cao lên đến 70-85%. Sản phẩm được tinh sạch bằng sắc ký cột và xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật IR, ¹H-NMR, ESI-MS.

2.1. Các dung môi và điều kiện phản ứng tối ưu

Dung môi DMF được chứng minh là lựa chọn tối ưu nhất với hiệu suất cao nhất, theo sau là DMSO. Nhiệt độ 100-110°C và thời gian 6 giờ cho kết quả tốt nhất. Tỷ lệ mol naphtol:axit từ 1:2 đến 1:3 giúp chuyển hoá hoàn toàn chất tải.

2.2. Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp

Các phổ IR, ¹H-NMR và ESI-MS xác nhận sự hình thành liên kết este và cấu trúc phân tử. Peak C=O tại 1720-1750 cm⁻¹ trong IR, các tín hiệu proton aromatic trong ¹H-NMR và M⁺ trong ESI-MS đều khẳng định thành công tổng hợp.

III. Ứng dụng trong nhuộm esterase bạch cầu mono

Nhuộm esterase sử dụng các alkyl carboxylat naphtol AS là phương pháp chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng mono. Khi enzyme esterase trong tế bào bạch cầu mono tiếp xúc với cơ chất, nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, giải phóng naphtol AS và tạo ra phức hợp màu xanh-đen đặc trưng. Mức độ nhuộm sâu và rộng phản ánh hoạt tính esterase cao của tế bào mono. Phương pháp này có độ nhạy cao (95-98%) và độ đặc hiệu vượt trội (98-100%) so với các phương pháp nhuộm khác. Bằng cách quan sát mức độ và phân布của màu sắc dưới kính hiển vi, bác sĩ có thể xác định chính xác bệnh bạch cầu dòng mono và phân biệt với các dòng bệnh lý khác, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho chẩn đoán lâm sàng và quyết định điều trị.

3.1. Cơ chế phản ứng nhuộm esterase

Enzyme esterase xúc tác thủy phân alkyl carboxylat naphtol AS, giải phóng naphtol AS. Naphtol này kết hợp với diazo hợp chất tạo azo dye màu xanh-đen. Bạch cầu mono với hoạt tính esterase cao cho tín hiệu dương mạnh mẽ, giúp nhận diện chính xác.

3.2. Độ nhạy độ đặc hiệu và ý nghĩa lâm sàng

Phương pháp nhuộm esterase đạt độ nhạy 95-98% và độ đặc hiệu 98-100%, vượt trội hơn nhuộm peroxidase. Kết quả rõ ràng, nhanh chóng giúp xác định bệnh và bắt đầu điều trị sớm, cải thiện tiên lượng bệnh bạch cầu cấp.

IV. Hướng phát triển và triển vọng nghiên cứu

Nghiên cứu về cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu bạch cầu mono tiếp tục phát triển với mục tiêu cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu và tốc độ phản ứng. Các nhà khoa học đang khám phá những naphtol AS誘dẫn chất mới có khả năng phản ứng nhanh hơn và tạo ra tín hiệu rõ ràng hơn. Sự kết hợp giữa nhuộm esterase và các kỹ thuật hiện đại như flow cytometry, immunophenotyping đang mở ra những khả năng mới trong chẩn đoán hematology. Các cơ chất carboxylat tổng hợp mới với tính chất vật lý-hóa học cải tiến sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán lâm sàng. Ngoài ra, tối ưu hóa quy trình tổng hợp để giảm chi phí và tăng khả năng tiêu chuẩn hóa sẽ thúc đẩy ứng dụng rộng rãi hơn trong các phòng xét nghiệm. Hướng phát triển dài hạn hướng tới **tạo ra các cơ chất có độ ổn định tốt, độ chọn lọc cao cho nhiều loại bệnh huyết học khác nhau.

4.1. Các cơ chất naphtol AS誘dẫn chất tiên tiến

Nghiên cứu tập trung phát triển các naphtol AS thế mới với khối lượng phân tử tối ưu, độ tan cao trong nước và khả năng phản ứng enzyme tăng cường. Naphtol AS-CA carboxylat đang được chú ý vì tính chất ưu việt. Mục tiêu là tạo ra cơ chất phổ quát cho nhiều loại enzyme, giảm chi phí, tăng tốc độ.

4.2. Ứng dụng trong các công nghệ chẩn đoán tương lai

Kết hợp nhuộm esterase với kỹ thuật phân tích ảnh tự động, AI sẽ nâng cao độ chính xác và giảm lỗi nhân tố. Phát triển test kit tiêu chuẩn hóa giúp đồng nhất kết quả giữa các phòng xét nghiệm trên toàn quốc, cải thiện chất lượng chẩn đoán bệnh bạch cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRAN THI THANH TAM TONG HOP CAC ALKYL CACBOXYLAT CUA NAPHTHOL AS; AS-OL; AS-CA LAM CO CHAT NHUOM ESTERASE DAC HIEU TE BAO BACH CAU DONG MONO LUAN VAN THAC Si KHOA HOC Ha Ndi — 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRAN THI THANH TÂM TONG HOP CAC ALKYL CACBOXYLAT CUA NAPHTHOL AS; AS-OL; AS-CA LAM CO CHAT NHUOM ESTERASE DAC HIEU TE BAO BACH CAU DONG MONO Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 8440112.02 LUAN VAN THAC Si KHOA HOC NGUOI HUONG DAN KHOA HOC: TS. Nguyén Thi Son Hie TS. Trần Văn Tính(ZZ“é” —~ Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN xi n gử i lờ i cả m ơn tớ i TS. Ng uy n Gr Với lòng kính trọn g và bi ết ơn sâ u sắ c, tô i ao đề tà i và tậ n tì nh hư ớn g dẫ n ch ỉ dạ y.

gi úp đỡ Thi Son va TS. Tr ần Vă n Tí nh đã gi i có th ể ho àn th àn h bà i Kh óa lu ận tố t ng hi ệp nà y. tạo điều kiện thuậ n lợ i nh ất đẻ tô ết ơn tớ i cá c th ầy cô tr on g bộ mô n Hó a họ c Hữ u cơ Toi xi n bà y tỏ lò ng bi áo tr on g kh oa Hó a họ c tr ườ ng Da i ho c Kh oa ho e cũng nh ư to àn th ể cá c th ầy cô gi n- Đạ i họ c Qu ốc gi a Hà Nộ i đã tr uy ền dạ y ch o em nh ữn g trí th ức. kí nh Tự nh iê tr ưở ng th àn h tr on g nh ận th ức và ng hi ên cứ u kh oa họ c nghi ệm qu ý bá u để em đư ợc như ngày hôm nay.

và cá c bạ n si nh vi ên ph òn g Tô ng hợ p Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô y ễ n Th ị Th u Th ủy. N g u y ễ n C ô n g Ch ín h hữu cơ III đặc biệt là các bạn sinh viên Ngu và Trần Thị Ng a đã gi úp đỡ tậ n tì nh qu á tr ìn h ng hi ên cứ u. nh iệ t tì nh củ a cá c bạ n bè. nh ữn g ng ườ i Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ độ ng vi ên tô i ho àn th àn h tố t bà i đề tà i thân trong gia đình luôn bên cạnh cô vũ nghiên cứu này.

Xi n cả m ơn tớ i tât cả mọ i ng ườ i. Tac gia Tran Thi Thanh Tam MỤC LỤC (9. 1 CHUONG 1 - TONG QUAN 0. Giới thiéu hop chat Naphtol AS-thé cacboxylat.

Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat. Tính chất của các alkyl cacboxylat của 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2- V1 CACDOX lat. Tinh chat vat ly. Tinh chat ph6.

Tính chất hóa hoc. Ứng dụng để nhuộm esteraza bach cau TIBƯỜII. Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh. Giới thiệu VỀ €St€TaZ4.:--ccc 2 tt tt tt tri 11 1.

Co chat dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu nƯười. 16 CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM. Đối tượng nghiên cứu.----- 2-22 +++2x+2E+£EE+2EE+SEEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEksrkrrrrres 19 2. Phuong phap nghién COU.

Hóa chất và thiết bị.------ 22+ tt HH re 19 2.--cc:-+c2cvtttt th th HH He 19 2. Các dụng cụ và thiết bj. Các phần mềm sử dụng.-- -- ¿%5 EEE+EE+E£E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEErEErkerkrrkrree 21 2. Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm.

Tông hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA. Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym. Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL và AS-CA băng phương pháp truyền thống [5, 7]. Nghiên cứu tôi ưu hóa phản ứng nhuộm esferaza.

Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm. TÀI LIỆU THAM KHAO .ccccccccssssscsesescscscscsecscecscscscscsvsveeusssacacacacacsvavaveveeaeecacaeee PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã được thương mại TOA. Bảng phân loại bệnh ung thu máu dong mono theo FAB b6 sung Marker Va i truyén [8].

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phan ứng. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản Ứng. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suat.

Các nhân tổ và mức được xét trong mô hình thực nghiệm. Bảng ma trận mô hình mẫu nhân tố thực nghiệm. Bảng kết quả tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và Bảng 3. Kết quả số liệu phô IR va ESI-MS cua cac naphtol AS-thé cacboxylat.

Kết quả dữ liệu phố 'H-NMR của 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl CACOXVÏAÍK. 0 G1 HH TT HH TH tk 38 Bang 3. Kết quả nhuộm theo phương pháp nhân tố thực nghiệm. Hiệu suất thu được ở vùng tối ưu.

Độ nhạy và độ đặc hiệu của các cơ chất 3-[(N-phenyl thé) cacbamoyl|naphtalen-2-yl cacboxylat tong hop được.-------:--s¿+-sz5-sz+: 49 Bảng 3. Diém nhuộm của các naphtol AS thế cacboxylat.----- 55252 49 DANH MỤC HÌNH SƠ đồ Ì. Đồ thị biêu diễn ảnh hưởng của bản chất dung môi đến hiệu suất của phản 5 ÔÖÔÖ5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của ty lệ tác nhân tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản Ứng.

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất của SAN PAM. Anh chup sac ky ban mong ctia Naphtol AS-OL butanoat téng hop theo phương pháp truyền thống (ảnh trái) và phương pháp cải tiến (ảnh phải). Phổ IR của Naphtol AS-OL, bufanoat.

Phố 1H-NMR của Naphtol AS-OL, butanoat.----- 2-52 5z scs+zsss2 41 Hình 3. Phé ESI - MS của Naphtol AS-OL butanoat. Sơ đồ phân mảnh của hợp chất Naphtol AS-OL butanoat (3b3). Đồ thị Pareto các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhuộm esteraza dòng 00:11.

Ảnh nhuộm naphtol AS propanoat.---2- 52 52 ©5+22s£2£++2z++zx+zzxz 50 Hình 3. Ảnh nhuộm naphtol AS-CA_ axetat. Ảnh nhuộm naphtol AS axetat không có chất ức chế NaF. Ảnh nhuộm naphtol AS axetat có chất ức chế NaF.--- 50 DANH MỤC CHỮ VIÉT TAT C.S Cộng sự Da Dalton THF Tetrahydrofuran DMF Dimethylformamide DMSO Dimethy] sulfoxide EC Uy ban Enzym (The enzyme commission ) NSE Nhuộm Esteraza không đặc hiệu (Esteraza).

NSE+NaF | Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF. FAB | Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (FErench-American-British) IUB Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry) LI Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho đã biệt hóa (Acute Iymphoblastic) L2 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chưa biệt hóa (Acute lymphoblastic) L3 Bệnh bạch cầu cấp dong lympho loai Burkitt (Acute lymphoblastic) M0 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimally differentiated acute myeloid). MI Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ không có tế bào trưởng thành (Acute myeloblastic without maturation). M2 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ có tế bào trưởng thành (Acute myeloblastic with maturation).

M3 Bénh bach cau cap dong tién tuy (Acute promyelocytic). M4 Bénh bach cau cap dong tuy-monoxit (Acute myelomonocytic). MS Bénh bach cau cap dong monoxit (Acute monocytic). M6 Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu (Erythroleukemia).

M7 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiêu cầu (Acute megakaryoblastic). NaOH Sodium hydroxide EGME ethylene glycol monomethy! ether NaOH Sodium hydroxid NaF Sodium fluorid NAS Naphtol AS (Naphthol AS) NASD Naphtol AS-D (Naphthol AS-D) NASDCI | Nhuộm esteraza đặc hiệu (Naphthol AS-D chloroaxetat) Tne Nhiét d6 nong chay Ts Nhiệt độ sôi WHO Tổ chức Y té thé gidi (World Health Organization) MO DAU Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thư máu là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [I]. Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất đa cam đioxin do chiến tranh để lại [2]. Theo thống kê của tổ chức sức khỏe thế giới WHO năm 2018, ở Việt Nam, tỉ lệ ca mắc mới bệnh ung thư máu chiếm 3.99% và đứng thứ 7 và tỉ lệ người chết chiếm 4.55%, đứng thứ 5 trong các bệnh ung thư [24].

Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lan at các tế bào tủy và xuất hiện ở máu ngoại vi. Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn về protein và cấu trúc tế bào. Bệnh gồm nhiều thê loại khác nhau, theo tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt là tiêu chuẩn FAB) được ký hiệu từ M0 đến M7 va L1 đến L3 [22]. Việc xác định đúng, nhanh chóng thê bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh.

Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo tiêu chuẩn FAB chủ yếu dựa trên kết quả của ba phương pháp: miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào. Phương pháp miễn dịch và di truyền được làm trên các máy móc hiện đại nên độ chính xác cao, nhưng giá thành đắt, khó tiếp cận đối với bệnh nhân nghèo. Do dễ thao tác, giá thành thấp hơn so với hai phương pháp trên, nên nhuộm hóa học tế bào vẫn được dùng rộng rãi trong nhiều bệnh viện và cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam. Nhuộm hóa học tế bào gồm nhiều kỹ thuật, trong đó nhuộm esteraza không đặc hiệu dùng cơ chất naphtol AS axetat ức chế bằng NaF được sử dụng để phân loại tế bào monoxit với dòng tủy.

Bình thường, phản ứng nhuộm esteraza lên đương tính ở tất cả các dòng tế bào vì thế được gọi là kỹ thuật nhuộm không đặc hiệu, khi sit dung NaF lam chất ức chế thì chỉ có dòng tế bào monoxit bị ức chế hoàn toàn. Dựa vào đặc tính này để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác. Kỹ thuật phát hiện enzyme esteraza chịu sự tác động của rất nhiều yêu tô như: nhiệt độ, thời gian nhuộm, nông độ cơ chât, tác dụng của chât ức chê và hoạt hóa,. dễ dẫn đến kết quả sai khác so với yêu cầu của phân loại bạch cầu của EAB dẫn tới nhận định sai kết quả, ảnh hưởng đến hiệu quả khám chữa bệnh và gây tốn kém cho người bệnh.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono” là một đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và xã hội sâu sắc.