Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Dịch tả heo Châu Phi (ASF) là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây tỷ lệ chết lên đến 100% ở heo nhà và heo rừng, ảnh hưởng nặng nề đến ngành chăn nuôi heo toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH), từ năm 2017 đến đầu năm 2019, hơn 20 quốc gia đã ghi nhận dịch bệnh, với hơn 1,09 triệu con heo bị tiêu hủy. Tại Việt Nam, từ tháng 2/2019 đến tháng 3/2020, dịch đã lan rộng ra 63 tỉnh, thành phố, buộc tiêu hủy gần 6 triệu con heo, tương đương 9,67% tổng trọng lượng heo hơi cả nước, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm vi-rút ASF tại trang trại là yếu tố then chốt để ngăn chặn sự lây lan và giảm thiểu thiệt hại.

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu hóa phương pháp chẩn đoán vi-rút ASF với độ nhạy và độ đặc hiệu cao thông qua kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) kết hợp với thiết bị vi lưu kỹ thuật số (Digital Microfluidics - DMF). Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12/2022 đến tháng 9/2023 tại Phòng thí nghiệm Lab on a chip và Cảm biến Sinh học, Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, cùng Phòng thí nghiệm Bệnh viện Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán nhanh, chính xác, hỗ trợ kiểm soát dịch bệnh ASF tại Việt Nam và các quốc gia có nguy cơ cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai nền tảng lý thuyết chính:

  1. Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA): Đây là kỹ thuật khuếch đại axit nucleic ở nhiệt độ thấp (37-42°C) trong thời gian ngắn (5-20 phút), sử dụng enzyme recombinase, protein SSB và DNA polymerase thay thế sợi để khuếch đại DNA mục tiêu. RPA có ưu điểm là nhanh, nhạy, đặc hiệu và không cần thiết bị nhiệt độ phức tạp như PCR truyền thống.

  2. Thiết bị vi lưu kỹ thuật số (Digital Microfluidics - DMF): Công nghệ điều khiển giọt chất lỏng trên bề mặt điện cực bằng hiệu ứng điện từ, cho phép thao tác phân phối, tách, trộn mẫu và thuốc thử chính xác, tự động hóa quy trình xét nghiệm. DMF giúp giảm thiểu sai sót do thao tác thủ công, tiết kiệm mẫu và thuốc thử, đồng thời tăng khả năng thực hiện nhiều phản ứng song song.

Các khái niệm chính bao gồm: protein p30 mã hóa bởi gen CP204L là mục tiêu khuếch đại, SYBR Green I dùng để phát hiện màu sắc sản phẩm khuếch đại, Tween-20 hỗ trợ di chuyển giọt trên thiết bị DMF, và giới hạn phát hiện (LOD) là chỉ số quan trọng đánh giá độ nhạy của phương pháp.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Tổng cộng 5 mẫu huyết thanh heo dương tính với ASFV được xác định bằng kỹ thuật Real-time PCR, cùng các mẫu dương tính với CSF, PCV2, PRRS để đánh giá độ đặc hiệu. Mẫu được thu thập từ các trang trại miền Nam Việt Nam và phòng xét nghiệm chuyên ngành.

  • Thiết kế và tối ưu phản ứng RPA: Các đoạn mồi (primer) được thiết kế nhắm vào gen CP204L mã hóa protein p30, với độ dài 30-36 nucleotide, GC% từ 20-70%, sản phẩm khuếch đại 100-200 bp. Phản ứng RPA được tối ưu nhiệt độ ủ (37°C, 39°C, 41°C) và thời gian ủ (15-30 phút). Thể tích phản ứng khảo sát gồm 12,5 µL và 25 µL.

  • Xác định giới hạn phát hiện (LOD): Sử dụng plasmid pGEM-T easy chứa đoạn gen p30 pha loãng theo chuỗi 10 lần để xây dựng đường chuẩn, xác định nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được.

  • Phát hiện màu sắc sản phẩm: SYBR Green I được thử nghiệm ở các nồng độ từ 50X đến 400X, xác định nồng độ tối ưu 300X để quan sát thay đổi màu sắc dưới ánh sáng tử ngoại và mắt thường.

  • Tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị DMF: Thiết kế bảng điện cực gồm 64 điện cực, trong đó 8 giếng điện cực được sử dụng cho phản ứng (4 giếng mẫu, 4 giếng chứa hỗn hợp chính, MgOAc và SYBR Green I). Nồng độ Tween-20 được tối ưu ở 0,1% để hỗ trợ di chuyển giọt mà không ảnh hưởng đến thành phần phản ứng.

  • Phân tích: Sản phẩm RPA được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1,5%, hình ảnh chụp dưới ánh sáng UV. Các phản ứng trên thiết bị DMF được điều khiển bằng vi điều khiển Arduino kết hợp bộ chuyển đổi điện áp HV507.

  • Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 12/2022 đến tháng 9/2023, bao gồm các giai đoạn thu thập mẫu, thiết kế và tối ưu phản ứng, tích hợp trên thiết bị DMF, phân tích và báo cáo kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu cho phản ứng RPA: Nhiệt độ 39°C và thời gian ủ 15 phút được xác định là điều kiện tối ưu, cho sản phẩm khuếch đại rõ ràng trên gel agarose. So với 37°C và 41°C, 39°C cho hiệu suất cao hơn khoảng 15-20% về cường độ băng khuếch đại.

  2. Giới hạn phát hiện (LOD): Phương pháp RPA kết hợp DMF có thể phát hiện tối thiểu 10 bản sao DNA/µL, tương đương với độ nhạy cao, phù hợp cho chẩn đoán sớm vi-rút ASF. So với các phương pháp PCR truyền thống, LOD này tương đương hoặc tốt hơn, đồng thời thời gian phản ứng rút ngắn đáng kể.

  3. Phản ứng thay đổi màu với SYBR Green I: Nồng độ 300X SYBR Green I cho phép quan sát rõ ràng sự thay đổi màu sắc sản phẩm khuếch đại dưới ánh sáng tử ngoại và mắt thường, giúp đơn giản hóa việc đọc kết quả mà không cần thiết bị phức tạp.

  4. Tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị DMF: Thiết kế bảng điện cực cho phép thực hiện năm phản ứng đồng thời, bao gồm một phản ứng chứng âm để kiểm soát nhiễm chéo. Nồng độ Tween-20 0,1% hỗ trợ di chuyển giọt hiệu quả, tăng tốc độ phản ứng mà không làm giảm hiệu suất khuếch đại.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp RPA kết hợp với thiết bị DMF là giải pháp chẩn đoán vi-rút ASF nhanh chóng, nhạy và đặc hiệu. Nhiệt độ 39°C và thời gian 15 phút phù hợp với đặc tính enzyme recombinase, giúp phản ứng diễn ra hiệu quả mà không cần thiết bị gia nhiệt phức tạp. Giới hạn phát hiện 10 bản sao/µL đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm tại trang trại, giúp ngăn chặn dịch bệnh kịp thời.

Việc sử dụng SYBR Green I ở nồng độ 300X làm tăng tính tiện lợi trong đọc kết quả, giảm chi phí và thời gian phân tích. Tích hợp trên thiết bị DMF không chỉ tự động hóa quy trình mà còn giảm thiểu sai sót do thao tác thủ công, đồng thời tiết kiệm mẫu và thuốc thử, thân thiện với môi trường.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này có thời gian phát hiện nhanh hơn nhiều so với PCR truyền thống (15 phút so với 1,5-2 giờ) và độ nhạy tương đương hoặc cao hơn. Việc tích hợp RPA trên DMF là bước tiến quan trọng trong phát triển thiết bị chẩn đoán phân tử tại thực địa, phù hợp với điều kiện trang trại và phòng thí nghiệm cơ sở.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cường độ băng khuếch đại theo nhiệt độ và thời gian, bảng so sánh LOD giữa các phương pháp, hình ảnh thay đổi màu sắc với SYBR Green I và sơ đồ thiết kế bảng điện cực DMF.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai ứng dụng phương pháp RPA-DMF tại các trạm y tế thú y và trang trại: Đào tạo nhân viên sử dụng thiết bị để phát hiện sớm vi-rút ASF, giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Thời gian thực hiện trong vòng 6 tháng đầu sau khi hoàn thiện thiết bị.

  2. Phát triển bộ kit chẩn đoán thương mại dựa trên nền tảng RPA-DMF: Tăng cường sản xuất và phân phối rộng rãi, đảm bảo chi phí hợp lý, dễ sử dụng cho các vùng nông thôn và khu vực có điều kiện hạn chế. Mục tiêu trong 1-2 năm tới.

  3. Nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển công nghệ vi lưu kỹ thuật số: Đầu tư vào nghiên cứu cải tiến thiết bị DMF, mở rộng ứng dụng cho các bệnh truyền nhiễm khác trong chăn nuôi và y tế. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và trường đại học.

  4. Tăng cường hợp tác quốc tế và đào tạo chuyên sâu: Mời chuyên gia, tổ chức hội thảo, chia sẻ kinh nghiệm về kỹ thuật RPA và DMF nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh ASF. Thời gian thực hiện liên tục hàng năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Thú y, Kỹ thuật Y sinh: Nắm bắt công nghệ mới trong chẩn đoán phân tử, áp dụng vào nghiên cứu và phát triển thiết bị y sinh.

  2. Cán bộ thú y và nhân viên phòng thí nghiệm chẩn đoán: Áp dụng phương pháp RPA-DMF để nâng cao hiệu quả phát hiện sớm vi-rút ASF, giảm thiểu sai sót và thời gian chẩn đoán.

  3. Doanh nghiệp sản xuất thiết bị y tế và sinh học phân tử: Tham khảo thiết kế và quy trình tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị DMF để phát triển sản phẩm thương mại.

  4. Cơ quan quản lý ngành chăn nuôi và thú y: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, hướng dẫn kỹ thuật chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh ASF hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phản ứng RPA khác gì so với PCR truyền thống?
    RPA thực hiện ở nhiệt độ thấp (37-42°C) trong thời gian ngắn (15 phút), không cần thiết bị nhiệt độ phức tạp, phù hợp cho chẩn đoán nhanh tại thực địa. PCR cần nhiệt độ cao và thời gian lâu hơn (1,5-2 giờ).

  2. Giới hạn phát hiện của phương pháp RPA-DMF là bao nhiêu?
    Phương pháp có thể phát hiện tối thiểu 10 bản sao DNA/µL, tương đương hoặc nhạy hơn nhiều so với PCR truyền thống, giúp phát hiện sớm vi-rút ASF.

  3. Tại sao sử dụng SYBR Green I trong phản ứng RPA?
    SYBR Green I giúp phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng cách thay đổi màu sắc dưới ánh sáng tử ngoại và mắt thường, đơn giản hóa việc đọc kết quả mà không cần thiết bị phức tạp.

  4. Thiết bị DMF có ưu điểm gì trong chẩn đoán?
    DMF tự động hóa thao tác với giọt chất lỏng, giảm sai sót do thao tác thủ công, tiết kiệm mẫu và thuốc thử, cho phép thực hiện nhiều phản ứng song song, phù hợp với môi trường thực địa.

  5. Phương pháp này có thể áp dụng cho các bệnh khác không?
    Có, nền tảng RPA kết hợp DMF có thể được điều chỉnh để phát hiện nhiều loại mầm bệnh khác nhau trong chăn nuôi và y tế, mở rộng ứng dụng trong tương lai.

Kết luận

  • Đã tối ưu thành công phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt RPA ở 39°C trong 15 phút, phát hiện được 10 bản sao DNA/µL vi-rút ASF.
  • SYBR Green I ở nồng độ 300X cho phép phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng mắt thường và ánh sáng tử ngoại.
  • Thiết kế và tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị vi lưu kỹ thuật số DMF cho phép thực hiện năm phản ứng đồng thời, tăng tính tự động và giảm sai sót.
  • Nồng độ Tween-20 0,1% hỗ trợ di chuyển giọt trên thiết bị DMF mà không ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển thiết bị chẩn đoán nhanh, chính xác, phù hợp với điều kiện thực địa, góp phần kiểm soát hiệu quả dịch bệnh ASF tại Việt Nam.

Hành động tiếp theo: Triển khai ứng dụng thực tế tại các trạm thú y, phát triển bộ kit thương mại và mở rộng nghiên cứu ứng dụng cho các bệnh truyền nhiễm khác. Đề nghị các cơ quan, doanh nghiệp và nhà nghiên cứu phối hợp để đưa công nghệ vào thực tiễn.